WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 |

«ИССЛЕДОВАНИЕ КРЫС OXYS КАК МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

СТЕФАНОВА

Наталья Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ КРЫС OXYS КАК МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ

АЛЬЦГЕЙМЕРА. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ

14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени



доктора биологических наук

Новосибирск –2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, Колосова Наталия Гориславовна

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор биологических наук, Ляхович Вячеслав Валентинович профессор, научный руководитель ФГБНУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики»

доктор биологических наук Онуфриев Михаил Валерьевич ведущий научный сотрудник лаб.

функциональной биохимии нервной системы ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН доктор биологических наук Лоскутова Лилия Владимировна главный научный сотрудник лаб.

экспериментальных моделей патологии когнитивной деятельности ФГБНУ «Научноисследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «____»__________2015 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины» по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул.

Тимакова, 2. Тел. (383) 333- 64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ и на сайте http://centercem.ru/nauchnaya_deyatelnost/dissertacionnyj_sovet/

Автореферат разослан «____»__________2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н. Пальчикова Наталья Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) – самое распространенное нейродегенеративное заболевание, которое становится причиной деменции на фоне атрофических изменений мозга и, в конечном счете, смерти в течение 3-9 лет после установления диагноза (Querfurth, LaFerla, 2010). Эффективных способов профилактики и лечения БА нет, заболеваемость растет по мере увеличения продолжительности жизни и постарения населения развитых и развивающихся стран. По данным ВОЗ, в мире более 35 миллионов человек страдают БА, а к 2050 году, по прогнозам, таких больных будет 115 миллионов (Morley et al., 2012). В этой связи исследования фундаментальных механизмов БАи разработка основанных на их знании способов профилактики и лечения заболевания приобрели особую актуальность.

Согласно доминирующей гипотезе «амилоидного каскада» центральным событием в патогенезе БА становится накопление нейротоксических форм пептида амилоида- (А), приводящее к образованию амилоидных бляшек, гиперфосфорилированию тау-белка и формированию нейрофибриллярных клубков, синаптической недостаточности, гибели нейронов, воспалению, митохондриальной дисфункции и окислительному стрессу (Morley et al., 2012). Однако в последние годы растет количество аргументов в пользу того, что в патогенезе наиболее распространенной спорадической формы БА (~95% всех случаев заболевания) гиперпродукция А не выступает в роли инициирующего фактора (Krstic, Knuesel, 2013). Более того, приводятся убедительные доказательства того, что механизмы патогенеза ранней - наследственной формы - и поздней - спорадической формы БА могут быть различными (Shinohara et al., 2014). Так, если причиной токсического накопления А в мозге больных наследственной формой БА становится нарушение процессинга белка предшественника амилоида- (AРР), то у больных спорадической формой БА накопление А может быть опосредовано синаптическими процессами.

Механизмы старения и патогенез нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА, тесно связаны с митохондриальной дисфункцией и окислительным стрессом – нарушением баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Более того, дисфункция митохондрий рассматривается как один из ключевых факторов, инициирующих развитие БА. Согласно гипотезе «митохондриального каскада»





(Swerdlow, Kahn, 2004), снижение синтеза АТФ и окислительный стресс приводят к чрезмерной продукции A, который, в свою очередь, может напрямую оказывать токсическое действие на митохондрии, усугубляя нейродегенеративные процессы. Запуск «порочного круга» нейродегенерации приводит к гиперфосфорилированию тау-белка, дисфункции синапсов, воспалению, апоптозу и становится маркерным, финальным событием в патогенезе БА.

Снижение клеточных функций при старении и развитии БА сопряжено с изменением экспрессии многочисленных генов. Обнаружение мутаций генов APP, PSEN1 и PSEN2 определило значительный успех в изучении патогенеза наследственной формы БА, на которую приходится около 5% всех случаев заболевания. Несмотря на выявленные ассоциации с полиморфизмами в ряде генов, конкретные молекулярно-генетические механизмы развития спорадической формы БА, перехода физиологических возрастных изменений мозга в патологический процесс, остаются не ясными. Такая ситуация обусловлена невозможностью исследовать эти вопросы на людях, тем более – ранние доклинические стадии развития БА, а также отсутствием адекватных биологических моделей заболевания. Лавинообразно нарастает количество генетических моделей БА, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход приближает к пониманию вклада конкретного гена в развитие наследственной формы БА, но не воспроизводит все фенотипические проявления спорадической формы БА - комплексного заболевания полигенной природы.

Степень разработанности проблемы. Уникальной генетической моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний является линия крыс OXYS, созданная в ИЦиГ СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы. В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор вели по ранней спонтанной катаракте, сцепленно с которой животные унаследовали комплекс признаков преждевременного старения, в том числе - ускоренное старение мозга (Kolosova et al., 2009; Колосова и др., 2014; Stefanova et al., 2010). На фенотипическом уровне оно проявляется формированием уже к возрасту 3 мес. пассивного типа поведения, повышенной тревожности, нарушением способности к обучению на фоне нейродегенеративных изменений, выявленных методами магниторезонансной томографии (Колосова и др., 2011). О снижении когнитивных функций у молодых крыс OXYS свидетельствует и нарушение формирования длительной посттетанической потенциации (Береговой и др., 2011). Механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS остаются неясными, но комплексное проявление признаков преждевременного старения и развитие возрастзависимых заболеваний уже в молодом возрасте предполагает общие молекулярно-генетические основы. Методом QTL-анализа были выявлены локусы, ассоциированные с развитием у крыс OXYS катаракты, ретинопатии и особенностей поведения (Korbolina et al., 2012). Функциональная аннотация локусов выявила «обогащение» района генами, связанными с нейродегенерацией, в том числе – с метаболическим путем БА. Это обстоятельство наряду с характерными для крыс OXYS фенотипическими проявлениями послужило основанием для изучения в настоящей работе механизмов ускоренного старения мозга этих животных и анализа возможной их связи с патогенезом БА. Их знание является необходимым условием доказательства соответствия линии критериям модели спорадической формы БА и перспективности ее использования для исследования патогенеза заболевания и поиска новых терапевтических мишеней для профилактики БА. Как перспективный нейропротектор, потенциально способный влиять на «горячие точки» патогенеза БА, нами был исследован антиоксидант пластохинонилдецил-трифенилфосфоний (SkQ1, «ионы Скулачева»), эффективность которого доказана в профилактике и лечении целого ряда ассоциированных со старением заболеваний (Бакеева и др., 2008; Нероев и др., 2008; Vays et al., 2014).

Цель исследования – изучить механизмы ускоренного старения мозга крыс OXYS, их возможную связь с патогенезом болезни Альцгеймера и оценить эффекты антиоксиданта SkQ1 на некоторые функции мозга у этих животных.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить связь манифестации фенотипических проявлений ускоренного старения мозга крыс OXYS (поведенческих, нарушения способности к обучению и памяти) с изменениями структурно-функциональных параметров пирамидных нейронов и синапсов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга.

2. Определить уровень и локализацию маркеров болезни Альцгеймера в гиппокампе и префронтальной коре крыс OXYS и Вистар (контроль) разного возраста: A пептида, его предшественника белка АРР, тау-белка и его фосфорилированной формы.

3. Провести сравнительное ультраструктурное исследование гиппокампа крыс OXYS и Вистар разного возраста, определить активность цитохром с оксидазы как маркера активности IV комплекса дыхательной цепи для оценки вклада изменений структурнофункционального состояния митохондрий мозга в развитие нейродегенеративных изменений.

4. Исследовать методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) изменения транскриптома префронтальной коры мозга крыс OXYS и Вистар с возрастом и определить межлинейные различия в экспрессии генов.

5. Провести функциональную аннотацию дифференциально экспрессирующихся генов и выявить вероятные метаболические пути, с изменениями которых ассоциировано ускоренное старение мозга крыс OXYS.

6. Исследовать влияние приема антиоксиданта SkQ1 на развитие и прогрессию нейродегенеративных процессов у крыс OXYS.

Научная новизна. Впервые установлено, что ускоренное старение мозга крыс OXYS ассоциировано с развитием ключевых патогенетических и «клинических» признаков спорадической формы БА. Показано, что формирование пассивного типа поведения, повышенной тревожности и снижение способности к обучению у крыс OXYS к возрасту 3-4 мес. по времени совпадает с развитием в гиппокампе и префронтальной коре деструктивных изменений нейронов, синаптической недостаточности, дисфункции митохондрий и гиперфосфорилирования тау-белка. Нарушения поведения и когнитивных способностей у крыс OXYS с возрастом усиливаются на фоне прогрессии деструктивных изменений нейронов и их гибели, снижения плотности синапсов и активных зон их контактов, дисфункции митохондрий, гиперфосфорилирования тау-белка, повышения к возрасту 12 мес. уровня A1-42 в гиппокампе и префронтальной коре и образования амилоидных бляшек в мозге. При этом усиленное накопление A в мозге с возрастом становится вторичным событием при развитии у крыс OXYS признаков БА.

Впервые методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq) исследован профиль экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS. На основании сравнения транскриптома коры мозга крыс Вистар и OXYS разного возраста определены гены, экспрессия которых изменяется с возрастом и при развитии признаков БА у крыс OXYS.

Установлено, что развитие признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия – более 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. С возрастом в префронтальной коре крыс Вистар изменяется экспрессия 499 генов, в то время как у крыс OXYS – более чем 5500 генов, включая 333 гена, общих для крыс OXYS и Вистар. Функциональная аннотация изменения экспрессии генов в префронтальной коре крыс OXYS с возрастом выявила их «обогащение» 85 генами из метаболического пути БА, связанными с процессингом АРР, агрегацией и деградацией A, регуляцией тау-белка, функциями митохондрий, синаптическими процессами.

Впервые установлено, что способность антиоксиданта SkQ1 не только предупреждать и замедлять формирование фенотипических проявлений ускоренного старения мозга (нарушения поведения и снижение когнитивных функций), но и снижать их выраженность на стадии активной прогрессии у крыс OXYS связана с его влиянием на ключевые признаки БА. Показано, что SkQ1 предупреждает и/или замедляет деструктивные изменения нейронов, снижение плотности синапсов, гиперфосфорилирование тау-белка и усиленное накопление A в мозге крыс OXYS, существенно улучшая структурнофункциональные параметры митохондрий.

Теоретическая и практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера, возможности её использования для исследования этиологии и патогенеза связанных с заболеванием нейродегенеративных процессов, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику возрастных нарушений функций мозга и развития БА. Выявленные в работе эффекты SkQ1 на крысах OXYS и Вистар демонстрируют высокий нейропротекторный потенциал антиоксиданта, перспективность его использования в профилактике старения мозга и развития характерных для болезни Альцгеймера нейродегенеративных процессов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Линия крыс OXYS соответствует основным критериям модели спорадической формы болезни Альцгеймера и может быть рекомендована для исследований этиологии и патогенеза этого заболевания, а также для изучения эффективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику.

2. Развитие патогенетических признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS происходит на фоне изменения уровня мРНК более 900 генов, их прогрессия - более чем 2000 генов, основная часть которых связана с нейрональной пластичностью, фосфорилированием белка, Са2+ гомеостазом, гипоксией, иммунными процессами и апоптозом. Как и у людей с болезни Альцгеймера, развитие признаков заболевания у крыс OXYS ассоциировано с изменением в префронтальной коре мозга активности метаболического пути болезни Альцгеймера – экспрессии 85 вовлеченных в него генов.

3. Антиоксидант SkQ1 способен замедлять развитие и снижать выраженность ключевых признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS, существенно снижая выраженность деструктивных изменений митохондрий мозга.

Апробация результатов. Результаты, полученные при выполнении диссертационного исследования, представлены и обсуждены на: 2-ой Международной конференции «Homo sapiens liberatus» (Москва, 2015), 9th International Conference on

Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/System Biology (BGRS\SB-2014:

Новосибирск, 2014), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014), 11th International Conference AD/PD (Флоренция, Италия, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, Чехия, 2013), FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2012, 2013), 2nd international conference «Genetics of Aging and Longevity» (Москва, 2012), 7-м Сибирском физиологическом съезде (Красноярск, 2012), III съезде геронтологов и гериатров России (Новосибирск, 2012), III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Postgenome-2012: Казань, 2012), 8th FENS Forum of Neuroscience (Барселона, Испания, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 534 источника (из них 29 отечественных и 505 иностранных). Работа изложена на 262 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 59 рисунков и 2 приложения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе ЦКП «Генофонды экспериментальных животных» ИЦиГ СО РАН на крысах-самцах линий OXYS и Вистар в возрасте от 20 дней до 24 мес. в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных».

Профилактический прием SkQ1 (250 нмоль/кг массы тела 6 раз в неделю) оценивали на крысах OXYS и Вистар (n=30) с возраста 1,5 до 23 мес. В 3 мес. исследовали поведение, а в 4 мес. часть крыс (n=15) - забита для гистологических и молекулярных исследований. В 13-15 мес. оценивали поведение крыс. В 23 мес. оставшиеся крысы (n=12-15) забиты для молекулярных исследований. Лечебный прием (250 нмоль/кг 6 раз в неделю) оценивали на крысах OXYS и Вистар (n=20-25) с возраста 12 до 18 мес.

Исследование поведения крыс проводили в стандартных тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» (моторно-исследовательская активность, тревожность), «восьмирукавный радиальный лабиринт» и водный тест Морриса (способность к обучению, память).

Методы гистологического исследования. Мозг фиксировали в 10% р-ре формалина на фосфатном буфере (PBS), pH 7.4 (24 ч), обезвоживали в спиртах, заливали в парафин.

Сагиттальные срезы мозга (5 мкм) окрашивали 0,1% крезиловым фиолетовым. В СА1, СА3, зубчатой извилине гиппокампа подсчитывали нейроны с очаговым, тотальным хроматолизом, гиперхромные сморщенные нейроны, гиперхромные без сморщивания.

Данный фрагмент работы выполнен с участием аспиранта кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России К.Ю. Максимовой.

Методы электронно-микроскопического исследования. Кусочки гиппокампов фиксировали в р-ре параформальдегида (4%) и глютаральдегида (0,5%) на основе 0,2 М какодилатного буфера (рН 7,4); постфиксировали в 2% р-ре четырехокиси осмия на холоде (3 ч), обезвоживали в спиртах, ацетоне, пропиленоксиде и заливали в эпон-812.

Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие серебристые и бледно-золотистые срезы наносили на сетки-подложки, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. С помощью сетки Автандилова определяли удельную площадь органелл в нейронах (в % от общей площади цитоплазмы). Для оценки плотности синапсов (плоских, положительно и отрицательно искривленных, гипертрофированных и перфорированных) фотографировали по 15 полей зрения (50 мкм2) пирамидного слоя СА1 поля с 5 срезов. Разделяли синапсы по длине активной зоны контакта на очень мелкие (100-200 нм), мелкие (200-300 нм), средние (300-500 нм), крупные (500-700 нм) и очень крупные ( 700 нм). Данный фрагмент работы выполнен с участием аспиранта кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России К.Ю.

Максимовой и ведущего научного сотрудника лаборатории морфологии и функции клеточных структур ИЦиГ СО РАН к.б.н. Е.В. Киселевой.

Иммуногистохимические методы. Мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS, pH 7.4 (48 ч), затем - в 30% р-ре сахарозы (~ 48 ч) при 4°C и хранили при 80°C.

Сагиттальные срезы мозга (20 µm) изготавливали в криостате при -20°C. Срезы монтировали на предметные стекла, инкубировали с первичными антителами к Synapsin I, PSD95, A1-42, АРР, Tau, Tau [T181] (Аbcam, США) при +4°C (16 ч) и со вторичными антителами (1 ч), промывали в PBS, наносили монтирующую среду с DAPI для окрашивания ядер. Препараты анализировали с помощью оптического микроскопа AXIOPLAN 2 (Zeiss, Германия).

Исследования методами вестерн-блот анализа, дот-блот анализа и иммунноферментного анализа. Гиппокампы и префронтальную кору выделяли на льду, хранили при - 80оС. Белок выделяли лизирующим буфером (50 мM Tris-HCl pH 7.4; 150 мM NaCl;

Загрузка...

1% Triton x-100; 1% Sodium deoxycholate; 0.1% SDS; 1 мM EDTA, ингибиторы протеаз) в соотношении 1/4. Для саркозил-растворимой и нерастворимой фракций образцы гомогенизировали в буфере (100 мМ MES pH 6.8; 750 мМ NaCl; 1 мМ EGTA; 0,5 мМ MgSO4; 1 М дитиотреитола, ингибиторы протеаз), центрифугировали (11000 g, 20 мин).

Супернатант центрифугировали (100000 g, 1 ч). Осадок инкубировали в 1% р-ре саркозила (30 мин), центрифугировали (100000 g, 30 мин). Нерастворимый осадок ресуспензировали в буфере для экстракции (10 мМ Tris-HCl pH 7.4; 10% сахарозы; 850 мМ NaCl; 1 мМ EGTA) в соотношении 1/10, центрифугировали (15000 g, 20 мин). Супернатанты инкубировали в 1% р-ре саркозила (1 ч), центрифугировали (100000 g, 45 мин). Осадки (саркозил-нерастворимые белки) ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl рН 7.4.

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда. Белки разделяли электрофорезом в 10-12% ПААГ в трис-глициновом буфере (25 мM Tris, 190 мM глицин, 0,1% SDS), переносили на нитроцелюлозную мембрану. После блокирования 5% обезжиренным молоком (1 ч), мембраны инкубировали 1 ч с первичными антителами к Synapsin I, PSD95, Actin (Аbcam, США), MOAB-2 (Millipore, США) или 16 ч - к A1-42, АРР, Tau, Tau [T181] (Аbcam, США) и 30 мин - со вторичными антителами (Аbcam, США). Интенсивность свечения оценивали с помощью ImageJ. Содержание А оценивали иммуноферментным анализом (ИФА), используя наборы human/rat A (1-42) и A (1-40) ELISA kit Wako (Wako, Япония). Данный фрагмент работы выполнен с участием научного сотрудника сектора молекулярных механизмов старения ИЦиГ СО РАН к.б.н. Н.А. Муралевой.

Исследование активности фермента цитохром-С оксидазы. Образцы ткани в буфере (250 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 70мМ KCl в PBS, ингибиторы протеаз) гомогенизировали, центрифугировали (800 g, 10 мин). Супернатант центрифугировали (15000 g, 20 мин), осадок (митохондриальная фракция) ресуспендировали в буфере (50 мМ Tris рН 7.4, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0,2% Triton-X, 0,3% NP-40), хранили при 80°C. Активность цитохром с оксидазы определяли набором Complex IV Assay Kit (Abcam, США) согласно протоколу производителя. Данный фрагмент работы выполнен с участием научного сотрудника сектора молекулярных механизмов старения ИЦиГ СО РАН к.б.н. Н.А. Муралевой.

Исследование методом массового параллельного секвенирования (RNA-seq). RNA-seq проводили на крысах OXYS и Вистар в возрасте 5 и 18 мес. Приготовление кДНК библиотек и секвенирование на платформе Illumina Genome Analyzer IIx проведено в соответствии с протоколами Illumina для RNA-seq (ОАО «Геноаналитика»). Для каждого образца было получено ~40 млн прочтений (ридов) длиной 50 нуклеотидов. Риды картировали на референсный геном Rattus norvegicus (версии Rnor_5.0.76) с помощью программы TopHat (v2.0.10) (Trapnell et al., 2012). Функциональную аннотацию групп ДЭГ проводили с помощью Web-инструмента DAVID и WebGestalt при порогах значимости обогащения (EASE) p0.05.

Данный фрагмент работы выполнен с участием ОАО «Геноаналитика» и научного сотрудника сектора молекулярно-генетических механизмов белок-нуклеиновых взаимодействий ИЦиГ СО РАН к.б.н. Н.И. Ершовым.

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0.

Использовали факторный дисперсионный анализ (ANOVA) с post-hoc сравнениями групповых средних (Newman-Keul test). Как независимые факторы рассматривали генотип, возраст, препарат. Данные представлены как mean ± SEM. Результаты считали статистически значимыми при р0.05.

РАЗВИТИЕ КЛЮЧЕВЫХ ПРИЗНАКОВ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

У КРЫС OXYS

Нарушения поведения и памяти у крыс OXYS. Ранние проявления БА:

эмоциональные изменения, нарушения памяти на недавние события, трудности в запоминании информации, по сути, не отличаются от характерных для стареющих людей и животных изменений (de Calignon et al., 2012). Прогрессия БА сопровождается двигательными нарушениями и значительным ухудшением памяти. Изменения с возрастом поведения и способности к обучению крыс OXYS и Вистар (контроль) в настоящем исследовании оценивали в возрасте 1, 4 и 18 мес.

Моторно-исследовательская активность в тесте «открытое поле» - количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек - с возрастом снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS скорость этих изменений выше. В результате в возрасте 4 и 18 мес. количество пересеченных квадратов и стоек у них меньше, чем у крыс Вистар, а показатели тревожности - латентный период выхода в центр и количество дефекаций – напротив, были выше.

В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» активность крыс OXYS и Вистар с возрастом также снижалась: количество выходов в центр, вертикальных стоек и заходов в закрытые рукава уменьшалось. Тревожность, напротив, росла: количество выходов в открытые рукава и время, проведенное в них, снижалось, а количество дефекаций росло.

При этом в возрасте 4 и 18 мес. количество заходов в закрытые и выходов в открытые рукава, стоек и выглядываний у крыс OXYS было меньше, чем у Вистар, что свидетельствует о более высоком уровне тревожности и сниженной активности.

Оценка референтной памяти – способности к обучению в восьмирукавном лабиринте

– показала, что уже в возрасте 4 мес. у крыс OXYS она ниже, чем у крыс Вистар. Об этом свидетельствует увеличенный процент ошибки памяти - отношения числа входов в неподкрепляемые рукава к общему числу посещенных рукавов (%) - в первые семь дней обучения. Но к 8 -10 дню обучения крысы OXYS запоминали рукава с кормом и меньше входили в рукава без него. К 18 мес. нарушение способности к обучению у крыс OXYS нарастало: процент ошибок во все дни тестирования у них был больше, чем у крыс Вистар. Количество входов в рукава (моторно-исследовательская активность) было меньше у 4- и 18-мес. крыс OXYS во все дни обучения.

В водном тесте Морриса референтную память крыс OXYS и Вистар оценивали в возрасте 4, 12 и 18 мес. У крыс Вистар способность к обучению с возрастом не менялась, а у крыс OXYS снижалась и в 18 мес. они обучались существенно хуже, чем крысы Вистар (рис. 1). При этом только в первые три дня на нахождение невидимой платформы крысы OXYS затрачивали больше времени, чем крысы Вистар, а на 4-й и 5-й день обучения они уже не отличались от крыс Вистар по такому показателю, как латентный период нахождения невидимой платформы. Оценка формирования памяти по такому показателю как время, проведенное в целевом секторе лабиринта, где в дни обучения находилась платформа, показала, что 18-мес. крысы OXYS проводили вдвое меньше времени, чем крысы Вистар (см. рис. 1).

Рис. 1. Способность к обучению и формирование памяти в водном тесте Морриса у крыс Вистар и OXYS разного возраста. Латентный период (ЛП) нахождения невидимой платформы крысами Вистар (А) и OXYS (Б) и время, проведенное в секторе (В). *достоверные различия по сравнению с 4-мес. крысами OXYS, # - межлинейные различия.

Таким образом, с возрастом уровень тревожности растет, а моторноисследовательская активность, способность к обучению и память снижается у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Различия между крысами OXYS и Вистар появились к возрасту 4 мес., а к 18 мес. усилились.

Синаптическая недостаточность и нейродегенеративные изменения в мозге крыс OXYS. Синаптическая недостаточность и гибель нейронов - наиболее ранние события при развитии БА. Изменение с возрастом популяции пирамидных нейронов СА1 и СА3 полей гиппокампа и зубчатой извилины крыс OXYS и Вистар оценивали в возрасте 20 дней, 5 и 15 мес. Максимальной популяция нейронов крыс OXYS и Вистар была в 20 дней, при этом межлинейные различия в их количестве отсутствовали. К возрасту 5 мес. количество нейронов в СА1 и СА3 снижалось ~втрое у крыс обеих линий, в зубчатой извилине – только у крыс Вистар (на 15%). В 5 мес. у крыс OXYS плотность нейронов в гиппокампе была выше, а к 15 мес. - снижалась: в СА1 – на 26%, в СА3 – на 49% и в зубчатой извилине – на 21%, и была ниже, чем у крыс Вистар. У крыс Вистар с возраста 5 до 15 мес. плотность нейронов в СА3 снижалась на 20%, а в СА1 и зубчатой извилине, напротив, увеличилась на 18% и 20%, соответственно. Таким образом, у крыс OXYS в возрасте 5 мес., а у крыс Вистар – в 15 мес. в гиппокампе присутствуют признаки усиления нейрогенеза, которые могут рассматриваться как компенсаторная реакция: в этом возрасте у животных соответствующих линий выявляются признаки умеренных когнитивных нарушений на фоне деструктивных изменений нейронов, исследованию которых посвящен следующий раздел работы.

Исследование цитоархитектоники гиппокампа и префронтальной коры мозга месячных крыс OXYS и Вистар не выявило различий в относительном количестве нейронов с признаками деструкции. В возрасте 4 мес. количество нейронов с признаками дегенерации: обратимо измененных - гиперхромных нейронов без сморщивания и с признаками очагового хроматолиза, а также необратимо измененных - гиперхромных сморщенных и нейронов с признаками тотального хроматолиза, - в гиппокампе и коре мозга крыс OXYS было больше, чем у крыс Вистар. К возрасту 18 мес. различия нарастали (рис. 2).

В возрасте 4 мес. у крыс OXYS значительно изменена структурная организация органелл нейронов СА1 поля. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭПР) изогнуты, фрагментированы, выявляются участки с расширенными цистернами, лишенными свободных единичных рибосом и полисом - типичной картины тотального хроматолиза. Митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму – признаки, указывающие на их набухание. В отдельных областях ядерной мембраны число пор увеличено, перинуклеарное пространство расширено. В некоторых нейронах определяются участки скопления липофусцина.

Рис. 2. (А) Удельное содержание нейронов с дегенеративными (обратимыми и необратимыми) изменениями в префронтальной коре и гиппокампе крыс Вистар и OXYS в 4 и 18 мес. ЗИ – зубчатая извилина. (Б) Примеры пирамидных нейронов коры мозга крыс (стрелки - гиперхромные нейроны). Увелич. - об. 100, ок. 10. * - межлинейные различия.

К 18 мес. изменения структурной организации органелл у крыс OXYS прогрессируют.

Оболочка ядра многих нейронов образует глубокие складки, увеличивается число ядерных пор, отек ядерной мембраны. Встречается гипертрофия ядрышек, увеличение в них гранулярного компонента. В комплексе Гольджи отмечается расширение и фрагментация цистерн. Лизосомы имеют различную величину, интенсивно и гомогенно прокрашены. Во многих нейронах отмечаются вакуоли, фаголизосомы различных размеров и формы (рис. 3). В 4 мес. в нейронах СА1 крыс OXYS удельная площадь митохондрий и ЭПР меньше, а площадь вакуолей и лизосом больше, чем у крыс Вистар. К 18 мес. разница нарастает: площадь митохондрий становится в 3, а ЭПР – в 2,5 раза меньше, площадь лизосом и вакуолей - в 1,4 и 2 раза больше, чем у крыс Вистар. Площадь комплекса Гольджи с возрастом снижается у крыс обеих линий.

Рис. 3. Пирамидные нейроны гиппокампа крысы Вистар (А) и крыс OXYS (Б, В) в 18 мес.

(Б) Гипертрофия и усложнение формы ядра с инвагинацией ядерной оболочки (1), смещение ядрышка на периферию ядра (2). (В) Высокое содержание липофусцина (1).

Как показал анализ синаптоархитектоники в СА1 поле, в возрасте 4 мес. плотность синапсов у крыс OXYS на 21% выше, чем у Вистар за счет увеличения доли симметричных (функционально незрелых) синапсов (табл. 1), что может быть связано с увеличением популяции нейронов - адаптивно-компенсаторной реакции на развитие нейродегенеративных процессов. У крыс Вистар в 4 мес. преобладали неперфорированные плоские (40%) и положительно искривленные (39%) синапсы, т.е.

основная популяция синапсов имела умеренную эффективность передачи импульса. Для крыс OXYS этого возраста характерны проявления гиперактивного функционального состояния синапсов: увеличение доли положительно искривленных (в стадии экзоцитоза) контактов, вдвое - перфорированных и гипертрофированных и снижение, более чем вдвое, отрицательно искривленных контактов (в стадии эндоцитоза).

Таблица 1 Численная плотность межнейронных синапсов поля СА1 гиппокампа (на 100 мкм2) Численная Возраст

–  –  –

(см. табл. 1). Но при этом у крыс Вистар увеличилась доля положительно искривленных контактов, что свидетельствует об устойчивом активном состоянии синапсов. К 18 мес. у крыс OXYS происходят изменения, свидетельствующие о снижении эффективности передачи сигнала. Плотность синапсов снижается на 40% за счет уменьшения доли ассиметричных (функционально зрелых) синапсов: количество отрицательно и положительно искривленных контактов снижается более чем вдвое (см. табл. 1), снижается и количество активных зон контакта. Также уменьшается количество синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, выявляются признаки дезорганизации синаптических везикул (рис. 4). Такие прогрессивные изменения с возрастом синаптоархитектоники нейронов гиппокампа свидетельствуют о нарушении у крыс OXYS синаптической пластичности.

Рис. 4. Примеры активных зон синаптического контакта в гиппокампе 18-мес. крыс Вистар (А) и варианты признаков дезорганизации синаптических везикул у крыс OXYS (Б): уменьшение числа синаптических пузырьков, стыкованных с пресинаптической мембраной, скопления большими группами вблизи от мембраны.

Важным звеном регуляции синаптической пластичности являются основной белок постсинаптического уплотнения PSD-95 и синапсин I – фибриллярный фосфопротеин, участвующий в регуляции процесса выброса нейромедиаторов. Снижение уровня этих пре- и постсинаптических белков в мозге больных БА рассматривается как маркерное событие (Gylys et al., 2004). Исследование на 3-, 12- и 24-мес. крысах показало, что с возрастом уровень синапсина I и PSD-95 снижался у крыс обеих линий и был у крыс OXYS ниже, чем у Вистар в гиппокампе - во всех возрастных группах, в префронтальной коре – в возрасте 12 и 24 мес. (рис. 5).

Рис. 5. Уровень PSD-95 и синапсина I в гиппокампе (А, В, Д) и префронтальной коре (Б, Г, Е) крыс OXYS и Вистар в возрасте 3, 12 и 24 мес. (вестерн-блот анализ). (Ж) Иммуногистохимическое окрашивание препаратов мозга 18-мес. крыс OXYS и Вистар специфичными антителами к PSD-95 (зеленый) и синапсину I (красный). DAPI (синий) – ядра. Масштаб – 5 m. * - межлинейные различия, # - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

В целом анализ состояния нейронов и синапсов гиппокампа и коры мозга крыс OXYS разного возраста свидетельствует о том, что ускоренное строение их мозга – изменение поведенческого стереотипа и снижение способности к обучению – происходит на фоне нейродегенеративных изменений и нарушения функциональной активности синапсов.

Такие результаты, а также обогащение ассоциированных с формированием пассивного типа поведения локусов на 1 хромосоме крыс OXYS генами, связанными с метаболическим путем БА (Korbolina et al., 2012), позволили предположить, что ускоренное старение мозга крыс OXYS может быть связано с нарушением процессинга АРР. Об этом свидетельствуют и накопление A в сетчатке крыс OXYS и изменение в ней с возрастом экспрессии генов, связанных с процессингом АРР (Kozhevnikova et al., 2013).

Накопление A пептида с возрастом и его локализация в мозге крыс OXYS.

Накопление A – ключевого маркера БА - обусловлено нарушением баланса между его секрецией и клиренсом в результате изменения процессинга АРР (Mawuenyega et al., 2010). В возрасте 3 мес. уровень АРР в гиппокампе и коре у крыс Вистар и OXYS не различался. С возрастом он увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS значительнее (рис. 6) и в возрасте 13 и 23 мес. уровень АРР в гиппокампе и коре был выше, чем у крыс Вистар.

Рис. 6. Уровень АРР в гиппокампе (А) и префронтальной коре (Б) крыс OXYS (о), выше чем у крыс Вистар (в) в 13 и 23 мес. по данным вестерн-блот анализа. #

- межлинейные различия, ^достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

В результате расщепления APP - и -секретазами образуются естественные продукты метаболизма АРР – A пептиды длиной 36-43 аминокислоты (Querfurth and LaFerla, 2010).

Преобладают пептиды A1–40, а доля наиболее токсичного A1–42 составляет 5–10%. Мы оценили в гиппокампе и коре крыс разного возраста содержание растворимой фракции A1–42 и A1–40 методами ИФА (табл. 2). Повышенное отношение A42/A40 рассматривается как объективный диагностический показатель БА (Wolfe, 2007). В возрасте 3 мес. уровень A1–42 в гиппокампе и коре не различался у крыс Вистар и OXYS.

Таблица 2 Уровень A1-40 и A1-42 в гиппокампе и коре мозга крыс OXYS и Вистар разного возраста Гиппокамп (n=6-8) Префронтальная кора (n=6-8) Возраст Линия

–  –  –

72,9±4,0+ 142,4±10,0*+ 2,0±0,2*+ 77,6±4,6+ 176,9±12,5*+ 2,3±0,3*+ Различия достоверны: *– по сравнению с крысами Вистар; # – между 3 и 12 мес. одной линии; – между 12 и 24 мес. одной линии; + – между 3 и 24 мес. одной линии.

–  –  –

Гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе и префронтальной коре головного мозга крыс OXYS. Не менее важным, чем накопление A, маркером БА является повышение уровня тау-белка и его усиленное фосфорилирование. В гиппокампе и коре крыс OXYS уровень тау-белка и его фосфорилированной формы Т181 (фосфоT181) увеличивался с возрастом и был выше в 3, 13 и 23 мес., чем у крыс Вистар (рис. 8).

Уровень растворимой фракции тау-белка у крыс OXYS также увеличивался с возрастом. Пропорция нерастворимой фракции тау-белка была выше у 3-, 12- и 24-мес.

крыс OXYS. Уровень растворимой фракции фосфо-Т181 в гиппокампе крыс OXYS был ниже в возрасте 3 мес., а нерастворимой фракции - выше в 3, 12 и 24 мес., чем у крыс Вистар. Важно, что пропорция нерастворимой фракции фосфо-Т181 3-, 12- и 24-мес. крыс OXYS была выше, чем у крыс Вистар.

С возрастом показатель увеличивался у крыс обеих линий, но у крыс OXYS ускоренными темпами. Таким образом, уровень тау-белка и его фосфорилированной формы в мозге крыс OXYS выше, чем у крыс Вистар уже в возрасте 3 мес.

Рис. 8. Уровень тау-белка (A-Г) и фосфо-Т181 (А, Б, Д, Е) в префронтальной коре и гиппокампе крыс OXYS (о) выше, чем у крыс Вистар (в) в возрасте 3, 13 и 23 мес. # достоверные межлинейные различия, ^ - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом одной линии.

Дисфункция митохондрий в мозге крыс OXYS при развитии признаков болезни Альцгеймера. Как один из ключевых факторов, инициирующих развитие БА, рассматривается дисфункция митохондрий (Swerdlow et al., 2014). Нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий ранее были выявлены в печени, сетчатке, мышцах и миокарде крыс OXYS (Колосова и др., 2014) и рассматриваются как один из ключевых факторов их преждевременного старения. В настоящей работе установлено, что уже в возрасте 4 мес. в нейронах СА1 поля гиппокампа крыс OXYS присутствуют значительные изменения структурной организации митохондриального аппарата: снижена удельная площадь митохондрий, часть из них имеет светлый обводненный матрикс и округлую форму – признаки набухания, выявляются митохондрии гантелевидной или сферической формы с частичной фрагментацией крист (рис. 9).

–  –  –

Рис. 12. Динамика развития характерной для БА патологии у крыс OXYS. В поле СА1 гиппокампа с возраста 20 дней до 12 мес. происходит 50%-е уменьшение числа нейронов. С 3 до 23 мес. в гиппокампе содержание фосфорилированного тау белка увеличивается на 102%, а A1-42 - на 333%.

АНАЛИЗ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМА ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ

КОРЫ КРЫС OXYS И ВИСТАР

Анализ изменений транскриптома, предшествующих и сопутствующих фенотипическим проявлениям старения и развитию связанных с ним заболеваний, продуктивный подход к поиску молекулярных мишеней - генов, вовлеченных в их этиологию и патогенез. Выясняя природу развития признаков БА у крыс OXYS, мы исследовали транскриптом префронтальной коры их мозга на разных стадиях заболевания (в возрасте 5 и 18 мес.) методом массового параллельного секвенирования.

Анализ данных секвенирования транскриптома (RNA-seq). Количество картированных прочтений (ридов) и дифференциальную экспрессию оценивали программными пакетами HTSeq/DESeq и HTSeq/DESeq2. Для DESeq количественной мерой экспрессии гена является сумма всех однозначно выравненных прочтений, которые пересекаются с геном. При заданной глубине секвенирования в коре крыс экспрессируется: согласно DESeq ~15 200 и ~21 200 генов – согласно DESeq2. При этом перекрытие списков экспрессирующихся генов составило 100%, поэтому для дальнейшего анализа транскриптома использовали данные DESeq2. Максимальное количество ридов равнялось 2 687 083, среднее значение уровня экспрессии по всем детектированным генам

- 1 422 рида.

Выявлены межлинейные различия в экспрессии более 2000 генов (при р0.01). В возрасте 5 мес. экспрессия 923 генов в коре крыс OXYS отличалась от таковой у крыс Вистар: 537-х генов - повышена и 386 - снижена. К возрасту 18 мес. количество дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) в коре крыс OXYS и Вистар выросло вдвое – до 2103. Экспрессия 1156 генов была повышена и 947 - снижена (рис. 13).

Межлинейные различия в экспрессии для 309 генов сохранялись в обеих возрастных группах: у 168 генов она была повышена, у 141 - снижена.

Рис. 13. Диаграммы Венна для ДЭГ. (А) Количество генов в коре крыс OXYS со сниженным и повышенным, по сравнению с крысами Вистар, уровнем мРНК в 5 и 18 мес.

и пересечения между группами генов. (Б) Количество генов, снизивших и повысивших уровень мРНК с возрастом у крыс OXYS и Вистар, и пересечения между группами генов.

Функциональный анализ обогащения транскриптома коры терминами генных онтологий показал, что и в 5, и 18 мес. у крыс OXYS повышен уровень экспрессии генов, ассоциированных с ответом на циклические органические соединения, регуляцией размера кровеносных сосудов и вазодилатации, ответом на эндогенные стимулы, с аутофагией. Независимо от возраста среди генов со сниженным уровнем мРНК в коре крыс OXYS присутствовали ассоциированные с процессингом фагосомы, эндоцитозом, клеточной адгезией, главным комплексом гистосовместимости, каталитической активностью, иммунным ответом и структурной организацией миелиновых волокон.

С возрастом в коре крыс Вистар изменилась экспрессия 499 генов: 293 - повысилась, 206 - снизилась (см. рис. 13). У крыс OXYS изменилась экспрессия 5606 генов: экспрессия 2985 - повысилась и 2621 – снизилась. При этом у крыс обеих линий с возрастом однонаправлено изменили экспрессию всего 333 гена: 191 ген ее повысил, 142 гена – снизили.

Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов. На рис. 14 представлены термины генных онтологий (Gene Ontology), для которых выявлены значимые изменения экспрессии генов с возрастом у крыс Вистар и при развитии признаков БА у крыс OXYS.

Несмотря на межлинейные различия в наборе генов, экспрессия которых изменяется с возрастом, они объединяются в сходные категории:

фосфорилирование, активность протеинкиназ, нейрогенез, синаптическая пластичность, воспаление. У крыс Вистар с возрастом снижается экспрессия генов, участвующих в развитии нейрона (Nrep, Slitrk3, Lppr4, Pvrl1, Robo2 и др.), активности протеинкиназ (Met, Kit, Trib2, Epha3, Acvr1c, Ntrk3 и др.). К 18 мес. у крыс Вистар повышается экспрессия генов, связанных с воспалительным ответом (C1qa, Cyba, C4b, C3 и др.), глиогенезом (Sox10, Gsn, Nkx6-2 и др.), ответом на повреждение (Tf, Gfap, Ass1, Plek, Cst3, Itgb2 и др.).

Рис. 14. Значимые термины генных онтологий (Gene Ontology), объединяющие гены, экспрессия которых изменяется с возрастом в коре мозга крыс OXYS и Вистар (p0.05).

У крыс OXYS изменяется экспрессия 122 генов, связанных с развитием нейрона (Nrtn, Uchl1, Cspg4, Pip5k1c, L1cam, Cnp, Apod, Htra2 и др.), 81 гена - с регуляцией нейрогенеза (Ache, Lzts1, Efna3, Cspg4, Timp2, Mif и др.), 64 генов - с аксоногенезом (Cck, Stk11, Uchl1, Ephb3, Unc5b, Unc5a и др.), 84 генов - с синаптической трансмиссией (Cltb, Cplx1, Adora2a, Clstn3, Syt3, Grik4 и др.). Изменения экспрессии 220 генов в коре крыс OXYS с возрастом ассоциированы с процессами фосфорилирования (Cspg4, Adora1, Map3k4, Map3k9 Prkaca, Map2k7, Matk и др.), 180 генов - с активностью протеинкиназ (Itpka, Maged1, Mark4, Grk6, Mtor, Tnk2, Gsk3a и др.), 110 генов - с внутриклеточным транспортом белков (Clta, Cltb, Ap1b1, Ap2s1, Hps4 и др.), 128 - с цитоскелетным связыванием белков (Maea, Hip1r, Crocc, Vapb, Mtss1l, Pacsin1 и др.), 50 - с организацией митохондрий (Sept4, Oxa1l, Timm50, Timm13, Fis1, Mrpl12, Sharpin, Tomm40 и др.), 71 - с убихинон-связанными катаболическими процессами (Uchl1, Ube2g2, Man1b1, Bap1, Usp19 и др.). Снижается у крыс OXYS экспрессия генов, участвующих в делении органелл (Sept2, Pds5b, Dnm1l, Pds5a, Tmem215, Katna1, Usp16 и др.) и их слиянии (Mfn1, Cav2, Vav3, Gnai3, Cyp26c1, Gnai1, Vamp7, Uso1, Eea1 и Vcpip1). Повышается экспрессия 35 генов, участвующих в процессах организации микротрубочек (Kifc2, Kif22, Spg7, Crocc, Uchl1, Tubb5, Tubg1, Tubb3 и др.), 39 генов - в олигомеризации белка (Prkcz, Traf2, Ache, Kcnab2, Stk11, Aldoc, Lnx1, Mif и др.), 17 генов - в глиогенезе (Sox10, Adora2a, Cspg4, Hdac11, и др.) и 72 генов, связанных с апоптозом (Ppard, Dedd, Fastk, Casp9, Bag3, и др.).

Анализ групп ДЭГ в коре крыс OXYS и Вистар с возрастом (базы данных KEGG pathway и Wikipathways) выявил ассоциации с сигнальными путями, контролирующими транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и подвижность клеток, воспаление, апоптоз и другие процессы. У крыс Вистар наиболее значимые изменения экспрессии генов с возрастом связаны с активацией сигнального пути рецептора В-клеток (Rps6ka1, Card11, Zap70, Blnk, Rps6, Fcgr2b) и Т-клеток (Cd4, Card11, Zap70), IL-5 сигнального пути (Itgam, Rps6ka1, Itgb2), системы комплемента. Общими для крыс обеих линий были изменения экспрессии генов, связанных с MAPK-, Инсулин-, Нейротрофин-, EGFR1- и mTOR-сигнальными путями, однако представленность генов и значимость (по показателю p-value) их изменений выше у крыс OXYS. Изменения экспрессии генов с возрастом в коре мозга крыс OXYS также ассоциированы с G Protein-, EGFR1-, Chemokine-, ErbB-, Wnt- и Calcium-зависимыми сигнальными путями, что характерно и для больных БА (Winkler and Fox, 2013).

Более того, функциональная аннотация ДЭГ (р0.01) с помощью биоинформатической системы WebGestalt показала представленность в коре крыс OXYS 62 генов из метаболического пути БА (p-value=2.58e-14; adjP=3.25e-13). Для более полной оценки вклада изменения экспрессии генов при прогрессии у крыс OXYS признаков БА, была проведена функциональная аннотация ДЭГ при уровне значимости р0.05 с поправкой на множественные сравнения. Согласно KEGG pathway, значимые изменения экспрессии 85 генов в коре крыс OXYS с возрастом связаны с путем БА (p-value=6.39e-18;

adjP=8.27e-17; рис. 15), из них 27 генов имели сниженную и 58 –повышенную экспрессию.

Рис. 15. Согласно базе данных KEGG pathway, 85 дифференциально экспрессирующихся генов (красные звездочки) в префронтальной коре крыс OXYS вовлечены в путь БА.

Функциональная аннотация с помощью базы данных DAVID ДЭГ в коре крыс OXYS генов, вовлеченных в путь БА, показала, что прогрессия признаков БА у них происходит на фоне связанного с процессингом A повышения экспрессии генов - и -секретаз и Арр.

Изменяется экспрессия генов, ассоциированных с Notch-сигнальным путем, играющим важную роль в нейропластичности. Также ДЭГ, вовлеченные в путь БА, у крыс OXYS группируются в следующие категории (термины генных онтологий): клеточный цикл, внутриклеточный транспорт, ответ на гипоксию, клеточный ответ на стресс, ответ на гормональные и эндогенные стимулы. Значительные изменения экспрессии генов связаны с функциями митохондрий и синаптической пластичностью. Прогрессия признаков БА у крыс OXYS происходит на фоне повышения экспрессии генов, связанных с фосфорилированием, регуляцией каспаз и киназной активности и апоптозом.

Как и у больных БА (Winkler and Fox, 2013), у крыс OXYS с возрастом изменяется экспрессия генов, ассоциированных с другими нейродегенеративными заболеваниями:

болезнью Хантингтона, болезнью Паркинсона и боковым амиотрофическим склерозом, что предполагает общие механизмы их развития. У крыс OXYS выявлено 47 ДЭГ, общих для метаболического пути БА и этих заболеваний. Подавляющее большинство из них связаны с комплексами дыхательной цепи митохондрий, дисфункция которых рассматривается как один из ключевых факторов риска нейродегенеративных заболеваний (Witte et al., 2010). Общими для БА, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза являются также гены регуляторы апоптоза - Casp3, Casp9 и Cycs, для БА и болезни Хантингтона - транскрипты фосфолипазы С (Plcb1 и Plcb4), ген Gnaq, участвующий в регуляции ядерных метаболических процессов, и рецептор глутамата Grin1. Обобщение анализа результатов для 85 ДЭГ, вовлеченных в путь БА представлено на рис. 16.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«КАЛИНИН Владимир Анатольевич КЛИНИКО-ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ТЕЧЕНИЕ ЭПИЛЕПСИИ В РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППАХ 14.01.11 – нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный консультант:...»

«Борисевич Сергей Александрович ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КОЖИ ПРИ ЗАНЯТИЯХ СПОРТОМ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре теории и методики прикладных видов спорта педагогического института физической культуры и спорта Государственного автономного образовательного учреждения высшего образования города Москвы «Московский городской педагогический университет» (ГАОУ ВО МГПУ)...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.