WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«О-ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ ЭТИЛТРИФТОРЛАКТАТЫ И ГЕКСАФТОРИЗОПРОПАНОЛЫ КАК ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ ЭСТЕРАЗ IN VITRO И IN VIVO ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

РУДАКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

О-ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ ЭТИЛТРИФТОРЛАКТАТЫ И



ГЕКСАФТОРИЗОПРОПАНОЛЫ КАК ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ

ЭСТЕРАЗ IN VITRO И IN VIVO

Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н.

Махаева Галина Файвелевна Черноголовка – 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….7 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ………………………………………….14

1.1. Ацетилхолинэстераза……………………………………………………...14 1.1.1. Основная физиологическая функция и локализация АХЭ.……….14 1.1.2. Структура и каталитический механизм действия АХЭ..………….16 1.1.3. Неклассические функции АХЭ…………………………………......22 1.1.4. Заболевания, связанные с АХЭ…………………………………......23 1.1.5. Механизм ингибирования АХЭ……………………………………..25 1.1.6. Токсикологические и фармакологические аспекты ингибирования АХЭ.……………………………………………………….29

1.2. Бутитилхолинэстераза………………………………………………..........35 1.2.1. Физиологическая функция и локализация БХЭ…………………....35 1.2.2. Генетический полиморфизм БХЭ…………………………………...36 1.2.3. Структура БХЭ………………………………………………………..38 1.2.4. Биологическая роль БХЭ……………………………………………..41 1.2.4.1. Роль БХЭ в метаболизме лекарственных препаратов.…………………………………………………………….42 1.2.4.2. Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС………………………………………….43 1.2.4.3. Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера………...44

1.3. Нейропатичная эстераза…………………………………………………...47 1.3.1. Физиологическая роль и локализация НТЭ………………………..47 1.3.2. Структура НТЭ………………………………………………………50 1.3.3. Синдром отставленной нейротокичности, вызываемой ФОС (ОНТФОС)……………………………………………………………53 1.3.4. Роль НТЭ в механизме инициирования ОНТФОС………………..57 1.3.4.1. Ингибирование и «старение» НТЭ…………………….........57 1.3.4.2. Оценка нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений……………………………………62 1.3.4.3. НТЭ как биомаркер воздействия нейропатичных ФОС………………………………………………….63

1.4. Карбоксилэстераза……………………………………………………........66 1.4.1. Физиологическая функция и локализация КЭ……………………..66 1.4.2. Изоформы КЭ млекопитающих…………………………………......66 1.4.3. Структура КЭ………………………………………………………....71 1.4.4. Биологическая роль КЭ……………………………………………...76 1.4.4.1. Роль КЭ в метаболизме лекарственных препаратов..……...76 1.4.4.2. Роль КЭ в метаболизме липидов……………………………..77 1.4.4.3. Взаимодействие с ФОС: роль КЭ как биоскэвенджера и биомаркера воздействия ФОС………………………………………78

1.5. Параоксоназа ………………………………………………………………80 1.5.1. Локализация и субстратная специфичность PON1………..............80 1.5.2. Структура PON1…

1.5.3. Физиологическая функция PON1……………………………………83 1.5.4. Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств.……………….84 1.5.5. PON1 и детоксикация ФОС…………………………………………84 1.5.6. Генетический полиморфизм PON1…………………………………86 ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………………..89

2.1. Материалы………………………………………………………………….89

2.2. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями

2.3. QSAR анализ эстеразного профиля соединений………………………...95

2.4. Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)……………………..96

2.5. Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови……........99

2.6. Определение величин IC50 для ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми соединениями в препаратах мозга и крови ………..105

2.7. Эксперименты на животных…………………………………………......106

2.8. Статистическая обработка результатов…………………………………107 ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………108

3.1. Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз………………………..108 3.1.1. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ О-фосфорилированными этилтрифторлактатами……………………….109 3.1.2. Анализ эстеразного профиля О-фосфорилированных этилтрифторлактатов………………………………………………………116 3.1.3. Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном.…………………………………………………………………..128 3.1.4. Оценка эстеразного профиля О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (diEt-PFP, diBu-PFP) и маркерного соединения О,О-дипропил-О-дихлорвинилфосфата (diPr-DClVP)…….132





3.2. Исследование активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в крови и оценка «эстеразного статуса» человека и грызунов…………..135 3.2.1. Разработка методов пробоподготовки и оптимизация методик определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови…………………………………………………………...135 3.2.2. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в плазме крови человека и крысы в стандартных условиях……………………...147 3.2.3. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови человека, мыши и крысы……………………………...148

3.3. Мыши как модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала фосфорорганических оединений………………………………..152 3.3.1. Сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур к действию ФОС с различным эстеразным профилем в экспериментах in vitro………………………...154 3.3.2. Сравнительное исследование ингибирования НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур фосфорорганическими соединениями в экспериментах на целом животном……………………………………159 3.3.3. Использование НТЭ крови мышей в качестве биохимического маркера отравления нейропатичными ФОС…………163

3.4. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови мышей in vitro…………………………………………………………………169 3.4.1. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей in vitro…..169 3.4.2. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей in vitro…..173

3.5. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма…………179 3.5.1. Ингибирование эстераз мозга мышей при внутрибрюшинном введении ФОС………………………………………179 3.5.2. Ингибирование эстераз крови мышей при внутрибрюшинном введении ФОС………………………………………183 3.5.2.1. Вклад эстераз-скэвенджеров в формирование токсических эффектов………………………………………………..187 3.5.2.2. Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей……...189 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………194 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………..196 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….......197

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Органические производные пятивалентного фосфора (фосфорорганические соединения, ФОС) широко применяются в агрохимической практике и ветеринарии (инсектициды, акарициды, противопаразитные агенты), в промышленности (пластификаторы, компоненты смазочных материалов, антипирены), в качестве лекарственных средств для лечения шистосомоза (метрифонат), глаукомы (экотиофат), рака (циклофосфамид), остеопороза (некоторые бисфосфонаты). Некоторые высокотоксичные ФОС являются химическими боевыми отравляющими веществами, огромные запасы которых, накопленные в мире (Зарин, VX), как и проблемы, связанные с их транспортировкой, уничтожением и переработкой, представляют в настоящее время серьезную экологическую опасность.

Ряд ФОС помимо острого токсического действия, обусловленного ингибированием ацетилхолинэстеразы (АХЭ) нервных синапсов, может индуцировать синдром «отставленной нейротоксичности, вызываемой фосфорорганическими соединениями» (ОНТФОС). Это дистальные нейропатии, проявляющиеся после 2-3 недельного латентного периода и характеризующиеся дегенерацией длинных аксонов периферической и центральной нервной системы. Высокая чувствительность человека к действию нейропатичных ФОС, наличие длительного скрытого периода между отравлением и клиническими проявлениями ОНТФОС, отсутствие специфических средств лечения и высокий уровень инвалидизации пострадавших, делают чрезвычайно важной проблему оценки риска отставленного нейротоксического действия ФОС и ранней диагностики этого заболевания.

В связи с широким применением ФОС и необходимостью создания новых соединений и материалов, которые были бы безопасны для человека и теплокровных, весьма актуальной является задача выяснения механизмов формирования токсических эффектов данного класса соединений, а также разработка новых биомаркеров воздействия ФОС на человека и их количественная оценка.

Фармакологическое применение антихолинэстеразных соединений и потребность в новых эффективных препаратах, не обладающих опасными побочными эффектами, обусловливают необходимость разработки методологии прогнозирования потенциальных терапевтических и токсических эффектов соединений на этапе их синтеза и исследований in vitro.

Для характеристики эффективности взаимодействия антихолинэстеразных соединений с эстеразами-мишенями in vitro в нашей лаборатории предложена концепция «эстеразного профиля» – набора кинетических констант, описывающих ингибиторную активность соединения в отношении эстераз различной функциональной значимости: ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7, АХЭ, острая токсичность, улучшение когнитивных функций);

нейротоксичной эстеразы (КФ 3.1.1.5, НТЭ, отставленная нейротоксичность, ОНТФОС), бутирилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.8, БХЭ, стехиометрический скэвенджер, улучшение когнитивных функций, модуляция метаболизма лекарств), карбоксилэстеразы (КФ 3.1.1.1, КЭ, стехиометрический скэвенджер, модуляция метаболизма лекарств). Анализ эстеразного профиля позволяет получить более полную картину биологической активности соединения и оценить баланс между его терапевтическим свойствами и нейротоксичным потенциалом.

Анализ эстеразного профиля позволяет также оценить перекрестную специфичность антихолинэстеразных соединений и возможность возникновения нежелательного лекарственного взаимодействия при применении ингибиторов рассматриваемых эстераз в качестве лекарственный препаратов.

Токсические и терапевтические эффекты, являющиеся результатом ингибирования фосфорорганическими соединениями указанных 4-х сериновых эстераз, представлены ниже на Схеме, где курсивом выделены эффекты, определяющие токсическое действие ФОС.

Список мишеней-эстераз, безусловно, может быть расширен включением в него ряда других белков, ковалентно связывающих ФОС, таких как ацилпептидгидролаза, гидролаза амидов жирных кислот (fatty acid amide hydrolase, FAAH, КФ 3.5.1.99), арилформамидаза (КФ 3.5.1.9), сывороточный альбумин В данной работе мы ограничимся рассмотрением [1-3].

взаимодействия ФОС с четырьмя вышеперечисленными сериновыми гидролазами.

При попадании в организм ФОС взаимодействуют с АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови, а также с параоксоназой (КФ 3.1.8.1, PON1), которая может гидролизовать и детоксицировать фосфорорганические соединения и действовать как каталитический скэвенджер. Совокупность активностей указанных ферментов в крови входит в понятие «эстеразный статус»

организма, который в значительной степени определяет видовую и индивидуальную чувствительность к антихолинэстеразным соединениям.

В токсикологических и фармакологических исследованиях комплексная оценка химических рисков и потенциальных терапевтических свойств соединений основывается на предположении (экстраполяции), что эффект, наблюдаемый на лабораторных животных, будет наблюдаться и у человека.

Этические нормы, концепции защиты животных, а также новые методологии создания лекарственных средств с заданными свойствами ставят задачу постепенной замены тестов на животных для скрининговых исследований и оценки безопасности химических средств и продуктов. Актуальным становится поик альтернативных моделей (ферментных, клеточных, компьютерных и т.д.).

Ценность таких моделей заключается не только или не столько в их способности заменить животных, сколько в получении максимально полной информации о потенциальных фармакологических и токсических свойствах соединений до проведения исследований на животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование эстеразного профиля ряда О-фосфорилированных этилтрифторлактатов и некоторых представителей родственных соединений – О-фосфорилированных гексафторизопропанолов, и проверка в экспериментах на тканевом уровне (кровь, мозг) и на уровне целого организма прогнозов и выводов, сделанных на основании анализа эстеразного профиля соединений.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

оценка и анализ эстеразного профиля гомологичных

– Oфосфорилированных этилтрифторлактатов и выбор соединений для исследования на тканях и на целом организме;

– разработка методов определения АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови и сравнительное исследование «эстеразного статуса» человека и грызунов путем определения в крови активностей указанных ферментов;

– исследование НТЭ мозга и крови мышей как биомаркера воздействия нейропатичных ФОС;

исследование ингибиторной активности фосфорорганических

– соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах мозга и крови мышей in vitro;

исследование ингибиторной активности фосфорорганических

– соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мозга и крови мышей на уровне целого организма при внутрибрюшинном (в/бр) введении.

Научная новизна работы. На примере фосфорорганических соединений впервые показано, что эстеразный профиль ингибиторов холинэстераз в значительной степени определяет их эффекты на тканевом уровне и на уровне целого организма.

Впервые подробно охарактеризован «эстеразный статус» человека и лабораторных животных (мыши и крысы).

Установлено, что НТЭ мозга и крови мышей являются биохимическими маркерами отравления нейропатичными ФОС. Разработана модель на мышах для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС.

Найден новый эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы плазмы крови мышей с низкой острой токсичностью.

Практическая значимость работы. Проведенное исследование показывает, что методология анализа эстеразного профиля антихолинэстеразных соединений, учитывающая конкурирующее взаимодействие соединения с несколькими мишенями, позволяет прогнозировать терапевтические и токсические эффекты соединения, и может быть использована в скрининговых исследованиях при создании новых эффективных и безопасных лекарственных средств.

Показана возможность использования стандартных лабораторных животных (мышей) для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС вместо дорогостоящих исследований, традиционно проводимых на курах.

Найденный в ходе работы эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы крови мышей, обладающий низкой острой токсичностью, может использоваться для стабилизации потенциальных фармакологических агентов, содержащих сложноэфирные или амидные группы, при проведении доклинических исследований на грызунах.

Полученные в настоящей работе данные по «эстеразному статусу»

человека и грызунов важны при проведении исследований в области медицины и токсикологии, а также для более корректной экстраполяции экспериментальных результатов с животных на человека и в качестве базовых активностей при биомониторинге.

Личный вклад автора состоял в разработке условий и методов исследования, в планировании экспериментов, в подготовке образцов тканей животных и проведении экспериментальной работы, в обработке, обобщении и интерпретации полученных данных, анализе литературных источников. Автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов и их апробации на российских и международных научных форумах.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н., зав. лабораторией молекулярной токсикологии Г.Ф.

Махаевой за помощь в постановке задачи, за ценные замечания и поддержку в ходе выполнения и написания данной работы.

Автор выражает искреннюю благодарность своим соавторам: н.с. лаборатории молекулярной токсикологии ИФАВ РАН О.Г. Серебряковой за помощь в проведении кинетических исследований и в работе с животными, м.н.с лаборатории молекулярной токсикологии Т.Г. Галенко за помощь в проведении токсикологических экспериментов, с.н.с., к.х.н. Химфака МГУ Л.В. Сиголаеву за помощь в проведении электрохимических измерений. Автор благодарит зав. лаб. синтеза ФАВ к.х.н. Соколова В.Б. и к.х.н., вед. н.с. А.Ю. Аксиненко за предоставленные для исследований фосфорорганические соединения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 11th SAC Seminar “New Trends In Chemical Toxicology”, 22-25 September 2008, Moscow; Society of Toxicology, Annual Meeting, 15-19 March 2009, Baltimore, USA; 12th Medical Chemical Defense Conference, 21-24 April 2009, Munich, Germany; 10th International Meeting on Cholinesterases, 20-25 September 2009, Sibenik, Croatia; VII Всероссийская конференция Химия и медицина «Орхимед-2009», 1-5 июля 2009, Уфа, Россия;

13th International CWD Conference, 24-27 May 2010, Prague, Czech Republic; VIII Всероссийская конференция с международным участием “Химия и медицина”, 6-8 апреля 2010, УФА, Россия; 14th International CWD Conference, 23-26 May 2011, Interlaken, Switzerland; XIX Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, 25-30 September 2011, Volgograd, Russia; 15th International CWD Conference, 21-25 May 2012, Glasgow, UK; 11th International Meeting on Cholinesterases, 4-9 June 2012, Kazan, Russia; 9-я Всероссийская конференции "Химия фтора", посвященная 100-летию со дня рождения академика А.В.

Фокина, 22-26 октября 2012, Москва; Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia-2013), 8-12 сентября 2013, Москва; 4th National Congress of Clinical Toxicology with International Participation and Annual Meeting of Bulgarian Toxicological Society, 7-8 November 2013, Sofia, Bulgaria.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 38 работ, в том числе 9 статей в международных и отечественных журналах, 3 статьи в материалах конференций, 7 глав в книгах, 18 тезисов докладов международных и российских конференций, получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 255 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов в 5 главах, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 514 ссылок.

Работа содержит 58 рисунков и 30 таблиц.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Характерной особенностью фосфорорганических соединений (ФОС) является их ковалентное взаимодействие с серином активного центра сериновых гидролаз, приводящее к необратимому ингибированию этих ферментов. При этом ацетилхолинэстераза (АХЭ) и нейротоксичная эстераза (НТЭ) являются «первичными» биомишенями, взаимодействие с которыми обусловливает острую холинэргическую токсичность и отставленную нейротоксичность (ОНТФОС), соответственно. Неспецифические эстеразы бутирилхолинэстераза (БХЭ) и карбоксилэстераза (КЭ) являются «вторичными» мишенями, которые действуют как стехиометрические скэвенджеры, снижающие концентрацию активного ФОС. Локализованная в плазме кальций-зависимая гидролаза параоксоназа (PON1), играет центральную роль в гидролизе и детоксикации многих ФОС, действуя как каталитический скэвенджер. БХЭ, КЭ и PON1 участвуют также в детоксикации ксенобиотиков и метаболизме фармпрепаратов. Физиологическая роль и биологические функции этих ферментов подробно рассматриваются в данной главе. Структура и механизм действия ингибиторов эстераз, возможность их применения в качестве терапевтических агентов также обсуждаются в данном разделе.

–  –  –

1.1.1. Основная физиологическая функция и локализация АХЭ Ацетилхолинэстераза (АХЭ, КФ 3.

Загрузка...
1.1.7) является одним из ключевых ферментов, регулирующих работу нервной системы. Это ключевой компонент холинэргических синапсов центральной нервной системы и нервно-мышечных синапсов. [4, 5 6]. Основная физиологическая функция АХЭ – гидролиз нейротрансмиттера ацетилхолина (АХ) до холина и уксусной кислоты и, как следствие, прекращение передачи нервного импульса [7, 8]. АХЭ считается одним из самых быстрых из известных ферментов [ 9, 10]. Этот фермент имеет высокое число оборотов – kcat/KM=1.6108M-1с-1 [11], что гарантирует быстрое удаление ацетилхолина и обеспечивает готовность синапса к новому циклу передачи возбуждения. Продукты гидролиза, холин и уксусная кислота, активно захватываются пресинаптической частью синапса и используются для повторного синтеза ацетилхолина.

Реакция гидролиза ацетилхолина в присутствии АХЭ приведена на Рисунке 1.1.-1.

–  –  –

Рис. 1.1. -1. Реакция гидролиза ацетилхолина в присутствии АХЭ.

АХЭ обладает довольно узкой субстратной специфичностью, помимо ацетилхолина она способна гидролизовать некоторые другие эфиры холина:

ацетилтиохолин, пропионилхолин, пропионилтиохолин [12].

Помимо центральной нервной системы АХЭ локализована в симпатических и парасимпатических ганглиях, моторных окончаниях двигательных нейронов, потовых железах, в лимфатической системе и эмбриональных тканях, сердце, легких, кишечнике, селезенке и эритроцитах.

[13]. АХЭ экспрессируется во всех эукариотах, включая растения [14, 15].

Генетический полиморфизм АХЭ

Активность АХЭ является жизненно важной для нейротрансмиссии. В связи с этим предполагалось, что генетические варианты АХЭ будут несовместимыми с жизнью, и поэтому не присутствуют в организме здорового человека. Однако, были описаны четыре примера генетического полиморфизма АХЭ, и два из них имели клинические проявления. Первый из клинически значимых полиморфизмов расположен в дистальном промотере гена АХЭ. Его клинические проявления связаны с высокой чувствительностью этой изоформы АХЭ к антихолинэстеразным соединениям [16, 17] и, возможно, коррелируют с проявлениями синдрома войны в Персидском заливе. Были найдены и другие мутации в кДНК АХЭ, которые подробно охарактеризованы в работе [18], и, как показано, затрагивают нефункциональные области фермента.

АХЭ является эритроцитарным антигеном человека, т.е.

экспрессируется на поверхности эритроцитов и определяет группу крови YT [19]. При этом существуют два варианта: нативный YT1 (90% Американской и Европейской популяции) [20] и его полиморфная модификация YT2 (всего 10%), имеющая единичную аминокислотную замену His322Asn. [19, 21].

Было показано, что данная мутация не оказывает никакого влияния ни на каталитические, ни на физические свойства АХЭ, поскольку эта аминокислота находится на периферии белка, не играет существенной роли в его конформационной стабильности и достаточно удалена от активного сайта [21, 22]. В работе [23] показано, что мыши, несущие один дефицитный аллель АХЭ, имеют около 50% нормальной активности АХЭ в головном мозге, мышцах и плазме. Эти (+/–АХЭ) мыши не отличаются от мышей дикого типа по здоровью, фертильности, весу и температуре тела, но проявляют повышенную чувствительность к ФОС [24, 25]. Данные исследования подтверждает мнение, что люди с одним дефицитным аллелем АХЭ здоровы, но будут проявлять повышенную восприимчивость к токсичным ФОС.

1.1.2. Структура и каталитический механизм действия АХЭ Ацетилхолинэстераза - гликопротеин, в котором углеводная часть молекулы составляет около 8% по массе. По механизму действия АХЭ является сериновой гидролазой, структурно она принадлежит к классу /-протеинов.

–  –  –

Единственный ген АХЭ человека картирован на 7 хромосоме в локусе 7q22 [26] и состоит из шести экзонов. В результате альтернативного сплайсинга на C-концевом участке получаются три различных полипептида АХЭ, образующих набор изоформ с идентичными каталитическими свойствами.

Различия в структуре сказываются на распределении изоформ в тканях и образовании четвертичной структуры. [27, 28]. Образуются следующие формы:

• АХЭR – растворимый мономер, участвующий в регуляции нервного сигнала в мозге, и наиболее подробно изученная из всех форм;

• АХЭH присутствует в основном в эмбриональных тканях и на поверхности гематопоэтических клеток в виде димера;

• АХЭT – основная форма, играющая важную роль в нервномышечном взаимодействии (тетрамерный белок, содержащийся в мозге, мышцах и большинстве тканей).

Первичную структуру фермента образует уникальная последовательность из 537 аминокислотных остатков. Мономер АХЭ представляет собой эллипсоидную молекулу размером 45х60х65 и имеет молекулярную массу порядка 60 кДа. Третичная структура АХЭ представляет собой 12 смешанных

-листов, окруженных 14 -спиралями (Рис. 1.1.-2).

Кристаллографическая структура АХЭ установлена в 1991 [29].

Рис. 1.1. - 2. Структура ацетилхолинэстеразы (по кристаллографическим данным Рrotein Data Bank (PDB), код 1F8U, www.rcsb.org).

На Рисунке 1.1.-3 схематично представлено строение активного центра АХЭ человека, мыши и Torpedo californica. [6]. Порядковые номера гомологичных аминокислотных остатков для АХЭ различных организмов не совпадают. Исторически наиболее распространенной в литературе является нумерация аминокислотных остатков АХЭ Torpedo californica. Показано, что кристаллическая структура активного центра АХЭ мыши фактически идентична АХЭ человека [6, 30]. Поскольку наша работа в целом ориентирована на роль АХЭ в вопросах здоровья человека, мы используем нумерацию аминокислотных остатков АХЭ человека (hАХЭ) [6].

Активный сайт фермента находится на дне каталитической щели на глубине порядка 20 внутри белка (Рис. 1.1.-3). Канал каталитической щели выстилают 14 ароматических аминокислотных остатка, образующих ароматический кластер, который участвует в дополнительной фиксации субстрата путем взаимодействия с его гидрофобной областью и в его продвижении к каталитическому центру фермента [31].

Канал каталитической щели

Рис. 1.1. - 3. Наложение 3D структур активного центра АХЭ человека, мыши и Torpedo californica. Остатки, которые показывают самые большие отклонения, окрашены красным для человека, синим для мыши и желтым для Torpedo californica. На первом месте указана нумерация аминокислотных остатков АХЭ человека и мыши, в скобках указана нумерация для Torpedo californica. Torpedo californica имеет одну замену: Tyr337 (в случае человека и мыши) заменен на Phe330 [6 ].

В активном центре АХЭ выделяют «эфирную» (эстеразную) и «анионную» области, которые образованы тремя основными группами аминокислотных остатков (Рис. 1.1.-3 и 1.1.-4) - это каталитическая триада (Ser203, His447, Glu334), оксианионный центр (Gly121, Gly122, Ala204) и анионный сайт (Trp86, Glu202, Tyr337, Gly448). Также выделяют ацильный карман — гидрофобную область внутри каталитической щели (Trp236, Phe295, Phe297, Phe338). Здесь ацетильная группа субстрата взаимодействует с Trp236, расположенным примерно в середине каталитической щели (Рис. 1.1.-3), с образованием катион- связи. Небольшой ацилсвязывающий карман АХЭ идеально подходит для АХ, так что его гидролиз осуществляется максимально эффективно, лимитирующим фактором является диффузия субстрата [32].

Рис. 1.1. - 4. Ключевые аминокислоты активного центра ацетилхолинэстеразы. [33].

Роль каталитической триады заключается в непосредственном участии в гидролизе ацетилхолина в активном центре белка. Каталитическая триада АХЭ типична для сериновых протеаз (серин–гистидин–кислотный остаток), однако имеется и характерное отличие: в качестве кислотного остатка выступает Glu вместо более распространенного в случае сериновых протеаз Asp, боковая цепь которого короче на одно –CH2– звено, чем у Glu. Серин и гистидин принимают участие в реакции в качестве нуклеофильной атакующей группы и элемента кислотно-основного катализа, соответственно (Рис. 1.1.-4) [33].

Роль оксианионного центра и -анионного сайта в процессе катализа сводится к фиксации субстрата в активном центре фермента посредством взаимодействия с карбонильным кислородом и четвертичной триметиламмониевой группой субстрата соответственно, что вносит вклад в стабилизацию интермедиатов и переходных состояний. Пептидные группы остатков Gly121, Gly122, Ala204 (оксианионный центр) образуют водородные связи с карбонильным кислородом ацетилхолина, тем самым удерживая ацетильную группу субстрата при нуклеофильной атаке кислорода Ser203 на первой стадии гидролиза. Фиксация положительно заряженной N(CH3)3+ группы ацетилхолина осуществляется посредством ее электростатического взаимодействия с Glu202, а также -взаимодействия катиона с ароматическими кольцами Trp86 и Tyr337.

Кроме того, важную роль в катализе играют молекулы воды и их ориентация в активном сайте, которая обеспечивается водородными связями с другими аминокислотными остатками [34].

Многочисленные ароматические остатки, выстилающие канал, образуют гидрофобные области, способные связывать алкильные и ароматические группы нейтральных субстратов и соответствующие фрагменты катионных субстратов и ингибиторов.

На поверхности белка у «входа» в каталитическую щель расположен периферический анионный сайт (ПАС) или -анионный сайт, который является первичным сайтом связывания лигандов [35]. Он включает в себя ароматический кластер: Tyr72, Tyr124, Trp286, Tyr341, и отрицательно заряженный остаток Asp74. При высокой концентрации ацетилхолина связывание второй молекулы субстрата с ПАС стерически блокирует освобождение продукта реакции, результатом чего является субстратное ингибирование АХЭ. [35]. ПАС способен связывать различные лиганды, тем самым изменяя конформацию активного центра и регулируя субстратную специфичность фермента. Такая гибкость активного центра и остальных частей белковой молекулы АХЭ обусловливает оптимальную каталитическую активность при различных внешних условиях [36].

–  –  –

Общая схема гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ и ключевая роль в нем серина и гистидина были известны еще до определения кристаллографической структуры АХЭ [37, 38, 39]. Полная схема многократно описана [32]. Реакция идет в 2 стадии — ацилирование и деацилирование, и включает в себя образование двух тетраэдрических интермедиатов (Рис. 1.1.-5).

На начальной стадии гидролиза (ацилирование) происходит нуклеофильная атака кислорода Ser203 по карбонильному атому углерода субстрата. Одновременно с этим происходит протонирование His447, играющего роль основания в данном процессе. Протонированный гистидин стабилизируется при взаимодействии с глутаматом Glu334. Эти два кислотных остатка, His447–Glu334, составляют так называемую систему переноса заряда (charge-relay system), активирующую серин. Итак, в результате всех этих процессов, Стадия 1, происходит образование первого тетраэдрического интермедиата, стабилизированного двумя водородными связями с водородами пептидных связей между глицинами оксианионного центра (Gly121, Gly122).

На Стадии 2 первый тетраэдрический интермедиат быстро распадается под действием протонированного гистидина, выступающего в качестве кислоты, с образованием ацилферментного комплекса. На Стадия 3 происходит удаление спиртовой компоненты сложного эфира - холина. Стадия 4 - деацилирование ацилферментного комплекса. Ацилфермент подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды, связанной водородной связью с имидазольным кольцом гистидина, в результате образуется второй тетраэдрический интермедиат.

Одновременно с этим на Стадии 5 происходит протонирование His447, который способствует быстрому распаду отрицательно заряженного тетраэдрического интермедиата с освобождением серина и образованием молекулы уксусной кислоты, Стадия 6.

Рис. 1.1. - 5. Схема гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ.

Данная схема катализа аналогична для всех сериновых этераз.

1.1.3. Неклассические функции АХЭ Одной из неклассических функций АХЭ является ее роль в росте аксонов и формировании синапсов [40, 41], а также в росте злокачественных опухолей [42, 43, 44].

На примере Helobdella triserialis [45] было установлено, что АХЭ в эмбриональном развитии появляется до развития холинэргической системы передачи нервного импульса, что указывает на некаталитическую роль АХЭ в клеточном развитии и росте нейронов. Предполагают, что на стадии эмбрионального развития АХЭ участвует в процессе регуляции дифференциации нервных клеток [46].

В связи с присутствием АХЭ в кроветворных клетках высказывается предположение о ее кроветворной активности у позвоночных [47, 48].

Было показано, что АХЭ принимает участие в процессе апоптоза – программируемой смерти клетки. Предполагается, что АХЭ участвует в разрушении ядерной оболочки в процессе апоптоза [49].

В работе [50] сообщается, что активность АХЭ является чувствительным индикатором дисфункции печени. Низкая активность этого фермента была обнаружена у пациентов, страдающих тяжелыми заболеваниями печени, такими как острый гепатит и цирроз.

Постоянный мониторинг активности АХЭ необходим для людей, у которых диагностирована фенилкетонурия. В работе [51] было показано, что концентрация фенилаланина и активность АХЭ в крови находятся в обратной зависимости. Авторы предполагают, что это может быть связано либо с непосредственным ингибированием АХЭ фенилаланином, либо с тем, что увеличение концентрации фенилаланина косвенно вызывает нарушения в микросреде липидного бислоя мембраны клеток и, как следствие, изменения состояния фермента.

1.1.4. Заболевания, связанные с АХЭ

Снижение эффективности или нарушение механизма нейропередачи, посредником которой служит ацетилхолин, является одним из факторов развития таких тяжелых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, бульбоспинальный паралич (myasthenia gravis) и др., которые характеризуются снижением когнитивных способностей и/или деградацией нервно-мышечных функций организма.

Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) относится к первично-дегенеративным деменциям и характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств. Основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера является разрушение холинергической системы регуляции передачи нервного сигнала Развитие этой болезни связывают, в частности, с низкой активностью фермента, ответственного за синтез ацетилхолина, ацетилхолинтрансферазы, в результате чего происходит снижение концентрации ацетилхолина в синапсах. Основным методом терапии этого заболевания является использование препаратов, способных ингибировать АХЭ (такрин, ривастигмин и др.), что приводит к возрастанию концентрации ацетилхолина в синапсе и продлению его воздействия на рецептор, тем самым восстанавливая баланс в холинэргической системе [52].

Ингибиторы АХЭ были предложены для лечения БА около 20 лет назад и в настоящее время являются основными применяемыми на практике препаратами. Следует отметить, однако, что антихолинэстеразные препараты являются лишь симптоматическими и не останавливают развитие заболевания, а лишь замедляют его прогрессирование и поддерживают качество жизни пациента, продлевая период до наступления полной инвалидизации. В настоящее время разрабатываются препараты, ориентированные на различные механизмы БА [53].

На тяжелых стадиях болезни Альцгеймера наблюдается снижение активности АХЭ, в то же время активность БХЭ повышается, и она частично берет на себя функции АХЭ по гидролизу ацетилхолина. [54-61]. В связи с этим, помимо ингибиторов, селективных для АХЭ, в качестве перспективных терапевтических агентов для лечения БА рассматриваются ингибиторы, селективные как в отношении БХЭ, так и действующие на обе холинэстеразы Более подробно различные типы ингибиторов АХЭ и их [56-65].

терапевтическое применение будут рассмотрены ниже.

–  –  –

При миастеническом синдроме (myasthenia gravis) ослабевает тонус и способность к сокращению скелетных мышцах [66]. Одна из возможных причин — снижение плотности рецепторов ацетилхолина субсинаптической мембраны, что приводит к тому, что потенциал концевой пластинки может не достигать порогового уровня, необходимого для возбуждения мышцы. В этом случае перспективным представляется применение ингибиторов АХЭ, позволяющих увеличить время взаимодействия ацетилхолина с рецептором, и таким образом достичь достаточной деполяризации.

–  –  –

Антихолинэстеразные соединения, в первую очередь, фосфорорганические соединения (ФОС), пролонгируют действие ацетилхолина и действуют как нейротоксины. К таким соединениям относятся боевые отравляющие вещества (БОВ), фосфорорганические пестициды, производные сульфоновой кислоты (например, C6H3CH2SO2F), карбаматы (например, эзерин) и четвертичные аммониевые основания. Ингибированная АХЭ может восстановить свою активность с помощью реактиваторов (например, оксимов) [11].

Ингибиторы АХЭ связываются, как с активным центром фермента: БОВ, фосфорорганические пестициды, карбаматы, в том числе лекарственные препараты - ривастигмин, физостигмин, (такрин, галантамин), обратимые ингибиторы такрин, галантамин, так и с периферическим анионным сайтом (например, гуперзин, донепезил, пропидий, этидий, афлатоксин В1, декаметоний) [67, 68].

С токсикологической точки зрения наиболее опасными являются ингибиторы группы ФОС.

АХЭ является типичной B-эстеразой: ФОС ингибируют ее, в отличие от А-эстераз (например, параоксоназы), которые гидролизуют ФОС [69].

Ингибирование АХЭ приводит к накоплению ацетилхолина в холинергических синапсах и гиперстимуляции мускариновых и никотиновых рецепторов, в результате чего передача нервного импульса нарушается. [70-72].

Признаками острого отравления ФОС являются повышение потливости и слюноотделения, повышение бронхиальной секреции, бронхоспазм, миоз, повышенная моторика желудочно-кишечного тракта, диарея, тремор. Данные симптомы проявляются в течение минут или нескольких часов после воздействия. Выраженность, время проявления и развития клинических симптомов отравления существенно зависит от дозы, длительности контакта с ФОС и эффективности терапевтических мероприятий.

Ингибирование активности АХЭ мозга или нервно-мышечной ткани на 70-90%, как правило, является летальным. [73]. Смерть наступает в результате дыхательной недостаточности вследствие ингибирования дыхательного центра ствола мозга, бронхоспазма и паралича дыхательных мышц [74, 75]. Терапия острых отравлений заключается в применении оксимов, которые реактивируют фосфорилированную АХЭ до того как произошло старение фермента, и атропина - антагониста ацетилхолина, который предотвращает воздействие ацетилхолина на мускариновые рецепторы. В случае тяжелых отравлений также применяют диазепам и проводят искусственную вентиляцию легких [75, 76].

Химическая структура и классификация ФОС подробно обсуждаются в работе [77].

–  –  –

Механизмы реакций ингибирования АХЭ и их кинетические аспекты зависят от структуры конкретного ингибитора, что подробно изложено в работах [69, 78-82].

ФОС и карбаматы ковалентно связываются с серином активного центра АХЭ, приводя к необратимому ингибированию фермента. [82]. Рассмотрим общую схему взаимодействия ФОС с АХЭ (Рис. 1.1.- 6).

На первом этапе происходит ковалентное связывание ФОС с серином каталитической триады фермента, с образованием конъюгата (фосфорилфермента), гораздо более прочного, чем при взаимодействии АХЭ с субстратом [7] – Реакция 1. После чего может происходить деалкилирование фрагмента молекулы ингибитора - «старение» фермента, которое приводит к образованию фосфорилированного фермента, неспособного к реактивации в результате расщепления связи R-OP или R-NHP и генерации отрицательного заряда – Реакция 2. При этом реактивация фосфорилированного фермента даже такими сильными нуклеофилами как KF и оксимы становится невозможной. Утрата способности фермента к реактивации называется «старением» фермента.

Помимо этого может происходить спонтанная реактивация фосфорилированного фермента с восстановлением его активности – Реакция 3.

Спонтанная реактивация для большинства ФОС протекает очень медленно, так как вода является слабым нуклеофильным агентом. Этот процесс занимает около 60 часов [81]. Реактивация ускоряется под воздействием реактиваторов — гидроксиламина, оксимов (R—CH=NOH), гидроксамовых кислот. Являясь более сильными нуклеофилами, чем вода, они способны вытеснять фосфорильный фрагмент из активного центра, в результате чего высвобождается свободный фермент. Обидоксим, тримедоксим, пралидоксим и аллоксим используются в качестве коммерчески доступных реактиваторов при терапии острых отравлений ФОС. [76, 83, 84].

–  –  –

Рис. 1.1.- 6. Схема взаимодействия АХЭ (Е-ОН) с фосфорорганическими соединениями [85, 86].

Карбаматы в отличие от ФОС обладают высокой скоростью реактивации (Рис. 1.1.-7): карбамоилированный фермент реактивируется в течение 20-60 минут (Реакция 2). Причем фрагмент карбаминовой кислоты, который высвобождается в ходе реактивации, быстро разлагается с получением амина и диоксида углерода (Реакция 3). Старение карбамоилированного фермента не происходит [81, 82].

–  –  –

Рис. 1.1. - 7. Схема взаимодействия АХЭ (Е-ОН) с карбаматами.

Реакция 1 – карбамоилирование АХЭ, Реакция 2 - спонтанная реактивация АХЭ, Реакция 3 – разложение карбаминовой кислоты.

К веществам, при ингибировании которыми фосфорилированный фермент способен стареть, относятся фосфаты, фосфонаты, амидофосфаты.

Фосфинаты, карбаматы, сульфонил фториды – не вызывают старения ингибированного фермента.

Если фосфорилированная АХЭ подверглась старению, ее реактивация невозможна даже с помощью реактиваторов. В данном случае восстановление активности АХЭ в организме происходит только за счет синтеза белка de novo, что может занять несколько дней [80, 86]. Механизмы ингибирования, реактивации и старения АХЭ активно изучаются [81, 87-89, 90-92].

1.1.6. Токсикологические и фармакологические аспекты ингибирования АХЭ Боевые отравляющие вещества (Рис. 1.1.- 8) - зарин (GB), зоман (GD), табун (GB), циклозарин (GF), VX, VR, чрезвычайно опасны в связи с повышенной проникающей способностью в организм человека и высокой токсичностью. БОВ серии G проникают в организм всеми путями и быстро распространяются по организму. Соединения V серии способны быстро проникать через легкие и кожу, при этом V агенты создают субэпителиальные депо, из которых агент медленно высвобождается [93], что обеспечивает его пролонгированное воздействие. Следует отметить, что БОВ, а также фосфорорганические пестициды и карбаматы довольно реакционноспособны, в организме они взаимодействуют и с другими эстеразами [73].

Основной («первичной») мишенью БОВ является АХЭ, ингибирование которой приводит к острой холинергической токсичности, неспецифические эстеразы («вторичные мишени») - БХЭ и КЭ, действуют как стехиометрические скэвенджеры ФОС, и представляют собой места потери активных молекул токсиканта [1, 94, 95], снижая его токсический эффект. Защитная роль каталитических биоскэвенджеров подробно рассмотрена в работе [96].

Рис. 1.1. - 8. Структура боевых отравляющих веществ.

Фосфорорганические пестициды, особенно их фосфорильные аналоги, в целом достаточно токсичны и для теплокровных и хладнокровных организмов в связи с высоким сходством холинэргических систем. [84]. Создание избирательных пестицидов с низкой токсичностью для теплокровных является отдельной важной задачей органической химии и токсикологии [97]. В работе [6] авторы показали, что структура АХЭ эволюционно очень консервативна, и это создает трудности при разработке видоспецифичных ингибиторов АХЭ.

Карбаматы в отличие от ФОС, как уже обсуждалось, обладают высокой скоростью реактивации и не вызывают старения ингибированного фермента.

Более того, описано массовое применение физостигмина (эзерин) - природный представитель карбаматов, алкалоид из калабарских бобов Physostigma venenosum - в качестве протекторного средства от возможного отравления БОВ.

В 1991 г. в период войны в Аденском заливе физостигмин был введен 400 тыс.

американских солдат с целью скоротечного блокирования (и, следовательно, защиты от ингибирования БОВ) АХЭ, так как ожидалась атака армии Ирака с использованием «нервных» газов [98].

Карбаматы широко используются в качестве лекарственных средств для лечения нейродегенеративных заболеваний [99]. Физостигмин и пиридостигмин (Рис. 1.1.-9), повышающие уровень ацетилхолина в синаптической щели, используются в терапии Myasthenia gravis. Быстрая реактивация карбамоилированной АХЭ является основой для применения карбаматов в качестве профилактического средства для защиты от воздействия БОВ, так как карбаматы блокируют необратимое связывание АХЭ с ФОС [92, 100, 101]. Ривастигмин (Exelon) - препарат для симптоматического лечения болезни Паркинсона, а также БА (Рис. 9) [102]. Трихлорфон (метрифонат) (в России - Хлорофос), используемый в последнее время в качестве пестицида, активно исследовался и показал высокую активность в качестве препарата для лечения БА. Однако был снят с исследований на 3-й фазе клинических испытаний из-за нескольких случаев нейропатий [103].

Карбаматы не проникают через гематоэнцефалический барьер, однако в условиях стресса может повыситься их диффузия в центральную нервную систему [104].

–  –  –

Рис. 1.1. - 9. Карбаматы, применяемые в терапии нейродегенеративных заболеваний.

Обратимый ингибитор АХЭ - Такрин (9-амино-1,2,3,4-тетрагидроакридин) считается одним из наиболее важных ингибиторов активного центра фермента, является симптоматическим средством лечения болезни Альцгеймера (Рис. 1.1.-10). Он известен во всем мире под торговой маркой Cognex. Основным недостатком такрина является его относительно высокая гепатоксичность [105], в связи с чем ведется поиск его менее токсичных производных [106]. В последнее время 7-метокситакрин широко исследуется в качестве перспективного заменителя такрина [107].

Галантамин (Нивалин, Рис. 1.1.-10), алкалоид из кавказского подснежника (Galanthus woronowii, Amaryllidaceae), является еще одним хорошо известным препаратом, который взаимодействует с активным центром АХЭ (с -анионным сайтом). Свойства галантамина впервые были описаны Машковским и Кругликовой-Львовой в 1951 [108]. Наряду с -анионным сайтом, галантамин связывается с ароматическим кластером каталитической щели АХЭ [109, 110] за счет электростатических взаимодействий [111].

Ряд природных ингибиторов АХЭ как перспективных препаратов для лечения БА рассмотрены в работе [112].

–  –  –

Периферический анионный сайт АХЭ (ПАС) является мишенью многих фармакологически важных соединений, в том числе новых препаратов для лечения БА.

Ингибиторы, специфичные к периферическому анионному сайту АХЭ, считаются не только симптоматическими препаратами в терапии БА, но, вероятно, затрагивают и причину данного заболевания [113]. Показано, что отложение амилоидных бляшек возможно ускоряется или даже индуцируется взаимодействием -амилоида с периферическим анионным сайтом АХЭ [114, 115]. Таким образом, ингибирование АХЭ по периферическому анионному сайту при БА, способствует не только поддержанию необходимого уровня ацетилхолина в синаптической щели, но также может замедлить агрегацию амилоида. Ингибирование периферического анионного сайта является перспективным подходом для лечения БА. Коммерчески доступные препараты, ингибирующие АХЭ по периферическому анионному сайту, представлены алкалоидами Гуперзином A и B и синтезированным соединением донепезил.

Донепезил (торговое название Aricept) хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и медленно экскретируется. Структуры гуперзина и донепезила изображены на (Рис. 1.1.-11).

–  –  –

Рис. 1.1. - 11. Ингибиторы периферического -анионного сайта АХЭ.

Декаметоний - бис-четвертичный аммониевый ингибитор ПАС АХЭ «растягивается» внутри каталитической щели, связываясь одной из своих четвертичных аммонийных групп с ароматическим кластером каталитической щели за счет катион- взаимодействий, а другой группой связывась с ПАС у входа в каталитическую щель, таким образом являясь ингибитором этих двух сайтов. [32]. Широко применяется в исследовательских целях для изучения сайт специфических взаимодействий.

Декаметоний

Этиология БА полностью не раскрыта, и антихолинэстеразная терапия не излечивает БА, а лишь замедляет ее развитие. Ингибиторы АХЭ - донепезил, ривастигмин, галантамин, такрин и антагонист глутаматных N-метил-Dаспартат (NMDA)-рецепторов, мемантин, являются в настоящее время единственными препаратами, применяемыми для симптоматического лечения БА [116 -119].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |
Похожие работы:

«ХИЖНЯК Роман Михайлович ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ (Zn, Cu, Co, Mo, Cr, Ni) В АГРОЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮГО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ ЦЧО Специальность: 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор сельскохозяйственных наук, профессор С.В. Лукин Белгород, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ЕРМОЛИН Сергей Петрович ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА ВОЕННОСЛУЖАЩИХ В УСЛОВИЯХ АРКТИЧЕСКОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 03.03.01 – Физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гудков А.Б. Архангельск 2015 стр. СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ И КОСМЕТОЛОГИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ АРИПОВА МУКАДДАМ ЛУТФИЛЛОЕВНА ОСОБЕНННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РОЗАЦЕА НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ОПИСТОРХОЗА (14.01.10 – КОЖНЫЕ И ВЕНЕРИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Хардикова С.А. Москва 2015 Стр. Список сокращений..4 Введение..5...»

«Мезенцева Ольга Александровна ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ СТУДЕНТОВБАКАЛАВРОВ МЛАДШИХ И СТАРШИХ КУРСОВ С УЧЕТОМ ИХ ЦЕННОСТНЫХ ОРИЕНТАЦИЙ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководителькандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Москва...»

«ШОШИНА ИРИНА ИВАНОВНА ЛОКАЛЬНЫЙ И ГЛОБАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЙ В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ 03.03.01 – физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: ШЕЛЕПИН ЮРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ, ДОКТОР МЕДИЦИНСКИХ НАУК, ПРОФЕССОР САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫЙ АНАЛИЗ КАК МЕТОД...»

«К О З ЛО В А ДАРЬЯ ИГОРЕВНА ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗЫ НЕПРИЛИЗИНА В МОЗГЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С п е ц и а л ьн о с ть 03.01.04 – биохимия 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук Научные руководители доктор биологических наук Журавин Игорь Александрович...»

«Иванов Олег Олегович МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНОЙ ЭМУЛЬСИИ НА ГЕМОДИНАМИКУ ПРИ КОМАХ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ ОСТРЫМ ИНСУЛЬТОМ 14.03.03 – Патологическая физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Тиунова Татьяна Алексеевна СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ОЦЕНКА УРОВНЕЙ ОНКОМАРКЕРОВ У ПРОЖИВАЮЩИХ В ПРОМЫШЛЕННОМ РЕГИОНЕ ЖЕНЩИН С ПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ 14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор...»

«21 мая 2014 года на заседании Диссертационного совета Д.002.044.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН состоялось рассмотрение диссертации Карантыш Галины Владимировны «Онтогенетические особенности поведенческих реакций и функциональных изменений в мозге крыс в моделях ишемии/гипоксии» на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 – «Физиология». Присутствовало на заседании _20_...»

«ГУРЬЯНОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА ПОВЫШЕНИЕ ЗИМОСТОЙКОСТИ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЯБЛОНИ РЕГУЛИРОВАНИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ ПОКОЯ ОРГАНИЧЕСКИМ И МИНЕРАЛЬНЫМ ПИТАНИЕМ 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Воробьев Вячеслав Филиппович Москва 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 1....»

«КАПИТОНОВ ВАЛЕНТИН СЕРГЕЕВИЧ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПИЩЕВЫХ КОНЦЕНТРАТОВ БЫСТРОГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Специальности: 05.18.01-Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодовоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Красноярск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Пищевые концентраты как форма пищи с широким спектром 1.1...»

«Фролов Александр Акимович Функциональные особенности респираторной системы в предродовом периоде и в родах в зависимости от стереоизомерии женского организма и их влияние на состояние плода 03.03.01 физиология 14.01.01 акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук...»

«Гвоздева Алиса Петровна ИНЕРЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В СЛУХОВОЙ СИСТЕМЕ ПРИ ЛОКАЛИЗАЦИИ ПРИБЛИЖАЮЩЕГОСЯ ЗВУКОВОГО ОБРАЗА 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., в.н.с. Андреева Ирина Германовна САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ОБЩАЯ...»

«Сафина Татьяна Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ ПОЛУШАРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА В РЕГУЛЯЦИИ ЭРГОТРОПНЫХ И ТРОФОТРОПНЫХ ФУНКЦИЙ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Александрова Екатерина Михайловна ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМЫ «МАТЬ-ПЛАЦЕНТА-ПЛОД» ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ЖЕНЩИН Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук физиология – 03.03.01 Научный руководитель: д.м.н., профессор Т.Л. Боташева Научный консультант:...»

«ХИЖНЯК Роман Михайлович ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ (Zn, Cu, Co, Mo, Cr, Ni) В АГРОЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮГО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ ЦЧО Специальность: 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор сельскохозяйственных наук, профессор С.В. Лукин Белгород, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ДАНИЛОВА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков Arabidopsis thaliana Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор В.В. Кузнецов...»

«РЕЗЕНЬКОВА Ольга Владимировна ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКСТРАКТА СОЛОДКИ ГОЛОЙ НА ПРОЦЕССЫ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА 03.00.13 – физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Н.Г. Беляев Ставрополь 200 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. ВВЕДЕНИЕ..6 1. КРАТКИЙ ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК ИЗУЧЕНИЯ АДАПТОГЕНОВ И ИХ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА (обзор литературы). 1.1. Общая...»

«Зарипова Юлия Рафаэльевна КЛИНИКО НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДВИГАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ОТЯГОЩЕННЫМ ПЕРИНАТАЛЬНЫМ АНАМНЕЗОМ Специальность 14.01.08 педиатрия 03.03.01 физиология диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные...»

«УЛЬЯНОВ Владимир Юрьевич ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И САНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ГОМЕОСТАЗА В ОСТРОМ И РАННЕМ ПЕРИОДАХ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.