WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНДОВ ПРОТОН-АКТИВИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

На правах рукописи

Нагаева Элина Ильдаровна

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНДОВ

ПРОТОН-АКТИВИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ

Специальность 03.03.01 – физиология



Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Тихонов Д.Б.

Санкт-Петербург

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………………...4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

…………………………………………………..6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………..…..11 История открытия ASICs и филогения……….……………………………………..11 1.1.

Гены и субъединичный состав ASICs ………………………………………………15 1.2.

Строение и топология ………………………………………………………………..18 1.3.

1.3.1. До-кристаллическая эра ……………………………………………………..18 1.3.2. Пост-кристаллическая эра ……………………………………………………21

- Экстраклеточный домен (ЭКД) ……………………………………………22

- Трансмембранный сегмент и ионная пора ………………………………...24

- Механизм активации канала ………………………………………………..26 Локализация и участие в физиологических процессах ……………………………28 1.4.

1.4.1. ASICs в мозге ………………………………………………………………….28 1.4.2. Субклеточная локализация …………………………………………………...29 1.4.3. ASICs и синаптическая передача …………………………………………….30 1.4.4. Участие в синаптической пластичности …………………………………….32 1.4.5. Участие в обучении, памяти и тревожных состояниях …………………….33 1.4.6. Участие в патологических состояниях ЦНС ………………………………..35

- Ишемия головного мозга ……………………………………………………36

- Рассеянный склероз …………………………………………………………37

- Эпилепсия ……………………………………………………………………38 1.4.7. ASICs и боль …………………………………………………………………...39 Фармакология ASICs ………………………………………………………………...42 1.5.

1.5.1. Синтетические соединения …………………………………………………..42 1.5.2. Эндогенные модуляторы ……………………………………………………..47 1.5.3. Токсины из природных ядов …………………………………………………50 Обоснование работы …………………………………………………………………56 1.6.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………….

..59 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ………………………………………………..62

3.1. Действие гидрофобных моноаминов на гомомерные ASICs…………………………62 3.1.1. Действие на ASIC1а каналы…………………………………………………...62 3.1.2. Действие на ASIC2а каналы …………………………………………………..65 3.1.2. Сравнение действия соединений на нативные и рекомбинантные ASIC1a и ASIC2a каналы ………………………………………………………………………..67 3.1.3. Действие на ASIC1b каналы …………………………………………………..69 3.1.4. Действие на ASIC3 каналы ……………………………………………………71 Структурно-функциональный анализ ……………………………………………….75 3.2.

3.2.1. Действие аналогов 9-аминоакридина на ASIC1a и ASIC2a каналы ………..75 3.2.2. Действие аналогов фенилциклогексила на ASIC1a и ASIC2a каналы ……..78 3.2.3. Действие производных адамантана на ASIC1a и ASIC2a каналы ………….80 3.2.4. Выводы по структурно-функциональному анализу …………………………83 Анализ механизмов действия гидрофобных моноаминов на протон-активируемые 3.3.

ионные каналы ……………………………………………………………………………….84 3.3.1. Сравнение механизмов действия мемантина и 9-аминоакридина на гомомерные ASIC1a каналы …………………………………………………………84

- pH-зависимость действия …………………………………………………..87 3.3.2. Механизм потенцирующего действия ИЭМ-1921 на ASIC2a каналы ……..88

- pH-зависимость действия …………………………………………………..89 3.3.3. Потенциал-зависимость ингибирующего и потенцирующего действий …..90 3.3.4. Сочетание ингибирующего и потенцирующего эффекта в пределах одного канала ………………………………………………………………………………….92 3.3.4. Выводы по анализу механизмов действия гидрофобных моноаминов …....94 Новый эндогенный модулятор ASICs ………………………………………………95 3.4.

3.4.1. Действие гистамина на протон-активируемые ионные каналы …………....96 3.4.2. Действие гистамина на ASIC1a каналы ……………………………………...96

-Возможные механизмы потенцирующего эффекта гистамина………....98 Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………...100 ВЫВОДЫ …………………………………………………………………………………...106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………….107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ





ASIC(s) – acid-sensing ion channel(s) – протон-активируемый ионный(е) канал(ы) nASICs – native ASICs – нативные ASICs cASICs – chicken ASICs – куриные ASICs ЦНС – центральная нервная система ПНС - периферическая нервная система pH – водородный показатель PcTX – псалмотоксин 1 NMDA – N-метил-D-аспартат 9АА – 9-аминоакридин ИЭМ – институт экспериментальной медицины CHO клетки – Chinese hamster ovary – линия клеток яичника китайского хомячка ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота РНК – рибонуклеиновая кислота Deg/ENaC – дегенерин эпителиальные натриевые каналы ТМ – трансмембранный домен ЭКД – экстраклеточный домен DRG нейроны - dorsal root ganglion neurons - нейроны задних рогов спинного мозга рН50 – pH раствора, вызывающего 50% активацию IC50 – концентрация лиганда, вызывающая 50% ингибирования EC50 - концентрация лиганда, вызывающая 50% потенцирования PKA – протеинкиназа А PICK1 – связывающий протеинкиназу С-альфа белок PSD95 – белок постсинаптического уплотнения-95 AKAP150 – протеинкиназа А заякоревающий белок pKa – отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации кислоты АТФ – аденозинтрифосфат GABA – гамма-амино масляная кислота ВПСТ – возбуждающий постсинаптический ток ВПСП – возбуждающий постсинаптический потенциал миРНК – малая интерферирующая РНК CaMKII – кальмодулин-зависимая протеинкиназа II GMQ – 2-гуанидин-4-метилкуиназолин НПВС – нестероидные противовоспалительные средства DAPI – 4',6-диамидино-2-фенилиндол GFP – зелёный флуоресцентный белок

– постоянная времени цАМФ – циклический аденозинмонофосфат

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протон-активируемые ионные каналы (ASICs) относятся к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов и активируются в ответ на локальное закисление внеклеточной среды.

Впервые протон-вызванные ионные токи были описаны Крышталем и Пидопличко в 1980 году (Krishtal & Pidoplichko, 1980). Авторы предположили, что понижение pH внеклеточной среды активирует популяцию управляемых протонами ионных каналов. Долгое время отсутствие селективных антагонистов порождало различные гипотезы относительно природы протон-вызванных токов. И только клонирование протон-активируемых ионных каналов в середине 90-х годов определило их в новое семейство лиганд-управляемых рецепторов. С этого времени начались полномасштабные исследования по локализации, фармакологии и физиологии ASICs.

Протон-активируемые ионные каналы широко распространены как в периферической (ПНС), так и в центральной нервной системе (ЦНС) позвоночных животных. Плотность экспрессии тех или иных субъединиц сильно отличается в зависимости от локализации. Так, субъединицы ASIC1a, ASIC2a и ASIC2b чаще можно встретить в ЦНС, в таких областях как гиппокамп, миндалевидное тело, мозжечок, полосатое тело, кора больших полушарий и обонятельные луковицы (Alvarez de la Rosa et al., 2002; Bolshakov et al., 2002; Wemmie et al., 2003). В ПНС, напротив, преобладают ASIC1b и ASIC3 субъединицы; их можно встретить в чувствительных нейронах задних корешков спинного мозга, тройничного и блуждающего нервов. Ввиду столь широкого распространения, большое количество исследований показывают вовлечённость протонактивируемых ионных каналов во многие патологические и нормальные физиологические процессы, такие как восприятие болевых стимулов (Wemmie et al., 2006), процессы синаптической пластичности, страх и депрессия (Wemmie et al., 2004), наркотическая зависимость (Kreple et al., 2014). Стоит отметить, что все сведения о физиологической роли протон-активируемых ионных каналов являются косвенными, поскольку основаны на экспериментальных данных, полученных на нокаутных животных.

Основной проблемой в изучении функции, строения и механизмов работы ASICканалов является ограниченный набор фармакологических инструментов, способных избирательно влиять работу каналов с разным субъединичным составом. Так, на настоящий момент обнаружены специфмческие ингибиторы только для гомомеров ASIC1a и ASIC3 псалмотоксин 1 (PcTX1) (Escoubas et al., 2000) и токсин APETx2 (Diochot et al., 2004), соответственно. Таким образом, поиск и разработка стратегий синтеза новых специфических лигандов ASICs является актуальной научной задачей.

Обнаружение избирательных соединений даст ценный набор фармакологических инструментов для исследования физиологической функции протон-активируемых ионных каналов в ЦНС.

Цель и задачи работы. Ранее в лаборатории биофизики синаптических процессов ИЭФБ РАН был проведён скрининг гидрофобных моноаминовых соединений из числа блокаторов глутаматных рецепторов на наличие активности в отношении протонактивируемых ионных каналов. Именно этот класс соединений был выбран ввиду их простой химической структуры, включающей небольшую гидрофобную часть и терминальную аминогруппу. Такое строение предполагало решение сразу двух задач:

поиск избирательных агонистов/антагонистов среди синтетических соединений, а также движение в сторону выявления эндогенных модуляторов из числа соединений схожих по структуре с гидрофобными моноаминами (катехоламины, серотонин, гистамин и пр.).

В предварительных экспериментах на интернейронах гиппокампа крыс были обнаружены четыре блокатора NMDA рецепторов, способных также модулировать протон-вызванные токи через нативные ASICs (nASICs). Эти четыре соединения имели довольно схожие химические структуры, однако оказывали разнонаправленное действие на нативные рецепторы. Два из них, ИЭМ-1921 и ИЭМ-2117, увеличивали амплитуду тока через nASICs при совместной аппликации с кислым раствором. Другие два соединения, 9-аминоакридин и мемантин, напротив, ингибировали токи через nASICs.

Соответственно, данная работа стала логичным продолжением проекта, начатого в 2012 году на интеренейронах гиппокампа.

Целью работы является изучение действия гидрофобных моноаминов на протонактивируемые ионные каналы (ASICs), а также поиск эндогенных лигандов этих каналов.

В соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить действие четырёх найденных ранее соединений (9-аминоакридин, мемантин, ИЭМ-1921 и ИЭМ-2117) на все возможные гомомерные ASICs, экспрессированные в клетках линии CHO;

2. Выявить структурные компоненты гидрофобных моноаминов, определяющие их действие на протон-активируемые каналы разного субъединичного состава, используя структурно-функциональный подход;

3. Проанализировать механизм действия наиболее активных моноаминов:

потенциал-зависимость, кинетику действия, конкуренцию с агонистом;

4. Подобрать и протестировать эндогенные структурные аналоги исследованных соединений на активность в отношении ASICs.

Научная новизна. В данной работе впервые было показано и охарактеризовано действие нового химического класса лигандов протон-активируемых ионных каналов – гидрофобных моноаминов. Эти соединения, имеющие простую химическую структуру и состоящие из компактной гидрофобной части и терминальной аминогруппы, способны разнонаправленно модулировать работу всех функционально-активных гомомеров ASICs, в зависимости от субъединичного состава каналов.

Также были определены некоторые структурные детерминанты действия гидрофобных моноаминов на ASICs. Наличие протонируемой аминогруппы является критичным условием для реализации как ингибирующей, так и потенцирующей активности. Гидрофобная часть может варьировать, при этом V-образные структуры являются более эффективными потенциаторами ASIC2a каналов, чем плоские.

Расстояние между гидрофобной группой и аминогруппой определяет потенцирование ASIC1a и ASIC2а каналов. При наличии двух метиленовых спейсеров потенцируются ASIC1a каналы, а при непосредственном примыкании - ASIC2a. Кроме того, был начат анализ механизмов взаимодействия данного класса веществ с ASIC-каналами, показавший, что существует как минимум два различных механизма ингибирования – зависящий и не зависящий от потенциала мембраны.

Впервые был обнаружен эндогенный модулятор ASICs – гистамин, способный избирательно потенцировать ASIC1a каналы. Действие этого соединения зависело от pH активирующего раствора. Максимальное потенцирование достигалось при слабом закислении. Физиологическая роль данного эффекта может состоять в обеспечении существенного тока через ASIC1a каналы при незначительном закислении в процессе синаптической передачи.

Теоретическая и практическая значимость данной работы заключается в том, что открытие нового класса лигандов протон-активируемых ионных каналов значительно расширило набор фармакологических инструментов, позволяющих избирательно влиять на каналы разного субъединичного состава. Намеченные в данной работе направления (выявленные структурно-функциональные закономерности, комплексность механизмов действия, открытие эндогенного модулятора) сами по себе являются довольно ёмкими, и дальнейшее их изучение представляется перспективным как с точки зрения фундаментальной, так и прикладной науки. Открытие непосредственного действия гистамина на ASICs позволяет по-новому взглянуть на физиологию гистаминергической системы, на её взаимовлияние с другими типами рецепторов. Кроме того, открытие взаимодействия ASICs и гистамина, делает поиск новых модуляторов/активаторов ASICs среди эндогенных моноаминов и их метаболитов весьма перспективным, приближая, тем самым, к более глубокому пониманию физиологической роли данного семейства каналов.

Результаты работы могут быть использованы для чтения лекций по физиологии, биологии клетки и биофизике для студентов биологических и медицинских специальностей высших учебных заведений.

Основные положения, выносимые на защиту.

Гидрофобные моноамины – новый химический класс лигандов протонактивируемых ионных каналов, способных разнонаправленно модулировать их работу, в зависимости от субъединичного состава каналов.

Гистамин является избирательным эндогенным потенциатором ASIC1a, действие 2.

которого наиболее выражено при слабом закислении внеклеточной среды.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работах, 2 из которых – статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 1 статья в международном журнале), и 8 тезисов.

Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде устных и стендовых докладов на Международном конгрессе FENS Featured Regional Meeting (Чехия, Прага, 2013); на Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); на международной школе-конференции «Горизонты современной нейронауки» (Нижний Новгород, 2014); на девятом форуме европейской федерации нейробиологов 9th FENS Forum of Neuroscience (Милан, Италия, 2014); на IV съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Россия, 2014); на зимней международной научной школе «Современная биология и биотехнологии будущего» (Звенигород, Москва, 2015); на 11-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2015); на Международном конгрессе FENS Featured Regional Meeting (Салоники, Греция, 2015).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит общей характеристики работы, обзора литературы по исследуемой теме – глава 1, описания методики – глава 2, описания результатов исследования и их обсуждения – глава 3, заключения – глава 4, выводов и списка литературы, который включает 193 источника (из них 190 иностранных).

Работа иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. История открытия ASICs и филогения Постоянство внеклеточной среды является необходимым условием гомеостаза нервной системы и организма в целом. Её химический состав должен поддерживаться в строго определённых рамках, обеспечивая нормальную работу клеточных структур.

Одним из важнейших показателей, значение которого организму необходимо строго регулировать, является внеклеточная концентрация протонов. У большинства позвоночных в норме этот параметр, или водородный показатель (pH), равняется 7.4, но в результате нормальных или патологических процессов значение его может заметно варьировать. Логично было бы предположить, что в организме на этот случай имеются специальные pH-сенсоры, быстро реагирующие на изменение этого показателя.

Первое упоминание о токах, вызванных быстрым закислением внеклеточной среды, было сделано в 1980-м году Крышталем и Пидопличко (Krishtal & Pidoplichko, 1980). Они показали, что большая часть нейронов, выделенных из спинного и тройничного ганглиев крысы, активируется в ответ на изменение рН омывающего раствора с 7.4 до 6.9. При этом, входящие токи были следствием увеличения проницаемости мембраны для ионов Na+ и К+ (Na+ К+), их амплитуда увеличивалась с повышением концентрации протонов и достигала максимальной в точке pH=5.4. Позже этой же группой советских учёных подобные токи были описаны и в некоторых зонах мозга крысы (Врублёвский и др., 1985). Однако отсутствие избирательных фармакологических агентов и других конкретизирующих методов не позволяло сделать окончательный вывод о существовании нового типа ионных каналов. Доказательство было получено с расцветом молекулярной биологии в середине 90-х годов. Лаздунски с соавторами выделили из мозга крысы участок ДНК, кодирующий последовательность длиной в 526 аминокислоты и экспрессировали комплементарную РНК в ооцитах лягушки Xenopus laevis (Waldmann et al., 1997а). В результате этой манипуляции ооциты стали чувствительны к изменению pH внеклеточной среды: аппликация раствора с pH ниже 6.9 вызывала быстро нарастающий и спадающий вследствие десенситизации ток, подобный тому, который был ранее описан в чувствительных нейронах (Krishtal & Pidoplichko, 1981; Konnerth et al., 1987). Тогда же и было дано название этим рецепторам, характеризующее их как ионные каналы, чувствительные к закислению среды (Acid Sensing Ion Channels или сокращённо ASICs). Это название прочно закрепилось в научной литературе, однако оно не является вполне корректным, поскольку другие ионные каналы также могут реагировать на изменение pH внеклеточной среды. Многие каналы TRP семейства, характеризующиеся полимодальностью активирующих стимулов, изменяют свою активность в присутствии повышенной концентрации протонов (Numata et al., 2011). Кроме того, протоны ингибируют нативные NMDA рецепторы с IC50 в районе pH = 7.2, вследствие чего около 40% каналов неактивны при физиологических значениях рН (Tang et al., 1990; Traynelis & Cull-Candy, 1990). В связи с этим, в данной работе будет использовано альтернативное название ASICs - “протон-активируемые ионные каналы” (proton-gated ion channels), которое также используется в англоязычной литературе и более корректно описывает рассматриваемый тип рецепторов.

Протон-активируемые ионные каналы - это катионные потенциал-независимые, амилорид-чувствительные ионные каналы, активирующиеся в ответ на увеличение внеклеточной концентрации протонов. Основываясь на данных генетического сиквенса и сходстве вторичной структуры белка, ASICs относят к суперсемейству дегенерин эпителиальных натриевых каналов (DEG/ENaC), к которому также принадлежат эпителиальные натриевые каналы (ENaC), FMRF-амид активируемые каналы (FaNaC) беспозвоночных, PPK (pickpocket) каналы Drosophila melanogaster, дегенирины (DEG) Caenorhabitis elegans, а также hiNaC (human intestine Na+ channels - человеческие Na+ каналы кишечника) и BLINaC (brain- liver-intestine amiloride-sensitive Na+ channel Na+ мозговые печёночные кишечные амилорид-чувствительные каналы)

- млекопитающих (Kellenberger & Shild, 2002). Последние два типа рецепторов не так давно были переименованы в BASIC (bile acid-sensetive ion channels), поскольку было обнаружено, что они активируются под действием желчных кислот (Lefevre et al., 2014).

Загрузка...

Такое название им было дано потому, что их гомология с ASICs по аминокислотной последовательности несколько выше, чем у эпителиальных натриевых каналов, хотя они не способны активироваться в ответ на понижение рН. Для всех представителей семейства Deg/ENaC каналов характерна общая вторичная структура белка: короткие NH2 и COOH терминальные цитоплазматические концы, два трансмембранных домена (ТМ1 и ТМ2) и большой внеклеточный цистеин-богатый участок, составляющий более 50% всего белка (Canessa et al., 1994a; Jasti et al., 2007).

Недавнее исследование эволюции генов суперсемейства DEG/ENaC, показало, что эти гены встречаются во всех секвенированных геномах представителей царства Животных (Metazoa). Кроме того, DEG/ENaC гены были найдены в эукариотическом микроорганизме Naeglaria gluberi (Studer et al., 2011). Согласно другому генетическиэволюционному исследованию, проведённому большой группой учёных и опубликованному в журнале Nature (Putnam et al., 2008), гены ASICs accn1-4 и четыре гена ENaC (,, и ) каналов были получены путём двух-раундовой дупликации цельного генома на этапе зарождения позвоночных животных. Напротив, ген accn5, кодирующий BASIC каналы, обнаруживается задолго до появления позвоночных.

Интересно, что у млекопитающих не существует ортологов FaNaC генов улитки Helix aspersa или ортологов PPK кодирующих генов Drosophila, что, по всей видимости, указывает на раннюю дивергенцию генов суперсемейства DEG/ENaC каналов (Рис.1.1).

Рисунок 1.1.

Филогенетическое дерево суперсемейства дегенирин эпителиальных натриевых каналов. Тёмно-серым показаны DEG/ENaC гены позвоночных животных, серым эукариотического микроорганизма Naeglaria gluberi (из Studer et al., 2011)

1.2. Гены и субъединичный состав ASICs Гены, кодирующие ASICs, были идентифицированы у многих видов позвоночных животных, начиная с круглоротых. На данный момент у млекопитающих известно 4 гена accn1-4, кодирующих как минимум 6 различных субъединиц: ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 и ASIC4. Первые две названные субъединицы являются альтернативными вариантами сплайсинга одного и того же гена accn2 и отличаются только последовательностью аминокислот, формирующей N-терминальный конец (Bssler et al., 2001). При этом, они сильно различаются как по биофизическим характеристикам, так и по профилю экспрессии. Например, крысиные ASIC1a каналы большей степени проницаемы для Na+, чем для K+ (PNa/PK = 7.8), и гораздо менее проницаемы для Ca2+ (PNa/PCa =18.5), широко распространены в центральных отделах нервной системы и могут входить в состав гетеромерных каналов. ASIC1b в основном встречаются в сенсорных нейронах периферических ганглиев, гораздо более избирательны к ионам Na+, чем K+ (PNa/PK = 14), и не пропускают ионы Ca2+.

Ген accn1 вследствие посттранскрипционной модификации даёт два продукта субъединицы ASIC2a и ASIC2b. Как и в случае с ASIC1 родственные субъединицы отличаются по своим свойствам, и самым важным отличием является неспособность ASIC2b формировать функционально активный гомомерный канал (Lingueglia et al., 1997). Однако в центральной нервной системе позвоночных часто встречаются гетеромеры ASIC1a/2b, которые имеют характеристики, отличные от каналов, в состав которых входит только субъединица ASIC1a. Интересно, что последовательности ASIC2a и ASIC2b отличаются по первым 185 аминокислотам с N-терминального хвоста.

Принимая во внимание, что то же самое наблюдается и для сплайс-вариантов ASIC1, можно предположить, что именно этот участок белка отвечает за ионную селективность и активацию канала. Кроме того, схожий механизм образования альтернативных вариантов сплайсинга для двух разных генов одного семейства, может говорить об эволюционно более раннем его формировании, предшествующем дупликации первичного гена.

Ген accn3 впервые был клонирван в 1997 году Лаздунски с соавторами из DRG-нейронов (Dorsal Root Ganglion neurons - нейроны задних рогов спинного мозга) (Waldman et al., 1997). В связи с этим продукт клонированного гена изначально получил название DRASIC и в дальнейшем был переименован в ASIC3. В результате транскрипции гена accn3 в нервной системе позвоночных животных, кроме человека, образуется один единственный белок длиною в 533 аминокислоты, имеющий 53% идентичности по нуклеотидной последовательности с ближайшим родственным геном accn2. Уникальным свойством каналов ASIC3 является наличие равновесной десенситизации, вследствие чего ток через эти каналы можно условно разделить на стационарный и пиковый компоненты. В связи с этим считается, что ASIC3 вносит вклад в болевую чувствительность пролонгированного действия, связанную с воспалением, травмами и постоперационными повреждениями (Deval et al., 2008; Yen et al., 2009; Deval et al., 2011). У человека обнаружено три различных белковых продукта гена accn3 (ASIC3a, -3b и -3с), различающихся по С-концевому внутриклеточному домену (Deval et al., 2010). Наиболее широко распространённой субъединицей является ASIC3a, и в отличие от крысиных ASIC3, у человека эта субъединица широко распространена не только в периферических сенсорных нейронах, но и в центральной нервной системе (Delaunay et al., 2012).

Субъединица ASIC4 кодируется геном accn4, который был впервые клонирован в 2000 году (Grnder et al., 2000). Продукт этого гена длиной в 539 аминокислоты имеет все признаки строения семейства DEG/ENaC каналов: два трансмембранных домена, короткие цитоплазматические N- и C-концы и большую внеклеточную цистеин-богатую петлю. Несмотря на это, ASIC4 лишь на 45% гомологичен по последовательности всем остальным представителям подсемейства ASICs и не способен активироваться в ответ на повышение концентрации протонов в среде. Не известно также входит ли он в состав функционирующих гетеромерных каналов, подобно ASIC2b субъединице. Транскрипты гена accn4 были идентифицированы во многих отделах ЦНС и спинного мозга позвоночных, при этом отмечается их полное отсутствие в DRG нейронах. Уровень экспрессии этого белка довольно низок в отделах ЦНС, где он был обнаружен, за исключением гипофиза, эндокринную функцию которого он, возможно, способен модулировать. Показано, что ASIC4 влияет на уровень экспрессии ASIC1a на поверхности мембраны CHO-клеток в случае коэкспрессии этих субъединиц (Donier et al., 2008). Однако недавние работы с нокаутными животными опровергли эти данные, показав, что отсутствие в организме ASIC4 субъединицы никак не сказывается на выраженности эпилептических припадков и реакции замирания, обусловленной страхом, - ASIC1a-опосредованных процессах (Lin & Chen, 2015). На сегодняшний день ASIC4 является наименее изученным представителем подсемейства протонактивируемых ионных каналов.

На настоящий момент установлено, что функционально активный канал является тримером (Jasti et al., 2007; Baconguis & Gouaux, 2012; Bartoi et al., 2014) и может состоять как из одинаковых субъединиц (гомотример), так и из разных (гетеротример).

Только ASIC1a, -1b, -2a и -3 субъединицы способны формировать рабочие гомомерные каналы; ASIC2b входит в состав функционирующих гетеромерных каналов, но не способен активироваться протонами в гомомерном состоянии. ASIC4 субъединица также неактивна в гомомерном состоянии, и кроме того не была найдена в составе гетеротримерных каналов (Grnder et al., 2000).

В зависимости от субъединичного состава, биофизические характеристики каналов сильно различаются. Хесселагер с соавторами (Hesselager et al., 2004) экспрессировали все возможные варианты гетеро- и гомотримерных (за исключением ASIC4) каналов ASIC крысы в линии клеток яичников китайского хомячка (CHO-K1), с целью выяснить влияние гетеромеризации на основные свойства протон-активируемых ионных каналов. Поскольку в нашей работе мы имели дело исключительно с крысиными гомомерными каналами, экспрессированными в CHO клетках, целесообразно будет описать данные вышеупомянутой статьи, однако только для гомомерных вариантов каналов. Самыми чувствительными к закислению среды из функционально-активных гомомеров оказались ASIC3 - 50% от максимальновозможной амплитуды наблюдалось при рН=6.4 (рН50). ASIC2a, напротив, не активировались, пока pH раствора не понижался до 5.2, при этом рН50 был равен 4.5.

Два варианта альтернативного сплайсинга гена accn2 характеризовались средней чувствительностью к рН раствора и не сильно отличались друг от друга по этому параметру: рН50 для ASIC1a составил 5.8, для ASIC1b рН50 равнялся 6.1. Однако две родственные субъединицы сильно отличались по значению коэффициента Хилла (nH) параметра отражающего кооперативность связывания молекул лиганда с лигандсвязывающим сайтом рецептора (Hill, 1910). Согласно этим данным, связывание первого протона с каналом ASIC1а никак не влияет на дальнейшее связывание дополнительных молекул лиганда, поскольку коэффициент Хилла для этого канала находится в районе единицы (nH=0.75). Для канала ASIC1b, напротив, характерно кооперативное связывание молекул лиганда, так как коэффициент Хилла больше единицы и равняется 4.8.

Разные по составу каналы ASICs отличаются по кинетике спада ответа (скорости десенситицации рецептора), однако все они являются быстроактивирующимися каналами и максимальная амплитуда ответа достигается за десятые доли секунды. При этом скорость десенситизации сильно зависит от pH активирующего раствора, увеличиваясь с увеличением концентрации протонов. Сводная таблица по всем изученным параметрам четырёх различных гомомеров приведена ниже (Табл. 1). Из неё видно, что самыми медленными по кинетике десенситизации являются ASIC2a гомомеры, ASIC1a и ASIC1b слабо отличаются по этому параметру, а наиболее быстрой десенситизацией обладают ASIC3 каналы, а точнее пиковый компонент их тока.

–  –  –

1.3. Строение и топология Как говорилось в предыдущем разделе, семейство ASICs имеет характерную для всех представителей дегенерин/эпителиальных натриевых каналов топологию белка относительно мембраны клетки. Рассмотрим её более подробно.

1.3.1. До-кристаллическая эра Протон-активируемые ионные каналы состоят из 500-560 аминокислот.

Первичная структура белка включает в себя два трансмембранных участка (ТМ1 и ТМ2) в среднем по 20 аминокислот каждый, которых вполне достаточно для пронизывания липидного бислоя мембраны, два коротких цитоплазматических N- и С-конца по 35-90 аминокислот каждый и большой (~370 а.к.) экстраклеточный домен, соединяющий два трансмембранных участка (Рис.1.2) (Saugstad et al., 2004). Первый экзон, кодирующий внутриклеточный N-конец, ТМ1 и начало экстраклеточной петли (~1/3), является наиболее вариабельным и именно он различается у альтернативных сплайс-вариантов генов accn1 и accn2. Экзоны, кодирующие последующие 2/3 части белка, довольно схожи у всех ASICs и являются ключевой характеристикой, объединяющей данную группу каналов в одно семейство. Этот же участок содержит консервативные цистеиновые остатки экстраклеточной петли, которые, предположительно, стабилизируют её структуру за счёт формирования дисульфидных мостиков (Firsov et al., 1999).

Практически все мембранные белки содержат как минимум один N-гликан в экстраклеточном домене, который необходим для правильного фолдинга белков, стабилизации их вторичной структуры и внутриклеточной транспортировки (Helenius & Aebi, 2004). Все ASICs также содержат хотя бы один сайт N-гликозилирования (Асн-акСер/Тре, где ак - это любая аминокислота кроме пролина).

Известно, что ASIC2a имеет два сайта N-гликозилирования в дистальной части экстраклеточной петли (Saugstad et al., 2004). При мутации, приводящей к потере обоих рецептор способен встраиваться в мембрану и формировать N-гликанов, функционально-активный гомомерный канал. При этом амплитуда тока снижается в три раза, а чувствительность к pH падает на 0.

6 единиц. Последовательности, кодирующие эти сайты гликозилирования, остаются консервативными и в гене accn2. В случае субъединицы ASIC1a их также два и отсутствие этих последовательностей не приводит к полной недееспособности канала. У ASIC1b помимо двух дистальных N-гликанов обнаруживаются ещё два дополнительных сайта N-гликозилирования в проксимальной части эктодомена. В отсутствие этих двух последовательностей, гомомерный ASIC1b канал не способен экспрессироваться в мембране (Kadurin et al., 2008). По всей видимости, это не связано с нарушением транспортировки белка от эндоплазматического ретикулюма, поскольку в случае ASIC1a и ASIC2a эти сайты отсутствуют, а встраивание канала всё же происходит. Соответственно, два проксимальных N-гликана ASIC1b отвечают за правильный фолдинг белка и стабилизацию его структуры, что подтверждает принципиальное различие во вторичных структурах двух сплайс-вариантов одного и того же гена accn2.

–  –  –

Рисунок 1.2.

Топология субъединицы ASIC1a (из Wemmie et al., 2006) Согласно проведённым исследованиям (Adams et al., 1999; Paukert et al., 2004), в формировании селективного фильтра канала участвует внеклеточная часть второго трансмембранного сегмента (Kellenberger et al., 1999; Sheng et al., 2001). Самая узкая часть поры канала находится в середине ТМ2 и образована остатками всего трёх аминокислот с коротким боковыми цепями, общих для всех ASICs - Гли-Ала-Сер (в порядке от N- к C-концу, Гли442-Сер444 у крысы). Однако, несмотря на полную гомологию этого участка, селективность разных субъединиц всё же отличается. Так, ASIC1a способны пропускать ионы Ca2+, а ASIC1b не способны. Бэсслер с соавторами показали, что различие в селективности связано с различием последовательности Nтерминального участка (Bssler et al., 2001) двух родственных субъединиц. Поскольку, этот участок определяет вторичную структуру белка, предполагается, что он также способен изменять форму селективного фильтра за счёт дальних аллостерических взаимодействий.

Гораздо меньше известно о функции С-концевого фрагмента одиночной субъединицы протон-активируемых ионных каналов. Часто он бывает довольно коротким (~40 аминокислот) и, по всей видимости, необходим для внутриклеточной регуляции активности рецептора. Так, показано, что именно там находится PDZсвязывающий участок, ответственный за связывание PDZ-содержащих внутриклеточных регуляторных белков (PICK1, PSD95, CIP и тд.), которые способны увеличивать/уменьшать ток через каналы, не изменяя при этом их основных характеристик (Lingueglia E., 2007).

Таким образом, до появления первой кристаллической структуры ASIC канала была определена его мембранная топология, разделяющая белок на три условные части:

N- и C- внутриклеточные участки, 2 трансмембранных домена и большую экстраклеточную петлю. Тем не менее, было неясно, сколько субъединиц должно входить в функционально активный канал. Исследования, направленные на выяснение этого вопроса были предприняты относительно каналов ENaC и FaNac (Coscoy et al., 1998). Однако результаты были противоречивыми: одни данные указывали на то, что рецепторы семейства DEG/ENaC являются тетрамерами (Coscoy et al., 1998; Firsov et al., 1998; Anantharam & Palmer, 2007), другие же предполагали нонамерный состав (Snyder et al.,1998; Staruschenko et al., 2004).

1.3.2. Пост-кристаллическая эра Ответ на главный стехиометрический вопрос стал очевиден, когда в 2007 году впервые был получен рентген кристаллической структуры канала ASIC1a курицы (Jasti et al., 2007). Для того чтобы кристаллизовать канал и получить его структуру с разрешением в 1.9, учёным пришлось сделать делеционного мутанта, у которого большая часть N- и C-концов отсутствовала. То есть это был не вполне функциональный канал, не способный проводить протон-вызванные токи. В связи с этим, позже был получен кристалл функционирующего мутанта с более низким разрешением (3 ), без C-конца, но сохранившего N-конец и входящий в него участок, необходимый для открытия канала (Gonzales et al., 2009). Главное различие этих двух мутантов заключалось в более симметричном расположении трансмембранных доменов в функционально активном канале. Эти два исследования дополнили друг друга:

структура высокого разрешения дала информацию о точном строении экстраклеточного домена, а строение трасмембранных сегментов и ионной поры стало понятным благодаря кристаллу функционирующего канала. Оба белка были кристаллизованы при низких pH (5-6 и 6.5 соответственно). В таких условиях куриный ASIC1a канал находится в десенситизированном состоянии, следовательно, оба кристалла представляют собой десенсетизированную конформацию рецептора.

Главным неожиданным открытием стало то, что ASIC1a в обоих исследованиях состоял из трёх одинаковых субъединиц, то есть являлся гомотримером. Позднее это было подтверждено изображениями, полученными при помощи атомно-силового микроскопа (Carnally et al., 2008).

Экстраклеточный домен Экстраклеточный домен (ЭКД) каждой субъединицы напоминает сжатую человеческую руку, которая крепится к мембранным сегментам посредством подвижного “запястья”. Видимо, учитывая такое сходство, авторы статьи о первой кристаллической структуре описали ЭКД в терминах человеческой кисти, держащей мяч. Впоследствии эта терминология стала общепринятой, поскольку оказалась довольно удобной. ЭКД можно разделить на пять субдоменов: “ладонь” - palm домен, “палец” - finger домен, “большой палец” - thumb домен, “сустав” - knuckle домен и домен под названием “би-болл” (-ball) (Рис.1.3).

Каждая субъединица контактирует с соседней за счёт palm домена, который образует контакт c thumb доменом соседней субъединицы. Известны конкретные аминокислотные взаимодействия между соседними субъединицами: 1) водородные связи между Асп79 одной субъединицы и Гис74 и Гли421 прилегающей субъединицы; 2) взаимодействия между петлями -цепей palm домена одной субъединицы и С-концом 5 спирали thumb домена другой; 3) взаимодействия между 6 спиралью knuckle домена, которая как бы окутана вогнутой поверхностью finger домена соседней субъединицы.

Большинство дисульфидных связей расположено в области thumb домена, делая его А Б Рисунок 1.3. А, пространственное расположение частей одной субъединицы в терминах «руки». Б, изображение субъединицы ASIC1a канала курицы в виде -спиралей и -листов, с указанием отдельных аминокислотных остатков, описанных в тексте (из Jasti et al., 2007).

наименее гибкой структурой. Поскольку thumb домен также контактирует с подвижным “запястьем” (wrist) посредством консервативного Трп288, то за счёт своей жёсткости он может максимально точно преобразовывать конформационные изменения, происходящие в ЭКД, и изменять тем самым, состояние ионной поры.

Важной особенностью структуры экстраклеточного домена является наличие так называемого “кислотного кармана” (acidic pocket) - скопление кислых аминокислот в одном небольшом участке. Он располагается на расстоянии 45 от трансмембранного участка и образован взаимодействиями между thumb, -ball и finger доменами одной субъединицы и частью palm домена соседней субъединицы. Внутри этого “кармана” три пары кислых аминокислот (Асп238-Асп350, Глу239-Асп346 и Глу220-Асп408 на palm домене прилегающей субъединицы) находятся на очень близком расстоянии (2.8 ), а их боковые цепи образуют карбоксил-карбоксильные связи (Рис. 3Б). На таком небольшом расстоянии между двумя карбоксильными группами будет существовать сильный отрицательный электростатический потенциал. Это наводит на мысль, что именно там и должен находиться протон-связывающий сайт, поскольку, чтобы избавиться от этого отрицательного потенциала, необходимо связать хотя бы один протон. Кроме того, эти пары аминокислот расположены так, что способны при малейшем изменении своего энергетического состояния вызвать конформационные изменения в thumb домене, который в свою очередь вызовет конформационные изменения в “запястье” и далее в трансмембранном домене.

Изначально так и предполагалось, что в физиологических условиях, когда канал закрыт, кислые аминокислоты в “кислотном кармане” находятся на максимально удалённом друг от друга положении в силу отталкивания между ними. В момент понижения pH внеклеточной среды, некоторые их этих остатков протонируются, расстояние между ними уменьшается, и это влечёт за собой конформационные изменения, приводящие к открытию поры. Однако позже было показано, что помимо “карманных” аминокислот в области нижней части palm домена есть ещё несколько аспарагиновых, глутаминовых и гистидиновых остатков, pKa которых находится также в пределах pH, активирующих ASIC1 каналы (Liechti et al., 2010). Кроме того, полное удаление всех трёх пар “карманных” аминокислот резко снижает чувствительность рецептора к протонам, но не влияет на его способность активироваться в ответ на сильное закисление внеклеточной среды (Li et al., 2009). В связи с этим, на данный момент считается, что в пределах одной субъединицы существует несколько протончувствительных участков, ответственных за связывание агониста и дальнейшую активацию канала (Рис.1.3.Б).

Трансмембранный домен и ионная пора Трансмембранный сегмент образован шестью -спиралями - по две (ТМ1 и ТМ2) от каждой из трёх субъединиц, входящих в состав функционирующего ASIC канала.

Трансмембранные домены каждой субъединицы участвуют в формировании поры канала. ТМ2 непосредственно выстилает просвет ионной поры, в то время как ТМ1 выполняет опорную роль, контактируя с липидным бислоем и образуя множество связей с ТМ2 той же молекулы и ТМ2 и ТМ1 сегментами соседней субъединицы. Только небольшая часть С-концевого участка ТМ1 домена непосредственно выстилает пору канала (Li et al., 2011).

Просвет канала, способный пропускать положительно заряженные ионы, разделяется на экстраклеточный (приблизительно 12 в высоту и 8 в ширину) и внутриклеточный (~10х15 ) вестибюли посредством, так называемых, “ворот десенситизации” (Gonzales et al., 2009). Это сужение ионной поры образовано частью ТМ2 сегментов всех трёх субъединиц, а именно остатками аминокислот с Асп 433 по Гли436. Этот участок, как и весь ТМ2 домен, высоко консервативен для всех представителей ASICs и DEG/ENaK каналов в целом (Kellenberger & Schild, 2002).

Кроме того, давно известно, что остаток аминокислоты, предшествующий “воротам десенситизации” - Гли432 (для куриного ASIC1) - критичен для открытия большинства эпителиальных натриевых каналов. Впервые это было установлено, когда мутации, заменяющие эту аминокислоту в канале DEG-1 нематоды Caenorhabditis elegans, давали конститутивно-открытый канал и приводили к нейродегенерации (отсюда и название “Deg”) (Chalfie & Wolinsky., 1990). Мутации в соответствующем участке некоторых субъединиц ASICs также приводят к конститутивной активности, замедленной десенситизации или изменениям в pH-чувствительности (Waldmann et al., 1996;

Champigny et al., 1998; Adams et al., 1999). Однако, несмотря на близкое расположение Deg остатка к узкому участку ионной поры, эти мутации никак не отражаются на ионной селективности ASICs (Li et al., 2011a). Всё это говорит о том, что самый узкий участок вестибюля активированного канала, ответственный за ионную избирательность, находится в другой части белка. Действительно, серия изящных экспериментов над каналами ASIC1 миноги, в ходе которых определённые аминокислотные остатки ТМ2 участка при помощи сайт-направленного мутагенеза поочередно заменялись на цистеин (цистеиновое сканирование), выявила, что самая узкая часть ионной поры у открытого канала и закрытого образована разными аминокислотными остатками (Li et al., 2011a).

Если в закрытом и десенситизированном состоянии канала самая узкая его часть начинается с Асп433, то у открытого состояния наименее проходимый участок расположен несколько глубже в поре и образован остатками Гли443-Ала444-Сер445.

Авторы этой работы также утверждают, что селективный фильтр не является постоянной структурой: он собирается в момент активации канала за счёт конформационных изменений в ТМ2 домене, приводящих к его выпрямлению относительно плоскости мембраны (Рис. 1.4), и пропадает в момент десенситизации рецептора.

Рисунок 1.4.

Схематическое изображение положения трансмембранных участков в открытом и десенситизированном состоянии канала. В непроводящем канале второй трансмембранный сегмент находится в надломленном состоянии и состоит из двух условных частей (на рисунке обозначено TM2a и TM2b). В момент активации, ТМ2 участок распрямляется, пора канала становится шире, а остатки Сер445-Ала444- Гли443 (SAG) поворачиваются внутрь канала, формируя селективный фильтр (из Kellenberger & Grutter, 2015).

Механизм активации канала На данный момент получены четыре различные кристаллические структуры куриного ASIC1 канала (cASIC1) для десенситизированного и открытого состояний, кристаллизованного отдельно (Jasti et al., 2007; Gonzales et al., 2009) или в момент взаимодействия с одним из двух токсинов - PcTx1 и MitTx (Baconguis & Gouaux, 2012;

Baconguis et al., 2014). Эти и другие исследования, использующие сайт-направленный мутагенез и запись ионных токов через полученные мутантные каналы, позволили построить модель механизма активации рецептора. Во время повышения концентрации протонов во внеклеточной среде, происходит одновременное протонирование нескольких аминокислотных остатков, расположенных в разных доменах: в finger домене, “кислотном кармане”, нижней части palm домена и в области “запястья”.

Изменение энергетического статуса этих областей вызывает конформационные изменения во всём экстраклеточном домене. При этом верхняя часть palm домена и knuckle домен остаются неподвижными (и потому получили название “scaffold” или “опора”), в то время как нижний palm домен, finger, thumb и wrist домены становятся подвижными и изменяют своё положение относительно друг друга (Рис. 1.5.А). В результате этих перестановок изменяется также положение трансмембранной части канала и свойства ионной поры: TM2 домен выпрямляется, и в просвет поры выступает атом карбонильного кислорода Гли443, в результате чего формируется селективный ионный фильтр. Фильтр имеет радиус ~3.6, что очень точно совпадает с радиусом гидратированного иона Na+, соответственно, барьерный механизм фильтрации довольно прост и основывается на размере гидратной оболочки (Bacongius et al., 2014). Ионы входят во внешний вестибюль через три овальных отверстия (~4x10 каждый), образующихся в результате движения подвижного “запястья” на границы ЭКД и плоскости мембраны (Рис. 1.5.Б), и далее, проходят внутрь клетки через селективный фильтр.

Б

–  –  –

Рисунок 1.5.

А, схематическое изображение «опорных» и подвижных частей канала во время его активации (из Baconguis & Gouaux, 2012). Б, латеральный вид кристаллической структуры ASIC1 канала в открытом (PDB ID: 4NTW) и десенситизированном (PDB ID: 4NYK) состоянии (из Kellenberger & Grutter, 2015). Чёрными стрелками показаны области входа проводимых ионов в канал. Красным выделены участки связывания протонов в пределах одной субъединицы.

1.3. Локализация и участие в физиологических процессах Протон-активируемые ионные каналы широко распространены как в периферической, так и в центральной нервной системе. Уровень экспрессии разных субъединиц заметно различается в зависимости от локализации. Так, субъединицы ASIC1a, -2a и -2b преимущественно обнаруживаются в мозге (Wemmie et al., 2003;

Coryell et al., 2009; Price et al., 2014), в то время как субъединицы ASIC1b и ASIC3 чаще можно встретить в сенсорных окончаниях спинного мозга и на телах чувствительных нейронов (Delaunay et al., 2012). Практически во всех типах нейронов можно обнаружить протон-вызванные токи (Bolshakov et al., 2002). Кроме того, NG2содержащие глиальные клетки (Lin et al., 2010), вкусовые, слуховые и фоточувствительные рецепторные клетки (Lin et al., 2002; Ettaiche et al., 2004; Ugawa et al., 2006), клетки гладкой мускулатуры, выстилающие стенки сосудов (Grifoni et al., 2008), также экспрессируют на своей поверхности ASICs, хотя и в гораздо меньшей степени.

1.4.1. ASICs в мозге Согласно проведённым исследованиям, области мозга, имеющие большую плотность синаптических контактов, демонстрируют высокий уровень экспрессии ASIC1a субъединицы. Показано, что наличие именно этой субъединицы критично для обнаружения протон-вызванных токов в нейрональных структурах. Так, при удалении гена, кодирующего ASIC1a субъединицу, культивируемые гиппокампальные, кортикальные и амигдалярные нейроны становятся нечувствительны к понижению pH внеклеточной среды до pH 5.0. В то же время, удаление ASIC2a субъединицы вызывает лишь небольшое снижение амплитуды тока (Wemmie et al., 2002; Wemmie et al., 2003;

Xiong et al., 2004). Кроме того, специфический ингибитор ASIC1a гомомеров PcTx1 убирает большую часть протон-вызванных токов в культурах гиппокампа и коры (Baron et al., 2002; Coryell et al., 2007). Таким образом, большинство протон-вызванных токов в мозге опосредуются ASIC1a гомомерами или ASIC1a-содержащими гетеромерами.

Уровень экспрессии ASIC1a субъединицы варьирует в разных структурах мозга.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Мезенцева Ольга Александровна ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ СТУДЕНТОВБАКАЛАВРОВ МЛАДШИХ И СТАРШИХ КУРСОВ С УЧЕТОМ ИХ ЦЕННОСТНЫХ ОРИЕНТАЦИЙ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководителькандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Москва...»

«К О З ЛО В А ДАРЬЯ ИГОРЕВНА ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗЫ НЕПРИЛИЗИНА В МОЗГЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С п е ц и а л ьн о с ть 03.01.04 – биохимия 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук Научные руководители доктор биологических наук Журавин Игорь Александрович...»

«КИРЕЕВА НАТАЛИЯ СЕРГЕЕВНА ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ ПРИ ДЕКОМПРЕССИВНЫХ ВМЕШАТЕЛЬСТВАХ ПО ПОВОДУ ШЕЙНОЙ СПОНДИЛОГЕННОЙ МИЕЛОПАТИИ (КЛИНИКО-НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.01.11 – нервные болезни 14.01.18 – нейрохирургия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Доктор медицинских наук Шахпаронова Н.В. Доктор медицинских наук...»

«Котельникова Светлана Владимировна НЕЙРОЭНДОКРИННЫЙ ГОМЕОСТАЗ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО СТРЕССА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ ОСВЕЩЕННОСТИ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор Д.Л....»

«ДАНИЛОВА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА Влияние мутаций по генам мембранных рецепторов цитокининов на экспрессию генов хлоропластных белков Arabidopsis thaliana Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Научные руководители: Доктор биологических наук, профессор В.В. Кузнецов...»

«Мезенцева Ольга Александровна ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ СТУДЕНТОВБАКАЛАВРОВ МЛАДШИХ И СТАРШИХ КУРСОВ С УЧЕТОМ ИХ ЦЕННОСТНЫХ ОРИЕНТАЦИЙ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководителькандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Москва...»

«ЯБЛОНСКАЯ Елена Карленовна ЭКЗОГЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОДУКЦИОННОГО ПРОЦЕССА, КАЧЕСТВА ЗЕРНА И УСТОЙЧИВОСТИ К ФИТОПАТОГЕНАМ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант: Д.с.-х.н., профессор Котляров В.В....»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА ПАВЛОВНА Эхография в диагностике внутрилегочных повреждений и осложнений у пострадавших с закрытой травмой груди 14.01.13. лучевая диагностика, лучевая терапия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н., профессор Е.Ю. Трофимова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений ВВЕДЕНИЕ..5...»

«Митин Игорь Николаевич Психофизиологическая адаптация как ведущий фактор обеспечения безопасности дорожного движения 05.26.02. Безопасность в чрезвычайных ситуациях (медицина катастроф) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор В. Ю. Щебланов Москва,...»

«Гурбанова Ляля Русдамовна Особенности вегетативной регуляции вариабельности сердечного ритма в репродуктивном, преи постменопаузальном периодах в зависимости от стереоизомерии женского организма 03.03.01 физиология 14.01.01 – акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«УЛЬЯНОВ Владимир Юрьевич ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И САНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ГОМЕОСТАЗА В ОСТРОМ И РАННЕМ ПЕРИОДАХ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ И КОСМЕТОЛОГИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ АРИПОВА МУКАДДАМ ЛУТФИЛЛОЕВНА ОСОБЕНННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РОЗАЦЕА НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ОПИСТОРХОЗА (14.01.10 – КОЖНЫЕ И ВЕНЕРИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Хардикова С.А. Москва 2015 Стр. Список сокращений..4 Введение..5...»

«ГАЛЯМИНА АННА ГЕОРГИЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ДЕПРЕССИИ И ТРЕВОЖНОСТИ В РАЗВИТИИИ СМЕШАННОГО ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНОГО РАССТРОЙСТВА: ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД (03.03.01) «физиология» Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: профессор, д. б. н. Н.Н. Кудрявцева Новосибирск 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ВОНДИМТЕКА ТЕСФАЙЕ ДЕССАЛЕГН ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ УПРАЖНЕНИЙ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ГОРНОЙ ГИПОКСИИ И СУБТРОПИЧЕСКОГО КЛИМАТА ЭФИОПИИ 03.03.01 Физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Т. Шаов Нальчик-2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«Палий Иван Николаевич ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ AGASTACHE FOENICULUM PURSH. И NEPETA CATARIA VAR. CITRIODORA BECK. В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО БЕРЕГА КРЫМА 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Ильницкий О.А. Оглавление ВВЕДЕНИЕ 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА О...»

«КАЛЮЖНЫЙ Евгений Александрович МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ УЧАЩИХСЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ 03.03.01 – физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты – доктор биологических наук, профессор В.Н.Крылов доктор медицинских...»

«ИВАНОВА ЭМИЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ РАКА ЖЕЛУДКА И ТОЛСТОЙ КИШКИ Специальность:14.01.12 – онкология 14.03.03 – патологическая физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор КОНДАКОВА И.В. доктор медицинских наук ЧЕРЕМИСИНА...»

«21 мая 2014 года на заседании Диссертационного совета Д.002.044.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН состоялось рассмотрение диссертации Карантыш Галины Владимировны «Онтогенетические особенности поведенческих реакций и функциональных изменений в мозге крыс в моделях ишемии/гипоксии» на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 – «Физиология». Присутствовало на заседании _20_...»

«Тиунова Татьяна Алексеевна СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ОЦЕНКА УРОВНЕЙ ОНКОМАРКЕРОВ У ПРОЖИВАЮЩИХ В ПРОМЫШЛЕННОМ РЕГИОНЕ ЖЕНЩИН С ПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ 14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор...»

«Сафина Татьяна Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ ПОЛУШАРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА В РЕГУЛЯЦИИ ЭРГОТРОПНЫХ И ТРОФОТРОПНЫХ ФУНКЦИЙ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.