WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«Создание и характеристика новой трансгенной модели бокового амиотрофического склероза, основанной на нейроспецифической экспрессии патогенной формы белка FUS ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт физиологически активных веществ и Федеральное

государственное бюджетное научное учреждение «Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

На правах рукописи

Овчинников Руслан Константинович

Создание и характеристика новой трансгенной модели бокового

амиотрофического склероза, основанной на нейроспецифической

экспрессии патогенной формы белка FUS



14.03.03 – патологическая физиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Доктор медицинских наук Нинкина Н.Н.

Москва – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Общая характеристика работы

1. Обзор литературы

1.1 Боковой амиотрофический склероз, общая информация......... 11

1.2 Клинические признаки и диагностика БАС

Генетика бокового амиотрофического склероза.................. 14 1.3 1.3.1 БАС-ассоциированные мутации

1.3.2 Дополнительные генетические факторы бокового амиотрофического склероза

1.3.3 Генетические риски развития бокового амиотрофического склероза

Патологические включения при боковом амиотрофическом 1.4.

склерозе

Патогенетические механизмы БАС

1.5 1.5.1 Гибель мотонейронов

1.5.1 Белок SOD1

Белок TDP-43

1.5.2 1.5.3 Локус C9ORF72

1.5.4 Белок FUS

2. Материалы и методы Исследования

2.1

Работа с животными

2.1.1 Линии лабораторных мышей

2.1.2 Манипуляции с ранними эмбрионами и хирургические процедуры на мышах

2.1.3 Инструментальные методы анализа двигательной функции мышей

2.2 Молекулярно-биологические методы

2.2.1 Трансгенноая кассета

2.2.3 Введение трансгена в геном мыши

2.2.4 Детекция трансгенной кассеты в геноме мыши

2.3 Биохимические методы

2.3.1 Анализ ДНК в агарозном геле

2.3.2 Экстракция белков

2.3.3 Денатурирующий гель-электрофорез по Леммли................ 54 2.3.4 Иммуноблоттинг

2.4 Гистологический анализ

2.4.1 Подготовка тканей и приготовление срезов.

2.4.2 Окраска по методу Ниссля

2.4.3 Иммуногистохимическое окрашивание

2.4.4 Стереологический подсчет нейронов

2.5 Статистичекая обработка данных

3 Результаты исследования и обсуждение

3.1 Получение линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359 и их общая фенотипическая характеристика

3.1.1 Трансгенная кассета и модификация генома мыши............ 63 3.1.2 Биохимический анализ результатов трансгенеза в линии мышей Thy-1/FUS 1-359.

3.1.3 Генетический фон линии мышей Thy-1/FUS 1-359.............. 68 3.1.4 Фенотипический анализ мышей линии Thy-1/FUS 1-359... 70

3.2 Патогистологическая характеристика FUSопатии в спинном мозге мышей линии Thy-1/FUS 1-359

3.3 Исследование динамики дегенерации и гибели двигательных нейронов спинного мозга у THY-1/FUS 1-359 мышей................... 82

3.4 Анализ миелинированных фибрилл в передних и задних корешках спинного мозга Thy-1/FUS 1-359 мышей

3.5 Анализ уровня нейротрофического фактора BDNF.................. 97 3.6 Манифестация клинических признаков прогрессии нейродегенеративного процесса у мышей линии THY-1/FUS 1-359.

3.7 Анализ некоторых показателей регенеративного процесса в спинном мозге мышей линии Thy-1/FUS 1-359

Выводы

Практические рекомендации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BDHF – нейротрофический фактор мозга (англ. brain-derived neurotrophic factor);

FUS – ДНК/РНК-связывающий белок (англ. fused in sarcoma);

GAPDH – глицеральдегидфосфатдегидрогеназа;

GFAP – глиальный фибриллярный кислый белок (англ. glial fibrillary acidic protein);

RCAI – агглютинин I из Ricinus communis;

SOD1 – супероксиддисмутаза 1 (англ. superoxide dismutase 1);

TARDBR – ген, кодирующий рекомбинантный белок TDP43 (англ. TAR DNA binding protein);

БАС – бовой амиотрофический склероз;

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДСН – додецилсульфат натрия;





ДСН – додецилсульфат натрия;

кДа – килодальтон;

ЛВД – лобновисочная деменция;

НДЗ – нейродегенеративное заболевание;

НДЗ – нейродегенеративные заболевания;

РНК – рибонуклеиновая кислота;

ТТБ – трис-твин буфер;

ФСБ – фосфатно-солевой буфер;

ЦНС – центральная нервная система.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Недостаточность знаний о молекулярных механизмах патогенеза и непосредственных патологических процессах, обусловливающих селективную гибель двигательных нейронов при боковом амиотрофическом склерозе является основной причиной отсутствия прогресса в разработке эффективных методов лечения этого тяжелого летального заболевания нервной системы. Актуальной задачей до настоящего времени остается создание адекватных животных моделей, в которых возможно воспроизведение основных характеристик патогенеза БАС и выявление ключевых молекулярных мишеней для разработки патогенетической терапии данного заболевания. Заметная активизация медико-генетических исследований БАС привела к выявлению ряда мутаций, ассоциированных с наследственными формами данного заболевания. Однако причинная роль кодируемых мутированными генами белков в развитии нейродегенеративного процесса остается не доказанной.

Полученные в различных лабораториях данные о возможном участии ДНК/РНК-связывающего белка FUS в патогенезе БАС послужили основой для создания гипотезы о его важной роли в патологических механизмах избирательного повреждения двигательных нейронов. Эта гипотеза требовала прямых экспериментальных доказательств. Mоделирование FUSопатии, которая приводит к развитию у трансгенных животных фенотипа, воспроизведящего основные патогенетические признаки БАС, является наиболее убедительным методом доказательства ключевой роли белка FUS в инициации и прогрессии патологического процесса, характерного для данного заболевания. Именно эта актуальная задача и была выбрана для диссертационного исследования.

Цель работы и основные задачи исследования.

Целью данной работы являлось получение экспериментальных доказательств того, что направленное нарушение структуры и функции белка FUS, приводящее к развитию FUSопатии, может быть достаточным для воспроизведения патогенетической цепи событий, приводящей к селективной гибели двигательных нейронов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить линию трансгенных мышей с нейроспецифической эктопической экспрессией аберрантной формы белка FUS человека;

2. Охарактеризовать прогрессию FUSопатии, вызванную эктопической экспрессией аберрантной формы FUS человека;

3. Провести анализ динамики нейродегенеративного процесса в спинном мозге трансгенных мышей;

4. Описать клинические проявления и особенности течения модельного заболевания, вызванного прогрессией FUSопатии у трансгенных мышей.

Научная новизна исследования.

Недавно проведенные широкомасштабные медико-генетические исследования позволили выявить мутации в ДНК/РНК-связывающих белках TDP-43 и FUS, которые ассоциированы с рядом наследственных форм БАС. Белки TDP-43 и FUS в определенных условиях способны менять внутриклеточную компартментализаию, агрегировать и формировать патогистологические включения, которые накапливаются в нейронах. Изучение патологии метаболизма РНК, в регуляцию которого вовлечены белки TDP-43 и FUS, является в настоящий момент центральным предметом многочисленных исследований молекулярных механизмов специфического поражения двигательных нейронов. Однако, несмотря на наличие экспериментальных данных, указывающих на центральную роль ДНК/РНК-связывающих белков TDP-43 и FUS в патологических процессах, ассоциированных с развитием БАС, прямые доказательства причинной роли этих белков отсутствовали. В данной диссертационной работе впервые получены прямые доказательства центральной роли FUSопатии в развитии нейродегенеративного процесса, характеризующегося специфической потерей двигательных нейронов.

Создана первая модельная линия трансгенных мышей, в которых эктопическая экспрессия укороченной формы белка FUS человека 1-359 позволила воспроизвести классическую Впервые FUSопатию.

экспериментально доказано, что прогрессия FUSопатии у Thy-1/FUS 1-359 мышей вызывает развитие нейродегенеративного процесса с селективной потерей двигательных нейронов, то есть путем экспрессии аберрантной формы белка FUS, без участия каких-либо других патогенных факторов, удалось воспроизвести в лабораторных мышах основные патогенетические признаки БАС. Таким образом была выявлена причинная роль аберантной формы белка FUS человека 1-359 в иницииации и прогрессии всего каскада патологических процессов, заканчивающегося гибелью преимущественно двигательных нейронов. Описано новое модельное заболевание у трансгенных мышей полученной линии, напоминающее по основным признакам БАС. Получены новые данные, позволяющие рассматривать образование аберантной укороченной формы белка FUS в качестве оригинальной молекулярной мишени для разработки патофизиологической терапии определенных форм БАС.

Tеоретическая и практическая значимость работы.

Воспроизведение основных характеристик нейродегенеративных заболеваний человека в трансгенных модельных животных позволяет изучать патогенез, исследовать взаимодействия между генотипом и фенотипом, между структурой белка и его функцией, разрабатывать патогенетические методы коррекции моделируемых заболеваний.

Доступность модельных организмов для каждого конкретного заболевания существенно расширяет возможности для проверки различных гипотез его развития и позволяет разрабатывать новые подходы к его специфической терапии. Создание адекватных моделей особенно важно для заболеваний, основная причина(ы) развития которых, несмотря на значимый прогресс в области биомедицинской науки, по-прежнему остаются неизвестными, в том числе и для БАС. Данное диссертационное исследование, посвященное разработке и характеристике животной трансгенной модели БАС, существенно расширило наши знания о патогенезе и осбенностях прогрессии тех форм БАС, в которых на первый план выступает нарушение структуры и функции белка FUS. Теоретическая значимость полученных результатов заключается в первую очередь в доказательстве положения, что нарушение функции одного лишь белка FUS, приводящее к развитию FUSопатии, достаточно для инициации и воспроизведения всей патогенетической цепи, заканчивающейся селективной гибелью двигательных нейронов. Практическую ценность представляет получение линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359, которая может быть использована для разработки и тестирования новых соединений, действие которых направлено на коррекцию нарушенной функции белка FUS.

Положения, выносимые на защиту.

1. Получены прямые доказательства центральной роли FUSопатии в развитии нейродегенеративного процесса, характеризующегося специфической потерей двигательных нейронов.

2. Создана модельная линия трансгенных мышей, у которых путем нейроспецифической экспрессии укороченной формы белка FUS человека с удаленным сигналом ядерной локализации и нарушенным сайтом РНК-связывания индуцирована классическая FUSопатия.

3. У созданной линии трансгенных мышей Thy-1/FUS 1-359 описано модельное заболевание, воспроизводящее основные клинические и патогистологические характеристики БАС.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены:

на V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь, Россия, 2012), на XIX межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии – 2013» (Санкт-Петербург, Россия, 2013), на 17ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, (Пущино, Россия, 2013), на I Национальной конференция с международным участием «От фундаментальной неврологической науки к клинике» (Москва, Россия, 2014), на Международной молодежной научной конференции "Современные проблемы генетики, клеточной биологии и биотехнологии" (Томск, Россия, 2014), на 3 европейской конференции по медицинским и биологическим наукам (Вена, Австрия, 2014), на 14 конгрессе по неврологии Азии и Океании (AOCN 2014) (Макао, Китай, 2014).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей и 7 сообщений в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объём работы.

Диссертация содержит: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (20) и иностранных языках (260). Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и содержит 3 таблицы и 30 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Боковой амиотрофический склероз, общая информация Боковой амиотрофический склероз (БАС), также известный как болезнь Шарко, является третьим наиболее значимым нейродегенеративным заболеванием во всем мире, с частотой возникновения 1,5-2,5 на 10000 в год [Никитин С.С., 2006; Logroscino G. et al., 2008] и распространенностью около 5,2 на 100000 человек [Хондкариан О.А. et al., 1970; Worms P.M., 2001]. БАС относится к группе болезней двигательного нейрона и характеризуется селективной гибелью верхних и нижних мотонейронов, которая приводит к нарастающей мышечной атрофии и прогрессирующему параличу поперечно-полосатой мускулатуры. Разработка методов его эффективной терапии существенно затруднена из-за гетерогенной природы заболеванием. Единственным рекомендованным в ряде стран к применению препаратом на настоящий момент является рилузол, способный увеличить продолжительность жизни на несколько месяцев [Miller R.G. et al., 2003], тогда как средняя продолжительность жизни больных после первого проявления клинических симптомов составляет всего от 2 до 5 лет [Бойко А.Н. et al., 2009; Logroscino G. et al., 2008]. Заболевание быстро ведет к тяжелой инвалидизации больных с высокой стоимостью их обслуживания и содержания [Левицкий Г.Н. et al., 2007; Gustavsson A. et al., 2011].

Прогресс в области биомедицинской науки позволил выявить ряд важных механизмов, лежащих в основе селективной дегнерации двигательных нейронов, что, в свою очередь, активизировало работы по изучению патогенеза различных форм БАС и стимулировало практический интерес клиницистов к проблеме разработки патогенетических методов его лечения.

1.2 Клинические признаки и диагностика БАС

При постановке диагноза БАС в первую очередь очень важно исключить клинически схожие заболевания, такие как рецессивная бульбарная атрофия Кеннеди, спондилогенная цервикальная миелоишемия, спинальная мышечная атрофия, энцефаломиелопатия.

Проведение дифференциальной диагностики может занимать достаточно длительное время, как правило от 9 до 13 месяцев с момента проявления первых симптомов [Cellura E. et al., 2012]. При клиническом осмотре первую очередь определяется степень вовлеченности вырхних и нижних мотонейронов в патологический процесс. Характерным признаком поражения верхних мотонейронов и следовательно угнетения кортикоспинальной передачи является мышечная спастичность в сочетании с проявлением патологических рефлексов (РоссолимоВендеровича, Бехтерева, Бабинского), которые в норме не проявляются благодаря тормозящему влиянию со стороны пирамидальной системы. Для поражения нижних мотонейронов, напротив, характерно развитие мышечной слабости, фасцикуляции и в дальнейшем атрофия. У больных с БАС на ранней симптоматической стадии могут проявляться признаки поражения как верхних, так и нихних мотонейронов в одной и той же области, при этом часто регистрируют ассиметричный характер подобных поражений. [Kiernan M.C. et al., 2011] После клинического осмотра больных направляют на электромиографию для проверки нервномышечной активности. На основании первичных данных, руководствуясь критериями Аваджи-Шима [Douglass C.P. et al., 2010] пациентов подразделяют на три категории: клинически возможный, предполагаемый БАС и пациентов с точно установленным диагонозом.

Средний возраст начала заболевания приходится на промежуток между 50 и 60 годами жизни [Cleveland D.W. et al., 2001]. Принадлежность к данной возрастной группе сама по себе может являться фактором риска, поскольку распространенность БАС среди людей старше 80 существенно снижается, однако для данного заболевания характерно скорее наличие восприимчивых подгрупп [Logroscino G. et al., 2010]. Возраст начала заболевания может существенно варьировать и описаны редкие формы БАС у подростков [Turner M.R. et al., 2012]. Кроме того, половая принадлежность также может быть отнесена к факторам риска, поскольку заболевание чаше встречается у мужчин, чем у женщин по невыясненным пока причинам [Logroscino G. et al., 2010].

Для БАС первоначальные клинические признаки зависят от формы течения заболевания, что дополнительно затрудняет диагностику.

Приблизительно две трети больных имеют спинномозговую клиническую форму с наиболее типичным для БАС дебютом, характеризующимся нарушением двигательной функции конечностей. Реже заболевание начинается с бульбарных или респираторных нарушений [Wijesekera L.C.

et al., 2009]. Однако, по мере прогресси нейродегенеративного процесса и поражения все большего числа нейронов происходит постепенное выравнивание симптоматики между различными клиническими формами.

На терминальных стадиях БАС периферический паралич расспространяется практически на все группы поперечно-полосатых мышц. Интересно, что глазодвигательные мышцы поражаются в последнюю очередь [Mannen T. et al., 1977]. Смерть больных наступает изза нарушения дыхания вследствие паралича дыхательной мускулатуры или из-за присоединения инфекции.

На сегодняшний день терапия этого заболевания носит паллиативный характер. В ряде случаев больным проводят гастростомию для облегчения приема пищи, а на поздних стадиях необходима искусственная вентиляция легких [Blackhall L.J., 2012].

Помимо симптоматики, связанной с поражением мотонейронов, у примерно половины больных БАС выявляют также когнитивные и/или поведенческие расстройства, чаще всего относящиеся к фронтотемпоральной деменции (ФТД) [Lillo P. et al., 2009], которая развивается в результате фронтальной и темпоральной лобарной дегенерации (ФТЛД). ФТД характеризуется прогрессирующим расстройством личности и нарушениями речи [Seltman R.E. et al., 2012]. У большинства пациентов с ФТЛД отмечаются также и двигательные расстройтсва, которые характерны для БАС [Lomen-Hoerth C. et al., 2002].

Клиническое сходство по некоторым показателям и перекрывющаяся основа молекулярного патогенеза двух этих заболеваний [Тюльпин Ю.Г. et al., 2002; Goldstein L.H. et al., 2013], дает основание полагать, что и разработка их специфической терапии может основываться на общих молекулярных мишенях.

Очевидно, что необходимо разрабатывать методы молекулярной диагностики различных форм БАС, классифицировать формы БАС в соответствие с типом молекулярного патогенеза и соответственно разрабатывать специфическую терапию для каждой из форм.

Генетика бокового амиотрофического склероза1.3

Семейные формы БАС (fALS) составляют не более 10% от всех случаев и наследуются по Менделевскому типу. Спорадические формы БАС (sALS) по клинической картине практически неотличимы от наследственных форм. Кроме того, растет число выявленных генетических аномалий, ассоциированных со спорадическими формами БАС. При этом абсолютно очевидно, что на данный момент выявлены далеко не все fALSассоциированные мутации, поскольку имеются случаи, когда генетический анализ не дает результата даже при наличии полного семейного анамнеза БАС [Шелковникова Т.А. et al., 2011; Al-Chalabi A. et al., 2010; Talbot K., 2013].

Загрузка...

1.3.1 БАС-ассоциированные мутации Последние 20 лет активно велись медико-генетическиe исследования БАС. К настоящему времени выявлен целый ряд мутаций, ассоциированных с семейными формами БАС (Таблица 1) [Renton A.E. et al., 2014]. Около 70% случаев fALS удалось связать с поражением определенных генов, при этом почти для трети семейных форм генетические повреждения выявить пока не удалось и исследования продолжаются.

Таблица 1 – Основные гены, в которых обнаружены БАСассоциированные мутации.

Сокращения: AD, аутосомно-доминантный; AR, аутосомно-рецессивный XD, x-сцепленный доминантный; DENN, дифференциально экспрессирующийся в нормальных и неопластических клетках. Взято из [Renton A.E. et al., 2014].

SOD1. Первым установленным геном, мутации в котором приводили к развитию был ген, кодирующй зависимую fALS, Ca/Zn супероксиддисмутазу 1 (СОД1). На данный момент в этом гене обнаружено более 150 мутаций, в основном миссенс, расположенных во всех 5 экзонах [Chen S. et al., 2013], а также одна рецесивная замена D90A [Andersen P.M. et al., 1995]. Мутации в данном гене обнаруживают у примерно 20% больных с семейными формами и у 1-2% со спорадическими [Pasinelli P. et al., 2006]. При этом скорость прогрессии заболевания зависит от локализации мутации, например, для больных гомозиготных по замене D90A, характерна более медленная прогрессия заболевания, чем у больных с A4V мутацией [Rosen D.R. et al., 1994].

Кроме того, у пациентов с СОД1-БАС выявляют в первую очередь признаки поражения нижних мотонейронов [Ravits J. et al., 2013]. В норме локализованные в цитозоле и во внешнем митохондриальном пространстве функциональные гомодимеры белка СОД1 играют важную роль в механизмах клеточной защиты, обеспечивая дисмутацию супероксида токсичного продукта окислительного фосфорилировния. Исходя из этого, было сделано предположение о том, что оксидативный стресс может быть ведущим патогенетическим звеном СОД1-БАС [Barber S.C. et al., 2010].

Однако, последующее открытие других генов, несущих БАСассоциированные мутации, выявило новые механизмы развития повреждения нейронов.

TARDBP. У больных с БАС были выявлены мутации в гене TARDBP, кодирующем РНК-связывающий белок TDP-43 (TAR DNA-binding proteinTDP-43 белок размером 43 кДА имеет преимущественно ядерную локализацию, играет важную роль в транскрипции, процессинга и транспорта РНК. На основании проведенных исследований было выдвинуто предположение, что нарушения метаболизма и процессинга РНК могут быть лежать в основе возможных механизмов развития БАС.

[Sreedharan J. et al., 2008]. Мутации в гене TARDBP обнаруживают у примерно в 4% сслучаях наследственных форм БАС и 1% спорадических форм. [Lagier-Tourenne C. et al., 2010]. Это преимущественно миссенс мутации, наиболее часто они располагаются в шестом экзоне, кодирующем С-концевую часть белка, в которой локализован глицин богатый участок, необходимый для межбелковых взаимодествий (Рисунок 1). Мутации в гене TARDBP наследуются по доминантному типу и ассоциированы с развитием клинической формы заболевания, которая характеризуется поражением иннервации мышц верхних конечностей на начальной стадии заболевания и медленной прогрессией нейродегенеративнго процесса [Corcia P. et al., 2012].

FUS. Обнаружение БАС-ассоциированных мутаций в гене FUS, кодирующем другой РНК связывающий белок FUS (Fused in Sarcoma), дало дополнительное подтверждение гипотезе о важной роли нарушения процессинга РНК в патогенезе БАС [Шелковникова Т.А. et al., 2011;

Kwiatkowski T.J., Jr. et al., 2009]. Хотя многие из нормальных функций белка FUS остаются невыясненными, для него показана способность проникать через ядерную мембрану и участвовать в процессах транскрипции, сплайсинга и транспорта мРНК [Lagier-Tourenne C. et al., 2010; Zinszner H. et al., 1997]. Было выявлено примерно 50 точечных БАСассоциированных мутаций, большая часть которых располагается в экзоне 15, кодирующем С-концевой участок, в состав которого входит РНК связывающие домены и сигнал ядерной локализации (NLS). (Рисунок 1).

Также у больных с БАС был обнаружен вариант FUS с изменениями в 3’концевой нетранслируемой области (3’UTR), которая сопровождалась повышенной экспрессией функционального белка [Sabatelli M. et al., 2013].

Гораздо реже выявлаяются мутации, приводящие к экспрессии трункированной с C-конца формы бела FUS. Так, при мутации R495X экспрессируется укороченный на 31 аминокислоту белок, что сопровождается развитием тяжелого клинического фенотипа [Waibel S. et al., 2010]. В случае геномного варианта (10747 AG) в сайте сплайсинга для интрона 13 происходит удаление экзона 14 и преждевременное считывание STOP кодона при трансляции. Синтезируемый таким образом белок имеет лишь 466 аминокислоты (p.G466VfsX14). Для данной молекулярной патологии характерно развивитие бульбарной форма БАС с агрессивным течением [DeJesus-Hernandez M. et al., 2010]. Сходное клиническое течение наблюдается и у больных с наследственными формами БАС, у которых выявлена делеция участка гена FUS, кодирующая сигнал ядерной локализации (NLS) [Kent L. et al., 2014]. При этом важно отметить, что далеко не все мутации в гене FUS являются патогенными и могут быть выявлены у здоровых людей [Rutherford N.J. et al., 2012].

–  –  –

Рисунок 1 – Доменная структура РНК-связывающих белков FUS и TDP-43.

NES – сигнал ядерного экспорта; RRM – РНК-распознающий мотив; ZF – цинковый палец; NLS – сигнал ядерной локализации; цифрами обозначены номера остатков аминокислот на гарнице доменов.

Так же, как и для TARDBR, мутации в гене FUS выявлены только у 4% больных с наследственными формами и в 1% спорадических случаев.

Большая часть этих мутаций имеет доминантный тип наследования, исключением является редкая рецессивная мутация G517Q [Kwiatkowski T.J., Jr. et al., 2009]. У пациентов с FUS-БАС в первую очередь развиваются симптомы поражения нижних мотонейронов, а также бульбарный синдром. Для данной формы характерен ранний дебют и быстрая прогрессия заболевания [Al-Chalabi A. et al., 2013]. Примечательно, что было описано несколько случаев БАС ювенильным дебютом, c ассоциированных мутациями в гене FUS [Baumer D. et al., 2010]. Кроме и существуют и другие РНК-связывающие белки, FUS TDP-43 аберрантные формы которых могут быть вовлечены в патогенез БАС. В 2013 году были обнаружены мутации в областях, кодирующих прионоподобные домены белков hnRNPa1 и hnRNPa2b1, которые могут являться причиной развития мультисистемной протеинопатии и БАС [Kim H.J. et al., 2013]. В 2014 были обнаружены БАС-ассоциированные мутации в гене MATR3, кодирующем другой РНК-связывающий белок matrin-3 [Johnson J.O. et al., 2014]. Совсем недавно были выявлены точечные мутации в гене GLE1, кодирующем общий фактор процессинга мРНК hGle1 [Kaneb H.M. et al., 2015], которые также были аасоциированы с БАС.

Эти данные послужили основой для выдвижения гипотезы, согласно которой нарушениям метаболизма мРНК могут отводилась центральная роль в патогенезе БАС. Выявление точных молекулярных механизмов патогенетических процессов является актуальным направлением современных биомедицинских исследований.

C9orf72. Открытием, по значимости сопоставимое с выявлением роли измененного метаболизма РНК, является идентификация экспансированного гексануклеотидного повтора в локусе C9orf72 у больных с БАС. В некоторых популяциях данная мутация ассоциирована примерно с 40% семейных форм и 7% всех всех спорадических форм [Majounie E. et al., 2012]. Примечательно, что мутации в генах, кодирующих белки SOD1, TDP-43 и FUS, приводят главным образом к развитию моторной дисфункции и редко сочетаются с ФТД [Huey E.D. et al., 2012] [Katz J.S. et al., 2012]. При данной же патологии, напротив, характерно развитие ФТЛД и БАС-ФТЛД [DeJesus-Hernandez M. et al., 2011], что дополнительно указывает на патогенетическую связь между этими двумя заболеваниями. Характерная GGGGCC (G4C2) последовательность в норме обычно представлена в виде 2-19 повторов, а у больных число таких повторов увеличивается и достигает 250-1500. Но даже относительно небольшое увеличение количества повторов до 20-22 уже может приводить к развитию заболевания [Gomez-Tortosa E. et al., 2013]. Описаны случаи, когда у больных с БАС число повторов доходило до 2500-3000 [van Blitterswijk M. et al., 2013]. При том, что эти гексамерные последовательности не являются кодирующими, они транскрибируются.

Транскрипция таких повторов приводит к образованию экспансированных РНК, что в свою очередь ведет к нарушению процессинга РНК [Renton A.E. et al., 2011].

1.3.2 Дополнительные генетические факторы бокового амиотрофического склероза.

Мутации в генах, кодирующих протeасомные белки, также могут приводить к развитию БАС, хотя доля таких случаев для семейных и спорадических форм БАС не превышает одного процента. Среди протеасомных белков подобные нарушения показаны для валозинсодержащего белка (VCP) [Johnson J.O. et al., 2010], оптинейрина (OPTN) [Maruyama H. et al., 2010], убиквитина 2 (UBQLN2) [Deng H.X. et al., 2011] и p62 [Teyssou E. et al., 2013]. Эти данные говорят о том, что нарушение внутриклеточных механизмов контролируемой деградации и утилизации белков может быть дополнительным патогенетическим фактором в механизмах развития БАС. Более того, недавние исследования в этой области показали, что мутации в гене TBK1, которые раннее связывали с повышенным риском развития БАС [Cirulli E.T. et al., 2015], могут играть роль этиологиекогого фактора для некоторых форм заболевания [Freischmidt A. et al., 2015]. Возникновение подобных мутаций приводят к тому, что измененная форма TANK–связывающей киназы 1 (TANK1) не способна взаимодействовать с оптинейрином, что в свою очередь ведет к нарушению каскада взаимодействий, лежащих в основе путей внутриклеточной утилизации белка.

Кроме того, существуют и другие гены, которые возможно играют определенную роль в патогенезе некоторых форм БАС. Так с ювенильными формами БАС ассоциированы мутации в генах, кодирующих белки профилин 1 (PFN1), необходимый для поддержания нормальной структуры цитоскелета [Wu C.H. et al., 2012], алсин [Hadano S.

et al., 2001], спатаксин [Orlacchio A. et al., 2010], сенатаксин [Chen Y.Z. et al., 2004] и сигма неопиоидный рецептор первого типа (sigma 1) [Al-Saif A.

et al., 2011]. Мутации в генах ELP3 [Simpson C.L. et al., 2009], FIG4 [Chow C.Y. et al., 2009], DCTN1 [Munch C. et al., 2004], VAPB [Nishimura A.L. et al., 2004], NEFH [Al-Chalabi A. et al., 1999], ANG [Greenway M.J. et al., 2006] and CHCHD10 [Bannwarth S. et al., 2014] так же были описаны для некоторых случаев БАС, однако их непосредственная роль в развитии патологии остается неясной и не доказанной. Помимо вышеописанных мутаций при широкомасштабном медико-генетическом скрининге больных с БАС были выявлены de novo мутации. В качестве примера таких мутаций можо привести нарушение структурной области генов, кодирующих хроматин-регулирующие белки, в том числе белок CREST [Chesi A. et al., 2013]. Однако причинная роль выявленных мутаций для подавляющего большинства случаев остается не доказанной, что стимулирует дальнейшие активные исследования в данной области.

1.3.3 Генетические риски развития бокового амиотрофическогосклероза

Существует мнение, что кроме мутаций, которые общепризнанно ассоциированы с БАС, развитие заболевания может быть связано с индивидуальными генетическими особенностями. В результате полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) у больных с БАС были выявлены новые направления для дальнейшего скрининга. Так, повтор C9ORF72 был идентифицирован в результате исследования на 405 пациентах с БАС и большой контролной группе [Laaksovirta H. et al., 2010].

Кроме того, в ходе секвенирования экзома было показано, что редкий вариант гена тубулина 4A (TUBA4A) представлен гораздо чаще у больных с БАС [Smith B.N. et al., 2014]. Эти данные, вместе с уже описанными выше, дают основание рассматривать нарушение метаболизма и функции белков, участвующих в обновлении цитоскелета клетки, в качестве дополнительного патогенетического фактора в процессах прогрессии нейродегнеративных изменений при БАС [Cirulli E.T. et al., 2015].

При различных генетических причинах, вносящих вклад в развитие БАС, можно выделить существенные отличия на гистологическом уровне в формах данного заболевания. При этом фенотипическиме проявления для различных форм различаются между собой мало. Это дает основания полагать, что анализ молекулярно-биологических и гистологических факторов позволит получить исключительно ценную информацию для классификации форм БАС и разработки специфических методов их лечения.

Патологические включения при боковом амиотрофическом1.4.склерозе

Большинство форм БАС, как и других нейродегенеративных заболеваний, характеризуются присутсвием в тканях нервной системы различного рода патологических включений Т.Л., 1962;

[Бунина Скворцова В.И. et al., 2011; Скворцова В.И. et al., 2004; Alzheimer A. et al., 1995; Fischer U. et al., 1997]. При анализе препаратов из аутопсийного материала у больных с БАС в выживших мотонейронах были выявлены внутриклеточные включения белковой пророды [Яхно Н.Н. et al., 2002;

Яхно Н.Н. et al., 2010; Alves-Rodrigues A. et al., 1998; Kokubo Y. et al., 1999]. На ранних стадиях их изучения идентификация и классификация таких включений основывалась на описании морфологии, локализации и способности включений окрашиваться различными гистологическими красителями. Позднее, развитие иммунологии и применение иммуногистохимических и биохимических методов дало возможность получить дополнительные данные о белковом составе таких включений [Скворцова В.И. et al., 2005a; Скворцова В.И. et al., 2005b].

Тельца Буниной обнаруживают в выживших мотонейронах спинного мозга у больных со спарадическими формами БАС, и редко с семейными [Бунина Т.Л., 1962]. Эти небольшие эозинофильные структуры диаметром от 2 до 5 микрон локализованы в цитоплазме и дендритах нейронов, состоят из вещества с высокой электронной плотностью [Okamoto K. et al., 1993] и часто позитивны на цистаин С и трансферин [Mizuno Y. et al., 2006]. Однако, состав их до конца не изучен.

Аксональные сфероиды - хорошо детектируемые опухолеподобные образования на аксонах, содержащие компоненты цитоскелета и органеллы. Аксональные сфероиды выявляются не являются исключительно специфичными для БАС и выявляются при патогистологическом исследовании большинства типов патологий, сопровождающихся повреждением нейронов или нервной системы в целом [Coleman M., 2005]. При БАС подобные образования обнаруживают в аксонах верхних и нижних мотонейронов, при этом аксональные сфероиды положительно окрашиваются антителами на нейрофиламенты, убиквитин, синаптофизин и периферин [Schiffer D. et al., 1995].

Гиалиновые тельца (Hyaline conglomerate inclusions, HCIs) в основном можно обнаружить в нейронах моторной коры головного мозга, и, в меньшей степени, в мотонейронах спинного мозга. Было показано, что гиалиновые тельца содержат промежуточные филаменты - белки, входящие в состав цитоскелета: периферин и гиперфосфорилированные нейрофиламентные субъединицы. Такие включения очень часто обнаруживают в аутопсийном материале больных с SOD1-БАС [Hays A.P.

et al., 2006], однако их идентификация затруднена неоднородной иммунореактивностью [Shaw C.E. et al., 1997].

Убиквитинированные включения. Усовершенствование иммуногистохимических методик позволило идентифицировать цитоплазматические и внутриядерные убиквитин-положительные включения неамилоидного типа (UBIs) в выживших мотонеронах и глиальных клетках аутопсийного материала больных [Leigh P.N. et al., 1991]. Для данных включений характерно морфологическое разнообразие, они могут иметь клубкообразное строение, иметь круглую форму или напоминать тельца Леви, могут быть хвостатыми или палочкообразными.

Это наиболее распространенный тип патогистологических включений у больных и выявляется практически в 100% случаев спорадических форм БАС [Piao Y.S. et al., 2003]. Исследованию убиквитин-положительных включений придается важное значение в понимании скрытых патогенетических механизмов нейродегенеративного процесса при БАС.

При семейных SOD1-ассоциированных формах БАС у больных выявляется белок SOD1 в составе убиквитинированных включений [Jonsson P.A. et al., 2004], которые локализуются в цитоплазме мотонейронов и глии передних рогов спинного мозга [Kato S. et al., 1996] [Bruijn L.I. et al., 1997]. С использованием электронной микроскопии были выявлены SOD1 позитивные структуры в виде покрытых гранулами фибрил диаметром от 15 до 25 нм, ассоциированные со скоплениями нейрофиламентов. [Kokubo Y. et al., 1999]. Кроме того, SOD1 также был обнаружен в составе убиквитин-положительных включений и при некоторых редких спорадических формах БАС [Forsberg K. et al., 2010].

Однако, у большей части пациентов с БАС, не имеющих мутаций в гене выявленные убиквитин-положительные включения SOD1, SOD1 отрицательны [Mackenzie I.R. et al., 2007], что рассматривается в качестве свидетельствова существенных патогенетических различиях между SOD1 формой и другими формами БАС.

Белок TDP-43, имеющий в норме ядерную локализацию, был обнаружен в составе SOD1-негативных убиквитинированных включений в аутопсийном материале больных с БАС. Было установлено, что TDP-43 положительные включения выявляются примерно в 90% случаев БАС [Mackenzie I.R. et al., 2007]. Наличие их в поврежденных клетках нервной системы не характерно лишь для пациентов с мутацией в гене SOD1 [Mackenzie I.R. et al., 2007; Okamoto Y. et al., 2011]. При этом мутации в кодирующем белок TDP-43 гене TARDBP гораздо менее распространены, что прямо указывает на роль эндогенного полноразмерного белка TDP-43 в патофизиологии БАС [Lagier-Tourenne C. et al., 2010; Sreedharan J. et al., 2008]. В меньшем количестве TDP-43 позитивные убиквитинированные включения были обнаружены в гиппокампе, лобной и височной долях коры головного мозга у больных с БАС [Neumann M. et al., 2006].

Посредством биохимического анализа удалось получить данные, указывающие на то, что вовлеченный в патологический процесс нативный белок гиперфосфорилируется и претерпевает каспазное TDP-43 расщепление на 25и 35 кДа фрагменты белковой молекулы [Zhang Y.J. et al., 2009]. Вместе с этим, TDP-43 позитивные убиквитинированные включения в головном и спинном мозге различаются по количеству Cконцевых фрагментов агрегированного белка TDP-43. Так, для подобных включений в спинном мозге была показана повышенная реактивность к Cконцевым антителам, тогда как в головном мозге уровень связывания для C- и N-концевых антител была одинаковой [Igaz L.M. et al., 2008]. Эти данные послужили основой для предположения, что патогенной является аберантная укороченная форма белка TDP-43 25 размером кДА, которая накапливается в составе патогистологических включений.

Обнаружены формы БАС с третьим типом убиквитинированных включений: они не содержат TDP-43 и не содержат SOD1. Вместо этого они содержат в своем составе белок FUS, это часто, но далеко не всегда сочетается с мутациями в кодирующем его гене [Deng H.X. et al., 2010].

Стоит отметить, что одновременное присутствие FUS и TDP-43 в составе белковых агрегатов встречается крайне редко. [Deng H.X. et al., 2010].

Более того, для FUS включений в меньшей степени характерно их убиквитинирование. позитивные включения никогда не FUS обнаруживаются при что указывает на различия SOD1-БАС, патогенетических механизмов у этих форм [Deng H.X. et al., 2010].

C9ORF72 экспансия и дипептиды. У абсолютно подавляющего большинства больных с экспансией повтора на 9-й хромосоме C9ORF72 при патогистологическом исследовании выявляются TDP-43 позитивные включения.

Кроме того, в составе таких включений преисутствуют короткие дипептиды, образованные в результате RAN-трансляции (repeatassociated non-ATG initiated) G4C2 повторов, и эти дипептиды находятся в агрегированном нерастворимом состоянии [Mori K. et al., 2013]. БАС относят п протеинопатиям, и обнаружение подобного типа белковых депозитов, являющихся продуктами индуцированной агрегации, можно рассматривать в качестве дополнительного подтверждения ключевой роли белковой каскадной агрегации в патогенезе БАС. Установление же патогенетической роли этих дипептидов и понимание того, как формируются подобные структуры, необходимо для выявления спицефических мишеней, на основе которых станет возможна разработка патогенетической терапии данных форм БАС.

Патогенетические механизмы БАС1.5

Впервые БАС был описан 150 лет назад физиологом Жан-Мартеном Шарко [Rowland L.P. et al., 2001], которому удалось связать наблюдаемую у пациентов спастичность и патологию в спинном мозге. Им было предложено название: «амиотрофический», что отражает мышечную слабость и атрофию, «латеральный склероз» - из-за склеротизации передних и латеральных кортикоспинальных трактов, наблюдавшееся им у больных с БАС [Wijesekera L.C. et al., 2009]. Подробное исследование БАС и разаработки практических рекомендаций в нашей стране проводились выдающимися исследователями А.Я.Кожевниковым, Т.Л.Буниной, И.А.Завалишиным, М.Н.Захаровой [Бархатова В.П. et al., 1996; Бунина Т.Л., 1962; Завалишин И.А. et al., 1999; Завалишин И.А. et al., 1990;

Хондкариан О.А. et al., 1978].

Теперь уже не вызывает сомнения, что БАС - очень сложное и мультифакторное заболевание, которое может вызываться различными причинами. Молекулярные патогенезы различных форм могут различаться. Белки, вовлеченные в каскадные патологические процессы, функционально различны, и часто не оказывают очевидного влияния на развитие заболевания, что демонстрируется их отсутствием или совместным появлением в составе патологических включений. Открытие каждого белка, ассоциированного с БАС, расширяло наши знания о потенциальных механизмах заболевания. В настоящее время принято выделять пять основных факторов, исследование которых, как полагают, должно привести к прогрессу в понимании течения заболевания и прогрессу в разработке методов его лечения. Это нарушенный белковый обмен, измененный метаболизм РНК, митохондриальная дисфункция, дефекты аксонального транспорта, оксидативный стресс и активация иммунной системы. При этом до конца не понятно, насколько эти механизмы перекрываются и что все же является причинным фактором в патогенезе, а что сопутствующими, хотя и принципиально важными сопутствующими элементами патогенеза [Ling S.C. et al., 2013]. Поэтому в данном разделе рассматриваются основные этапы патогенеза для различных форм БАС-ассоциированных протеинопатий, которые связанны с установленными генетическими мутациями.

1.5.1 Гибель мотонейронов

Непосредственной причиной развития парезов при БАС является повреждение верхних и нижних мотонейронов. Однако литературные данные, касающиеся потери верхних мотонейронов рознятся, вероятно изза трудностей, связанных с идентификацией типов клеток в коре головного мозга, а также отсутствием единой методики и зоны измерения [Gredal O.

et al., 2000; Maekawa S. et al., 2004]. С данными же по нижним мотонейронам работать гораздо проще, так как они хорошо согласуются между полученнученными в различных лабораториях и удобно структурированы. Для больных с БАС характерна значительная потеря мотонейронов в двигательных ядрах, в частности, в ядрах тройничного, лицевого, языкоглоточного и добавочного нервов [DePaul R. et al., 1988].

Сложность в исследования механизмов специфической гибели мотонейронов добавляют данные о различной толерантности мотонейронов к нейродегенеративному процессу. Известно, что у пациентов с БАС дегенеративные процессы в ядрах глазодвигательного, отводящего и трохлеарных нервов существенно замедлены [Reiner A. et al., 1995]. Потеря нижних мотонейронов в передних рогах спинного мозга указывается в среднем 55% от нормального их числа, но при этом разброс составляет от 8% до 90% в зависимости от формы БДН и от стадии заболевания [Ravits J. et al., 2007]. По мере прогрессии заболевания, у больных с БАС наблюдается демиелинизация и снижение числа аксонов в передних корешках спинного мозга, и как следствие, их фиброз [Hughes J.T., 1982]. Проявление ранних клинических признаков, особенно мышечной слабости и атрофии, первоначально может быть связано с деиннервацией мышц, которая в свою очередь приводит нейрональной смерти [Fischer L.R. et al., 2004].

1.5.1 Белок SOD1

Как было описано выше, белок SOD1 экспрессируется в больших количествах во вех типах клеток и играет ключевую роль в процессе превращения токсичных продуктов окислительного фосфорилирования [McCord J.M. et al., 1969]. Кроме того, недавно было показано, что SOD1 участвует в сигнальном пути угнетения клеточного дыхания [Reddi A.R. et al., 2013]. После того, как в 1993 была установлена связь между мутациями в гене SOD1 и развитием БАС, внимание исследователей было сфокусировано на возможных токсических свойствах данного белка, дополнительно подкрепляемое данными, полученными на животных моделях [Turner B.J. et al., 2008].

Так у мышей со сверхэкспрессией человеческой БАСассоциированной формы SOD1 (G93A), развивался БАС подобный фенотип, который включал параличи, потерю мотонейронов передних рогов спинного мозга и преждевременную гибель на терминальных стадиях модельного заболевания [Gurney M.E. et al., 1994]. Более того, у мышей с высоким уровнем экспрессии мутантного мышиного SOD1 также отмечалось снижение моторных функций в сочетании с дегенерацией мотонейронов [Ripps M.E. et al., 1995]. Напротив, мыши с генетической инактивацией SOD1 нокаутные по этому гену имели нормальный фенотип, а предрасположенность к потере мотонейронов была выявлена у них при аксональной травме [Reaume A.G. et al., 1996]. Эти данные были подтверждены в исследованиях Bruijn, показавших, что развитие БАСассоциированного фенотипа зависит от экспрессии мутантной формы SOD1, тогда как количество эндогенного белка на прогрессию модельного заболевания не влияет [Bruijn L.I. et al., 1998]. Несмотря на то, что существуют убедительные данные о потенциальной болезньмодифицирующей роли белка SOD1 [Saccon R.A. et al., 2013], дисфункция этого была исключена из основных патогенетических факторов БАС. В большинстве последних обзоров рассматривается как SOD1-БАС отдельная редкая форма БАС с отличным от остальных форм механизмом развития. Патологическая агрегация мутантных форм SOD1 при БАС достаточно хорошо изучена [Saccon R.A. et al., 2013]. Аберрантный SOD1 в обход нормальных путей белковой деградации олигомеризируется и сливается в более крупные агрегаты, которые удалось воспроизвести в ряде трансгенных животных моделей [Watanabe M. et al., 2001]. Интересно, что нативный SOD1 также может подвергаться индуцированной агрегации и входить в состав белковых включений [Rotunno M.S. et al., 2013]. При этом остается не ясно, каким образом агрегированный белок SOD1 может влиять на прогрессию нейродегенеративного процесса. Аберрантные изоформы SOD1 теряют функции нормального белка, однако было показано, что активность фермента не влияет на дебют или прогрессию заболевания [Cleveland D.W., 1999], и это рассматривается в качестве указания на отсутствие его этиологической роли. По результатам изучения влияния аберрантного SOD1 было предложено несколько возможных патогенетических механизмов. Показано, что перегрузка убиквитинпротеасомной системы мутантными формами SOD1 [Robberecht W. et al., 2013] и стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный накоплением в цитоплазме токсичных промежуточных продуктов белковой агрегации, способны активировать процессы клеточной гибели [Nishitoh H. et al., 2008] [Lindholm D. et al., 2006]. Аберрантный SOD1 также способен образовывать агрегаты внутри митохондрий [Jaarsma D. et al., 2001] [Pasinelli P. et al., 2004], что ведет к их повреждению [Higgins C.M. et al., 2003] и подтверждает роль окислительного стресса в патогенезе БАС [Barber S.C. et al., 2010]. Более того, существуют данные, указывающие на то, что мотонейроны становятся более уязвимыми для глутаматопосредованной эксайтотоксичности при митохондриальной локализации мутантного SOD1 [Van Den Bosch L. et al., 2006]. На животных трансгенных моделях SOD1-БАС был показан дефицит аксонального транспорта и нарушение транспорта митоходрий в антероградном направлении [De Vos K.J. et al., 2007]. Также в исследованиях, проведенных на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs), полученных от пациентов с SOD1-БАС было показано нарушение процессов синтеза и распада нейрофиламентных белков [Chen H. et al., 2014].

1.5.2 Белок TDP-43



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Сафина Татьяна Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ ПОЛУШАРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА В РЕГУЛЯЦИИ ЭРГОТРОПНЫХ И ТРОФОТРОПНЫХ ФУНКЦИЙ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Гвоздева Алиса Петровна ИНЕРЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В СЛУХОВОЙ СИСТЕМЕ ПРИ ЛОКАЛИЗАЦИИ ПРИБЛИЖАЮЩЕГОСЯ ЗВУКОВОГО ОБРАЗА 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., в.н.с. Андреева Ирина Германовна САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ОГЛАВЛЕНИЕ стр. ОБЩАЯ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ И КОСМЕТОЛОГИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ АРИПОВА МУКАДДАМ ЛУТФИЛЛОЕВНА ОСОБЕНННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РОЗАЦЕА НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ОПИСТОРХОЗА (14.01.10 – КОЖНЫЕ И ВЕНЕРИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Хардикова С.А. Москва 2015 Стр. Список сокращений..4 Введение..5...»

«УДК 612.821 Каратыгин Николай Алексеевич Электрофизиологические корреляты различной результативности интеллектуальной деятельности 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Джебраилова Тамара Джебраиловна Москва –...»

«Митин Игорь Николаевич Психофизиологическая адаптация как ведущий фактор обеспечения безопасности дорожного движения 05.26.02. Безопасность в чрезвычайных ситуациях (медицина катастроф) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор В. Ю. Щебланов Москва,...»

«Фролов Александр Акимович Функциональные особенности респираторной системы в предродовом периоде и в родах в зависимости от стереоизомерии женского организма и их влияние на состояние плода 03.03.01 физиология 14.01.01 акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук...»

«Иванов Олег Олегович МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНОЙ ЭМУЛЬСИИ НА ГЕМОДИНАМИКУ ПРИ КОМАХ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ ОСТРЫМ ИНСУЛЬТОМ 14.03.03 – Патологическая физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Нагаева Элина Ильдаровна ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНДОВ ПРОТОН-АКТИВИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Тихонов Д.Б. Санкт-Петербург ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..4 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..6...»

«ЕРМОЛИН Сергей Петрович ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА ВОЕННОСЛУЖАЩИХ В УСЛОВИЯХ АРКТИЧЕСКОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 03.03.01 – Физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гудков А.Б. Архангельск 2015 стр. СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И...»

«Александрова Екатерина Михайловна ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМЫ «МАТЬ-ПЛАЦЕНТА-ПЛОД» ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТНИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ЖЕНЩИН Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук физиология – 03.03.01 Научный руководитель: д.м.н., профессор Т.Л. Боташева Научный консультант:...»

«ГОРШЕНЁВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ УГЛЕРОДНОГО НАНОСТРУКТУРНОГО МАТЕРИАЛА «ТАУНИТ» НА ОРГАНИЗМ САМОК БЕЛЫХ МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМСТВО 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Османов Эседулла Маллаалиевич доктор медицинских...»

«УЛЬЯНОВ Владимир Юрьевич ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И САНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ГОМЕОСТАЗА В ОСТРОМ И РАННЕМ ПЕРИОДАХ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ...»

«Хайбуллина Светлана Францевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА ХАНТАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: д.б.н., доцент Ризванов А.А. КАЗАНЬ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность исследования ГЛАВА 2. ОБЗОР...»

«ГУРЬЯНОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА ПОВЫШЕНИЕ ЗИМОСТОЙКОСТИ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЯБЛОНИ РЕГУЛИРОВАНИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ ПОКОЯ ОРГАНИЧЕСКИМ И МИНЕРАЛЬНЫМ ПИТАНИЕМ 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Воробьев Вячеслав Филиппович Москва 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 1....»

«ВОНДИМТЕКА ТЕСФАЙЕ ДЕССАЛЕГН ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ УПРАЖНЕНИЙ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ГОРНОЙ ГИПОКСИИ И СУБТРОПИЧЕСКОГО КЛИМАТА ЭФИОПИИ 03.03.01 Физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Т. Шаов Нальчик-2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«К О З ЛО В А ДАРЬЯ ИГОРЕВНА ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗЫ НЕПРИЛИЗИНА В МОЗГЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С п е ц и а л ьн о с ть 03.01.04 – биохимия 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук Научные руководители доктор биологических наук Журавин Игорь Александрович...»

«Шведов Денис Николаевич РАННИЕ ПРИЗНАКИ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У СТУДЕНТОВ-БАКАЛАВРОВ В ПРОЦЕССЕ УЧЕБНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Орел 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ШОШИНА ИРИНА ИВАНОВНА ЛОКАЛЬНЫЙ И ГЛОБАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЙ В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ 03.03.01 – физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: ШЕЛЕПИН ЮРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ, ДОКТОР МЕДИЦИНСКИХ НАУК, ПРОФЕССОР САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ПРОСТРАНСТВЕННО-ЧАСТОТНЫЙ АНАЛИЗ КАК МЕТОД...»

«ХИЖНЯК Роман Михайлович ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ (Zn, Cu, Co, Mo, Cr, Ni) В АГРОЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮГО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ ЦЧО Специальность: 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор сельскохозяйственных наук, профессор С.В. Лукин Белгород, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ЯБЛОНСКАЯ Елена Карленовна ЭКЗОГЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОДУКЦИОННОГО ПРОЦЕССА, КАЧЕСТВА ЗЕРНА И УСТОЙЧИВОСТИ К ФИТОПАТОГЕНАМ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант: Д.с.-х.н., профессор Котляров В.В....»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.