WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

«ЛО В А ДАРЬЯ ИГОРЕВНА ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗЫ НЕПРИЛИЗИНА В МОЗГЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С п е ц и а л ьн о с ть ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И.М.

СЕЧЕНОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

К О З ЛО В А

ДАРЬЯ ИГОРЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И РЕГУЛЯЦИИ МЕТАЛЛОПЕПТИДАЗЫ



НЕПРИЛИЗИНА В МОЗГЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

С п е ц и а л ьн о с ть 03.01.04 – биохимия 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук

Научные руководители доктор биологических наук Журавин Игорь Александрович доктор биологических наук Наливаева Наталия Николаевна С а н к т - П е те р б ур г – 2 0 1 5

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.

Роль протеолитических ферментов в функционировании организма 13 1.1.

Ферменты семейства неприлизина 14 1.2.

Неприлизин. Свойства и функции 16 1.3.

Образование амилоидного пептида (А) 22 1.4.

Свойства амилоидного пептида 26 1.5.

Выведение А из организма и мозга 28 1.5.1.

Регуляция экспрессии неприлизина 29 1.6.

Регуляция экспрессии неприлизина внутриклеточным фрагментом 29 1.6.1.

белка предшественника амилоидного пептида (AICD) Альтернативные пути регуляция экспрессии неприлизина 32 1.6.2.

Активность каспаз при действии патологических факторов 33 1.6.3.

Гипоксия, как фактор, влияющий на изменение экспрессии и 35 1.6.4.

активности неприлизина Мягкое когнитивное снижение и болезнь Альцгеймера 37 1.7.

Поиск маркеров для ранней диагностики болезни Альцгеймера 42 1.8.

Заключение 1.9

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.

Экспериментальные животные 45 2.1.

Модель пренатальной гипоксии 46 2.2.

Анализ кратковременной памяти 46 2.3.

Оценка кратковременной и долговременной памяти в 47 2.4.

модифицированном тесте «распознавание новых объектов»

Введение ингибиторов каспаз в желудочки мозга крыс 47 2.5.

Внутрибрюшинные введения крысам вальпроата натрия

–  –  –

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.

Изменение активности и экспрессии неприлизина в ткани мозга крыс 59 3.1.

в ходе нормального онтогенеза и после пренатальной гипоксии Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и 59 3.1.1.

гиппокампе мозга интактных крыс Возрастная динамика активности неприлизина в теменной коре и 61 3.1.2.

гиппокампе мозга крыс, перенесших пренатальную гипоксию Анализ экспрессии неприлизина в теменной коре мозга молодых и 63 3.1.3.

взрослых интактных крыс Влияние старения и пренатальной гипоксии на изменение процессов 65 3.1.4.

обучения и запоминания у крыс Сравнительный анализ влияния пренатальной гипоксии на изменение 65 3.2.

активности и экспрессии неприлизина в теменной коре и гиппокампе взрослых крыс Исследование механизмов регуляции неприлизина с использованием 68 3.3.

клеток нейробластомы человека NB7 Влияние гипоксии на уровень экспрессии и активности неприлизина в 68 3.3.1.

культуре клеток NB7 Эффект гипоксии на активность членов семейства каспаз 71 3.3.2.

Изменение уровня связывания транскрипционного фактора AICD c 71 3.3.3.

промотором гена НЕП при гипоксии Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение активности неприлизина 74 3.3.4.

при гипоксии Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение уровня связывания AICD 75 3.3.5.

c промотором гена НЕП при гипоксии Эффект ингибитора каспазы-3 на изменение экспрессии неприлизина 76 3.4.

и содержание AICD при гипоксии in vivo Эпигенетическая регуляция экспрессии неприлизина вальпроатом 80 3.5.

натрия in vivo Влияние антиоксиданта эпигаллокатехин-3-галлата на активность 86 3.6.

неприлизина в ткани мозга крыс Изменение активности неприлизина в плазме крови крыс в норме и 86 3.7.

после пренатальной гипоксии Анализ активности неприлизина в плазме крови пациентов с мягким 91 3.8.

когнитивным снижением и БА Влияние фармакологического агента Цераксона® на изменение 93 3.9.





активности неприлизина и состояния пациентов

ОБСУЖДЕНИЕ

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.

ВЫВОДЫ

6.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Характерной тенденцией современного общества является увеличение продолжительности жизни. При этом наблюдается рост ряда заболеваний и патологических состояний, связанных с возрастом. Когнитивные нарушения и нейродегенеративные заболевания занимают одно из первых мест среди патологий пожилого и старческого возраста. В механизмах развития когнитивных и нейродегенеративных заболеваний большую роль играют генетические мутации и факторы риска (стресс, инсульты, инфаркты, нарушения функционирования эндокринной системы и патологические условия, в том числе патология пренатального развития).

Литературные данные свидетельствуют о том, что повышенная продукция -амилоидного пептида (А), а также возрастное снижение его катаболизма является одним их факторов, приводящих к появлению на молекулярном уровне признаков патогенетических изменений, характерных для развития такого нейродегенеративного заболевания, как болезнь Альцгеймера (БА).

А является основным компонентом внеклеточных фибриллярных отложений, характерных для БА. Данный факт послужил основанием для поиска протеолитических ферментов, способных разрушать отложения A в мозге. Исследования последних лет показали, что металлопептидаза неприлизин (НЕП) является одним из самых мощных амилоид-деградирующих ферментов in vivo (Higuchi et al, 2005, Nalivaeva et al, 2012, 2014). Исследования на мышах с нокаутом гена НЕП, показали, что дефицит эндогенного НЕП повышает уровень A в мозге в дозо-зависимой манере (Higuchi et al, 2005). С возрастом также отмечается снижение количества НЕП в отдельных областях мозга крыс и мышей (гиппокамп, височная кора) (Nalivaeva et al, 2004, Caccamo et al, 2005). С другой стороны, было показано, что стереотаксические инъекции вирусных векторов, кодирующих ген НЕП, в гиппокамп модельных мышей с БА, приводят к снижению содержания A в мозге. Большой практический интерес представляет тот факт, что инъекции аденоассоциированного вирусного вектора в периферические органы, такие, как сердце, способны вызвать еще больший эффект снижения амилоидных отложений в мозге и улучшение функций памяти (Iwata et al, 2013). Данный факт позволяет предположить, что НЕП, регулируя уровень А в периферических органах и крови, может играть важную роль в поддержании его баланса в ткани мозга, что важно для создания терапевтических подходов для предотвращения накопления А в нервной ткани.

5 Важно отметить, что у пациентов на ранней стадии развития БА также выявляются патологические изменения, характерные для снижения функций НЕП, наблюдаемые на модели трансгенных мышей. Уточнение роли снижения активности НЕП в патогенезе БА открывает возможность разработки тестов для ранней диагностики и поиска новых терапевтический подходов лечения данного заболевания.

Данная диссертационная работа посвящена изучению свойств и регуляции НЕП в структурах мозга и плазме крови крыс в норме и после пренатальной гипоксии. Такое сравнительное исследование является важным и актуальным, поскольку дает возможность сопоставить взаимосвязь изменений экспрессии и активности НЕП с изменением когнитивных функций в постнатальном онтогенезе крыс в норме и после действия пренатальной гипоксии на 14-е сутки эмбриогенеза (Е14). Исследования активности НЕП в плазме крови экспериментальных животных, проведенные параллельно с исследованиями данного показателя в структурах мозга, открывают возможность оценки корреляции изменений, происходящих в мозге, с использованием показателей плазмы крови, как наиболее доступного клинического материала, и предположить сходные изменения активности НЕП в плазме крови человека. Этот подход был положен в основу исследований на клиническом материале, что позволило оценить наличие корреляции между уровнем активности НЕП в плазме крови пациентов с разной степенью развития деменции. Такое направление данной диссертационной работы является особенно актуальным, поскольку открывает возможность использования показателя активности НЕП в качестве маркера ранних изменений, приводящих к нейродегенерации и БА. С целью раскрытия молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена НЕП и модуляции активности этого амилоид-деградирующего фермента в данной работе была использована культура клеток нейробластомы человека NB7. Эти исследования позволили продемонстрировать роль транскрипционного фактора AICD, образующегося в процессе формирования А, а также протеолитических ферментов каспаз, в регуляции экспрессии гена НЕП при действии гипоксии, что позволило расширить пути поиска терапевтических агентов, способных изменять экспрессию гена НЕП и проанализировать эффект их действия на животных.

В настоящее время все большее внимание ученых сосредоточено на поисках соединений, способствующих расщеплению А и выведению его из ткани мозга, хотя нельзя не упомянуть о важности исследований, направленных на детальное изучение механизмов, приводящих к повышенному образованию А. Такое всестороннее изучение процессов метаболизма А позволит глубже понять роль разных ферментов в образовании и катаболизме А и сбалансировать их активность с целью предотвращения накопления токсических концентраций А, ведущих к патологическим изменениям, характерным для БА. Наиболее перспективным направлением в профилактике нейродегенеративных заболеваний, связанных с патологическим накоплением амилоида вследствие нарушения катаболизма А (спорадическая форма БА), является исследование свойств и регуляции наиболее активного амилоид-деградирующего фермента НЕП, что имеет большое теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в исследовании изменений содержания и активности НЕП в нервной ткани и плазме крови млекопитающих в норме, при развитии когнитивных дисфункций (у крыс после пренатальной гипоксии или у человека при нейродегенеративных заболеваниях), а также изучение механизмов регуляции экспрессии НЕП с использованием клеточной (нейробластома человека NB7) и зоотропной (крысы) моделей.

Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести сравнительное исследование активности НЕП в теменной коре и гиппокампе мозга крыс линии Wistar в ходе нормального постнатального онтогенеза и после пренатальной гипоксии на E14, а также оценить изменение когнитивных функций у этих животных;

2. Сравнить экспрессию НЕП на уровне мРНК и белка, а также активность и локализацию НЕП в клетках нейробластомы NB7 в условиях нормального содержания кислорода и при гипоксии;

3. Исследовать уровень содержания мРНК и активность каспаз в клетках NB7 в условиях нормального содержания кислорода и при гипоксии;

4. Количественно оценить связывание транскрипционного фактора с AICD промотором гена НЕП в условиях нормального содержания кислорода и при гипоксии, а также оценить эффект применения ингибитора каспазы-3 на изменение уровня активности НЕП и процента связывания AICD c промотором гена НЕП в клетках NB7 при гипоксии;

5. Оценить эффект ингибитора каспазы-3 на изменение содержания AICD и экспрессии НЕП в теменной коре мозга и когнитивные функции взрослых крыс, перенесших пренатальную гипоксию на Е14;

6. Выяснить особенности действия ингибитора гистондеацетилаз вальпроата натрия (valproic acid, VA) и антиоксиданта эпигаллокатехин-3-галлата (ЭГКГ) на активность НЕП в теменной коре и гиппокампе мозга и когнитивные функции взрослых крыс после гипоксии на Е14;

7. Исследовать активность НЕП в плазме крови в нормальном онтогенезе крыс и после гипоксии на Е14;

8. Исследовать активность НЕП в плазме крови пациентов без нарушений внимания и памяти, а также с диагнозом мягкого когнитивного снижения амнестического типа (а-МКС) и БА, и провести анализ действия терапевтического препарата Цераксон ® на активность НЕП в плазме крови пациентов с а-МКС.

Объекты исследования

Работа выполнена с использованием крыс линии Wistar разных возрастных групп (контрольные животные и крысы после гипоксии на Е14). В исследованиях также использовались клетки нейробластомы человека NB7 и плазма крови пациентов НЦПЗ РАМН (без выраженных нарушений внимания и памяти, а также с диагнозами а-МКС и с БА).

Предмет исследования Предметами исследования в данной работе были биохимические показатели активности и экспрессии НЕП (на уровне мРНК и белка) в клетках нейробластомы человека NB7, в белковых экстрактах из структур мозга крыс и в плазме крови крыс и человека; уровень экспрессии и активности протеолитических ферментов каспаз в структурах мозга крыс и клетках нейробластомы человека NB7; характер связывания транскрипционного фактора AICD с промотором гена НЕП в клетках нейробластомы человека NB7; показатели действия инъекций вальпроата натрия, эпигаллокатехин-3галлат и ингибиторов каспаз (Z-DEVD-FMK и Ас-DEVD-CHO) на уровень активности НЕП и содержание AICD; показатели когнитивных способностей крыс (кратковременная и долгосрочная память).

Научная новизна результатов

Впервые проведено исследование динамики активности НЕП с 10 по 570 дни постнатального онтогенеза крыс в норме и после действия пренатальной гипоксии на Е14.

Выяснено, что в ходе нормального постнатального онтогенеза происходит снижение активности НЕП в теменной коре и гиппокампе мозга в 3 и 5 раз, соответственно. При этом в поведенческих тестах было показано статистически достоверное снижение когнитивных функций у старых крыс.

Впервые установлено, что активность НЕП имеет разнонаправленные изменения в структурах мозга и плазме крови крыс, как в ходе постнатального онтогенеза, так и после гипоксии на Е14.

Подробно рассмотрен один из возможных молекулярных механизмов регуляции экспрессии и активности НЕП при действии гипоксии. Впервые установлено снижение уровня связывания активирующего транскрипционного фактора AICD с промотором гена НЕП, коррелирующее с повышением уровня экспрессии и активности каспаз (в частности, каспазы-3) в клетках нейробластомы человека NB7. Установлено, что введение ингибитора каспаз препятствует снижению содержания AICD и активности НЕП в клетках нейробластомы, вызванного гипоксией, а также в мозге крыс после пренатальной гипоксии на Е14, что приводит к улучшению их когнитивных функций.

Впервые исследованы показатели активности НЕП в плазме крови пациентов с диагнозом а-МКС и БА по сравнению с показателями у пациентов без нарушений внимания и памяти. Продемонстрировано наличие корреляции между уровнем снижения активности НЕП и степенью выраженности когнитивных нарушений при развитии БА.

Также описаны изменения данного показателя при действии лекарственных препаратов, применяемых при лечении пациентов с а-МКС и БА.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая важность данной работы заключается в раскрытии возможного молекулярного механизма регуляции экспрессии гена НЕП при гипоксии. С использованием клеток нейробластомы NB7 показано, что гипоксия приводит к повышению в клетках экспрессии и активности каспаз, а также к снижению уровня связывания транскрипционного фактора AICD, который регулирует экспрессию НЕП с промотером его гена. При действии на гипоксические клетки ингибитора каспазы-3 в них наблюдалось сохранение уровня связывания AICD с промотором гена НЕП и активности его белкового продукта. Установлено, что аналогичные механизмы работают и на зоотропной модели (крысы после гипоксии на Е14, имеющие когнитивные дисфункции в постнатальном онтогенезе).

Так в мозге крыс, перенесших гипоксию на Е14, содержание AICD и активность НЕП восстанавливалась до контрольных значений при применении ингибитора каспазы-3, что также сопровождалось улучшением процессов запоминания и обучения у этих животных. Полученные данные позволяют расширить диапазон поиска мишеней для регуляции экспрессии и активности НЕП и других нейрональных генов с целью коррекции патологических изменений поведенческих реакций, памяти и обучения, индуцированных действием неблагоприятных факторов развития.

При проведении работы был налажен метод определения активности НЕП плазмы крови крыс и человека. Данные, полученные в ходе работы, продемонстрировали возможность использования показателя активности НЕП в плазме крови человека в качестве диагностического критерия, который позволяет выявить наличие а-МКС или БА у пациентов с нарушениями внимания и памяти. Данный метод позволяет с высокой точностью и скоростью проводить анализ большого количества проб, при этом требуется небольшое количество крови, что актуально при работе с пожилыми людьми, которые тяжело переносят процедуры забора крови и зачастую имеют проблемы со свертываемостью. Полученные данные могут быть положены в основу создания диагностического теста, позволяющего оценить степень развития патологических изменений и эффективность применяемых терапевтических средств.

Положения, выносимые на защиту

Выяснено, что в коре и гиппокампе мозга крыс, как в ходе нормального постнатального онтогенеза, так и после пренатальной гипоксии, происходит снижение активности НЕП, обусловленное уменьшением его экспрессии. При этом наблюдается снижение когнитивных функций у старых крыс и у молодых крыс, перенесших пренатальную гипоксию.

При действии гипоксии снижение экспрессии НЕП происходит в результате уменьшения связывания транскрипционного фактора AICD с промотором гена НЕП, обусловленного активацией каспаз, субстратом которых является AICD. Введение ингибитора каспаз препятствует снижению экспрессии и активности НЕП после гипоксии как в клетках нейробластомы человека, так и у животных, перенесших пренатальную гипоксию.

Активность НЕП в плазме крови человека достоверно снижается при мягком когнитивном снижении и болезни Альцгеймера, что можно использовать в качестве дополнительного диагностического критерия для подтверждения диагноза а-МКС или БА у пациентов с нарушениями внимания и памяти, а также для оценки эффективности действия лекарственных препаратов.

Апробация результатов исследования Результаты исследований, включенные в диссертационную работу, были представлены на 18 всероссийских и международных конференциях, а также включены в 3 главы 2-х коллективных монографий.

–  –  –

Основные результаты изложены в 3 статьях в периодических научных изданиях, входящих в профессиональный перечень, утвержденный ВАК Российской Федерации:

Журнал «Психиатрия» (2010), Journal of Molecular Neuroscience (2012) и Журнал эволюционной биохимии и физиологии (2015).

В статьях, опубликованных в соавторстве, права соавторов публикаций не нарушены. В статьях, опубликованных в соавторстве, соискатель лично проводил экспериментальные исследования, лабораторную обработку проб, статистический анализ полученных результатов, а также осуществлял совместную подготовку статьей к публикации.

Результаты исследования были представлены на следующих отечественных и международных научных конференциях: V съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск (2008); XI и XII Всероссийская медикобиологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург (2008, 2009); IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, (2009); Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Salzburg, Austria (2009); Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 85-летию со дня основания Института физиологии им.

Загрузка...
И.П. Павлова РАН. «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды», Санкт-Петербург (2010); Joint Conference of Czech and Slovak Neuroscience Societies, Smolenice Castle, Slovakia (2011); III съезд физиологов СНГ, Ялта (2011); XIV Cовещание и VII Школа по эволюционной физиологии, посвященной памяти академика Л.А. Орбели, Санкт-Петербург (2011); 15th Multidisciplinary International Conference on Neuroscience and Biological Psychiatry, StPetersburg, Russia (2011); Конференция «Братья Орбели и развитие современной науки», Санкт-Петербург (2012); Конференция «Мозг: фундаментальные и прикладные проблемы», Москва (2012); 17th International Neuroscience Conference “Stress and Behavior”, St-Petersburg, Russia (2012); 38th FEBS Congress, Saint- Petersburg, Russia (2013);

5th ESN Conference on Advances in molecular mechanisms underlying neurological disorders, Bath, UK (2013), Всероссийская конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Санкт-Петербург - Колтуши (2014); IX конференция «Здоровье – основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения», Санкт-Петербург (2014);

European Society for Neurochemistry's Conference “Molecular Mechanisms of Regulation in the Nervous System”, Tartu, Estonia (2015).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 140 страницах, содержит 1 таблицу и 29 рисунков. Список литературы включает 304 источников, из них - 284 на иностранных языках.

Благодарности

Автор выражает благодарность научным руководителям – доктору биологических наук Наталии Николаевне Наливаевой и доктору биологических наук Игорю Александровичу Журавину, за всестороннюю помощь в процессе проведения исследования и работы над рукописью. Спасибо за помощь в выстраивании линии диссертации для написания гармоничной и разносторонней работы! Искреннюю признательность автор диссертации выражает сотрудникам лаборатории Сравнительной физиологии и патологии ЦНС кандидату биологических наук Васильеву Д.С., кандидату биологических наук Дубровской Н.М., кандидату биологических наук Тумановой Н.Л., лаборанту Киселевой И.Н. за помощь в организации исследований, подбор и налаживание работы аппаратуры для экспериментальной работы, ценные рекомендации и консультации. Особые слова благодарности автор адресует сотруднице лаборатории Е.Г.

Кочкиной и доктору биологических наук С.А. Плесневой за методическую и теоретическую помощь на разных этапах обучения и научной карьеры. Отдельно автор работы выражает благодарность профессору A.J. Turner – заведующему лабораторией протеолиза Института молекулярной и клеточной биологии Университета города Лидс, Великобритания, а также всем сотрудникам института за всестороннюю помощь в освоении передовых методов молекулярной биологии и биохимии, позволивших выполнить работу на высоком методическом уровне. Часть работы проводилась в рамках грантов РФФИ 13-04-00388 и 12-04-32281.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Роль протеолитических ферментов в функционировании организма 1.1.

Протеолитические ферменты, занимающие около 2% генома человека, играют важную роль на всех стадиях развития организма, начиная от деления клеток и заканчивая процессами старения организма. Эти ферменты выполняют особую роль в развитии мозга и становлении его основных функций, обеспечивая быстрые перестройки на уровне синаптического аппарата, что важно для формирования памяти и реализации высшей функции мозга – сознания.

В геноме человека основные классы протеиназ представлены цистеиновыми, сериновыми и металлопротеиназами, которые обладают широчайшим спектром субстратной специфичности и физиологических функций, и могут быть как растворимыми, так и связанными с плазматическими мембранами (Turner and Nalivaeva, 2012). Открытие генов многих ранее неизвестных пептидаз в результате секвинирования генома человека открывают широкие перспективы поиска новых ферментов, способных прояснить этиологию ряда заболеваний и представить платформу для создания новых лекарственных препаратов. Более того, обнаружено, что некоторые хорошо известные ферменты имеют ряд неожиданных новых свойств, например в нейровоспалении, развитии рака и ангиогенезе, сердечнососудистых заболеваниях и нейродегенерации.

Согласно существующим в настоящее время представлениям патогенез такого распространенного заболевания пожилого возраста как болезнь Альцгеймера (БА) самым непосредственным образом связана с действием широкого спектра протеолитических ферментов, нарушение которых приводит к патологии, и многие из них рассматриваются в качестве важных терапевтических мишеней. Несмотря на то, что исследования, основанные на преобладающей в последние 20 лет гипотезе амилоидного каскада (Hardy and Higgins, 1992), не привели к созданию лекарств, способных остановить развитие БА, механистически данная гипотеза является верной. Ее правильность подтверждается в случае генетически обусловленных форм данного заболевания, которые связаны как с изменением свойств белка предшественника амилоидного пептида, являющегося субстратом для разных классов протеолитических ферментов с образованием токсичного амилоидного пептида (А), так и мутациями в генах самих протеолитических ферментов, расщепляющих его, в частности пресенилинов (Goate and Hardy, 2012).

К числу протеолитических ферментов, которым в последние годы уделяется все более пристальное внимание, относятся ферменты, способные расщеплять A и выводить его из ткани мозга. Как было показано рядом авторов, некоторые хорошо известные протеазы мозга способны гидролизовать A в физиологических условиях (для обзора см.

Nalivaeva et al, 2014). Это привело к пересмотру имеющихся представлений о метаболизме 13 амилоидного пептида и о роли амилоид-деградирующих и транспортных белков в патогенезе БА. В связи с тем, что с возрастом и при ряде патологий, таких как хроническая ишемия мозга, инсульт, нейровоспаление, уровень экспрессии и активности этих белков в ткани мозга существенно снижается, приводя к накоплению A. В связи с этим, поиск путей повышения интенсивности расщепления амилоидного пептида и его удаления из мозга является одним из основных направлений исследований для создания средств профилактики и лечения спорадической формы БА (Holtzman et al, 2012; Sagare et al, 2012). К числу основных амилоид-деградирующих ферментов сейчас относят некоторые ферменты семейства неприлизина (НЕП, НЕП2, эндотелин-конвертирующий фермент - ЭКФ-1), инсулин-деградирующий фермент (ИДФ; инсулизин), плазмин, и многие другие пептидазы, которые способны расщеплять A как in vitro, так и in vivo (Nalivaeva et al, 2008; 2012).

Ферменты семейства неприлизина 1.2.

Ферменты семейства неприлизина (М13) представляют собой большую группу цинк-зависимых металлопептидаз, первой из которых был описан неприлизин млекопитающих (EC3.4.24.11, нейтральная эндопептидаза, НЕП) (Turner et al, 2004).

Ферменты данного семейства участвуют в метаболизме биологически активных пептидов и вовлечены в большое число физиологических процессов в организме млекопитающих. К их числу относятся, например, участие пептидаз в окончании действия пептидэргических сигналов и изменении уровней содержания нейротрансмиттеров, контроль кровяного давления, репродуктивные функции, развитие раковых заболеваний. Большинство описанных пептидаз М13 представляют собой эндопептидазы, расщепляющие аминоконцевые связи гидрофобных остатков (Turner et al, 2001). Характерными чертами ферментов данного семейства является их чувствительность к ингибированию фосфорамидоном, а субстраты представляют собой пептиды маленького или среднего размера (в том числе энкефалины, тахикинины, опиоидные пептиды, эндотелины и бомбезин).

Недавно было показано, что несколько членов семейства неприлизина способны расщепляют A в мозге млекопитающих и повышение их экспрессии с помощью разных подходов снижает количество -амилоидного пептида в ткани мозга (Marr et al, 2003;

Hemming et al, 2007; Carty et al, 2013; Park et al, 2013). НЕП является типичным интегральным мембранным белком второго типа, активный центр которого обращен во внеклеточное пространство (Turner et al, 2001). Существует также гомолог неприлизина (НЕП2), который встречается как в мембраносвязанной, так и в растворимой форме в организме млекопитающих (человек - MMEL2, грызуны - SEP/NL1 и НЕП2) и насекомых (Drosophila melanogaster) (Ghaddar et al, 2000; Facchinetti et al, 2003; Thomas et al, 2005;

Whyteside and Turner, 2008). Данные ферменты характеризуются выраженной экспрессией в мужских половых гонадах, что позволяет предположить их физиологическую роль в репродукции. Показано, что скрещивание самок мышей дикого типа с самцами, у которых удален ген SEP/NL1, дает малое количество потомства, что свидетельствует о важной роли данного фермента в реализации репродуктивной функции млекопитающих.

Эндотелин-конвертирующий фермент (ЭКФ или ECE) и группа гомологичных ему ферментов имеют различную биологическую природу. ЭКФ-1 существует в виде 4 изоформ и его физиологическая роль заключается в метаболизме эндотелинов и регуляции кровяного давления, путем образования зрелого эндотелина из его неактивного предшественника большего размера (Ahn and Johnson, 2004). Мыши, лишенные гена ЭКФимеют летальный фенотип с серьезными нарушениями процессов развития, включая черепно-лицевое формирование (Yanagisawa et al, 2000). ЭКФ-2 экспрессируется в основном в нейронах и считается, что этот фермент вовлечен в процессинг пептидов до их секреции (Ahn, 2004).

Подобный эндотелин-конвертирующему ферменту-1 (ECEL-1, ХСЕ) и его гомолог у грызунов – индуцируемая повреждением нейрональная эндопептидаза (damage-induced neuronal endopeptidase – DINE) также являются характерными представителями семейства М13 (Valdenaire, 2004; Kiryu-Seо et al, 2000). DINE был идентифицирован благодаря увеличению его экспрессии после повреждения нервной ткани и, как было показано, он обладает нейропротекторными функциями (Ohba et al, 2004). Мыши, лишенные гена ХСЕ, развиваются нормально, но умирают сразу после рождения из-за невозможности расправления легких (Schweizer et al, 1999). Поскольку пока не обнаружены физиологические субстраты для ECEL-1/DINE, механизм их нейропротекторного действия и контроля дыхания остается не ясным.

К нетипичным представителям семейства М13 и НЕП относится гомолог эндопептидазы, регулирующей фосфатный обмен (PHEX - phosphate regulating endopeptidase homologue Х), ассоциированный с Х хромосомой). Отличие данного фермента от других представителей М13 состоит в том, что в его S1 сайте преобладают кислотные остатки (Campos et al, 2003). Другой гомолог НЕП, получивший название Kell по имени пациента, представляет собой важный антиген группы крови, который также обнаружен в клетках Сертоли извитых канальцев семенников млекопитающих (Lee et al, 1999; Camara-Clayette et al, 2001). Kell способен конвертировать большой эндотелин-3 в биологически активный эндотелин-3 (Lee et al, 1999). Данный фермент также относится к нетипичным представителям М13 семейства, поскольку не имеет трансмембранного домена, а вместо этого ковалентно связан с мембранным белком ХK (Redman and Lee, 2004). Дефицит Kell не вызывает видимой патологии, однако пациенты, у которых отсутствует белок ХK, а соответственно нет связанного с мембраной клеток Kell, страдают от синдрома Маклеода (Redman and Lee, 2004).

1.3. Неприлизин. Свойства и функции

Неприлизин (ЕС.3.4.24.11), известный также под названиями нейтральная эндопептидаза 24.11, CALLA (common acute lymphocytic leukemia (ALL) antigen - общий антиген острого лейкоза), энкефалиназа и антиген СD10 (Brown et al, 1974; Schwartz et al, 1980; Letarte et al, 1988, для обзора см. Nalivaeva et al, 2012), представляет собой повсеместно распространенный интегральный мембранный белок второго типа, состоящий из 742 аминокислотных остатков, молекулярный вес которого в зависимости от степени гликозилирования колеблется от 85 до 110 кДа (Relton et al, 1983; Malfroy et al, 1988). Наиболее высокий уровень экспрессии НЕП наблюдается в почках, при этом в мозге и других тканях его содержание в несколько десятков раз ниже (Erdos and Skidgel, 1988). Активный центр НЕП обращен во внеклеточное пространство, что является идеальным для осуществления процессов деградации пептидов, локализованных во внеклеточном пространстве или ассоциированных с мембраной (Fukami et al, 2002).

Ген НЕП человека (ММЕ) картирован на хромосоме 3 в районе q25.1 – q25.2. Он состоит из 24 экзонов и характеризуется высокой консервативностью среди млекопитающих (D’Adamio et al, 1989). Экспрессия гена НЕП контролируется, по крайней мере, двумя различными промоторами и варьирует в различных тканях. Альтернативный сплайсинг в 5'-некодируемой области приводит к образованию 4-х разных мРНК транскриптов, не затрагивая кодирующую область (Li et al, 1995). Молекула НЕП представлена коротким цитоплазматическим доменом, одиночной N-концевым трансмембранной спиралью и большим внеклеточным доменом, содержащим типичный HEXXH цинк-связывающий мотив (His-Glu-Xaa-Xaa-His, где Xaa – гидрофобный аминокислотный остаток или треонин), который важен для протеолиза различных субстратов НЕП (Barnes et al, 1995; Turner et al., 2001).

Оптимум pH НЕП соответствует 6.0 (Kerr and Kenny, 1974). Его активность ингибируют реагенты, хелатирующие цинк. На общей основе ингибиторов цинкзависимых металлопептидаз были сконструированы мощные ингибиторы НЕП, первым из которых был тиорафан ([dl-3-mercapto-2-benzylpropanoyl]-glycine) (Ki = 2.3 nM) (Roques et al, 1980). Еще один широко применяемый ингибитор НЕП, фосфорамидон, также ингибирует ЕКФ-1. В противоположность матричным металлопротеиназам НЕП не встречается в виде проэнзима и его активность не контролируется эндогенными ингибиторами, хотя пептиды, выделяющиеся в ответ на стресс, такие как сиалорфин и другие «опиорфины» могут регулировать НЕП (Rougeot et al, 2003). В частности, сиалорфин, защищая эндогенные энкефалины, обладает анальгезирующим эффектом в ответ на повреждение тканей.

НЕП представляет собой олигопептидазу, гидролизующую пептиды размером 40аминокислотных остатков (Рис. 1). Эффективность его действия снижается с увеличением длины пептидов. Одним из наиболее эффективно расщепляемых субстратов НЕП является субстанция Р (Matsas et al, 1984). Субстратная специфичность НЕП изучалась с помощью большого числа естественных и синтетических пептидов, для большинства которых физиологическая роль пока не установлена. Основными физиологически значимыми субстратами НЕП in vivo являются энкефалины, тахикинины (к которым относится субстанция Р), эндотелины, брадикинин и предсердный натрийуретический пептид.

Таким образом, ингибиторы НЕП обладают потенциалом в терапии болевых синдромов, воспаления и сердечнососудистых заболеваний (Roques and Beaumont, 1990).

Более того, активность НЕП идентична эластазе фибробластов человека вследствие чего ее стали рассматривать в качестве терапевтической мишени для лечения и предупреждения старения и повреждения кожи (Morisaki et al, 2010).

Рисунок 1. Модель каталитического центра НЕП со связанным с ним ингибитором фосфорамидоном.

Наличие небольшого и компактного каталитического сайта обуславливает способность НЕП гидролизовать субстраты величиной не более 50 аминокислотных остатков (адаптировано из Oefner et al, 2000).

Среди недавно открытых субстратов НЕП также важно отметить адреномедуллин, вазоактивные интестинальные пептиды, глюкагон, тимопентин и важный для патогенеза БА пептид – А (Nalivaeva and Turner, 2013). НЕП вовлечен в нейропептидный сигналинг, а также участвует в регуляции тонуса сосудов (Roques et al, 1993). Более того, он используется в качестве важного маркера клеточной поверхности при диагностике острого лимфоцитарного лейкоза человека (Brown et al, 1975) и имеются данные о его роли в развитии нескольких других видов рака (Guerreiro et al, 2013; Papandreou et al.,1998;

Dawson et al, 2004; Hong et al, 2012).

В центральной нервной системе НЕП в основном экспрессируется в нейронах (Matsas et al, 1986), а также в активированных астроцитах и микроглии (Fisk et al, 2007;

Hickman et al, 2008). В нейронах НЕП локализован вдоль аксона и в синапсах (Barnes et al, 1992), где в основном имеет место опосредованная НЕП деградация A (Fukami et al, 2002; Hama et al, 2001; Iwata et al, 2004). Такая субклеточная локализация НЕП определяет его роль в деградации разных нейропептидов (интерлейкинов, субстанции Р, нейропептида Y, тахикининов, брадикинина и соматостатина (Matsas et al, 1984; Roques et al, 1993; Barnes et al, 1995). Имеется сообщение о том, что нейрональные клетки способны к секреции растворимой формы НЕП во внеклеточную среду и что этот процесс зависит от активности металлопротеаз ADAM10/17 (Nalivaeva et al, 2006), обладающих секретазной активностью в отношении АРР, и опосредуется протеинкиназой С.

Важность НЕП в функционировании организма in vivo была продемонстрирована на нокаутных мышах, лишенных гена НЕП. Для них была показана повышенная смертность от эндотоксинов, что возможно связано с ролью НЕП в метаболизме провоспалительных пептидов, более низкое артериальное давление и более высокая проницаемость микрососудов (Lu et al, 1995). Более того, такие мыши обладали повышенной болевой чувствительностью и агрессивностью (Fischer et al, 2000 а, b).

В литературе имеется большое число данных, свидетельствующих, что НЕП расщепляет мономеры A как in vitro, так и в культуре клеток (Howell et al, 1995; Hama et al, 2001; Kanemitsu et al, 2003; Marr et al, 2003). Стоит отметить, что НЕП более эффективно расщепляет мономеры A40, чем A42. В исследованиях in vitro было показано, что только 27% экзогенного мономерного A42 расщепляется НЕП, в то время как A40 расщеплялся на 73% (Kanemitsu et al, 2003). К настоящему времени охарактеризовано несколько сайтов расщепления в последовательности A (Carson and Turner, 2002; Wang et al, 2006; Miners et al, 2011; Nalivaeva et al, 2012) (Рис. 2).

Способность НЕП расщеплять олигомеры и фибриллы А спорна. Так было показано, что НЕП способен расщеплять синтетические олигомеры, образованные неферментативным путем из синтетических A40 и A42 (Kanemitsu et al, 2003), но не олигомеры секретируемые клеткой (Leissring et al, 2003).

Физиологическая роль НЕП в отношении А в условиях in vivo была показана на трансгенных мышах, являющихся модельными объектами БА с повышенной продукцией А и дефицитом экспрессии НЕП. У таких мышей существенно возрастали уровни растворимого и олигомерного A, что приводило к снижению синаптической пластичности и когнитивным нарушениям (Huang et al, 2006; Madani et al, 2006).

Рисунок 2. Фрагмент молекулы предшественника амилоидного пептида (АРР), на которых показаны участки расщепления А под действием НЕП.

В последовательности АPP также представлены сайты, по которым происходит расщепление его молекулы -, и -секретазами. Номера аминокислот соответствуют изоформе APP695 (адаптировано из Marr and Hafez, 2014).

Напротив, повышение экспрессии НЕП у трансгенных мышей приводило к снижению уровня A в ткани мозга, уменьшению числа амилоидных бляшек и увеличению продолжительность жизни (Leissring et al, 2003; Marr et al, 2003; Iwata et al, 2004; Poirier et al, 2006). Повышение экспрессии и активности НЕП также приводило к нормализации поведенческих реакций (Poirier et al, 2006; El-Amouri et al, 2008; Spencer et al, 2008).

Недавно было показано, что при векторной доставке гена НЕП, ассоциированного с аденовирусом, в организм мышей, имеющих биохимические нарушения, аналогичные БА, существенно снижается содержание мономерной, димерной, тримерной и тетрамерной форм A (Iwata et al, 2013). Введение рекомбинантного растворимого НЕП в мозг мышей с патологией БА путем внутримозговых инъекций также приводили к существенному снижению накопления A и улучшению поведенческих реакций в тесте Моррисона (Park et al, 2013).

Имеются данные о том, что уровень экспрессии НЕП снижается в процессе старения (Nalivaeva et al, 2004, 2012; Caccamo et al., 2005). Это подтверждается результатами нескольких исследований, отмечавших существенное снижение уровней НЕП в мозге старых животных и пожилых людей. При этом в инактивации НЕП большую роль играют процессы перекисного окисления, которые активируются как в процессе старения организма, так и при различных патологиях (Wang et al, 2003). Снижение уровней мРНК НЕП в процессе старения продемонстрировано также и в головных ганглиях Drosophila melanogaster (Iijima-Ando et al, 2008). Имеются данные, что уровень активности НЕП уменьшается в зависимости от возраста в коре головного мозга (Apelt et al, 2003), гиппокампе (Caccamo et al, 2005; Briones and Darwish, 2012) и гомогенате целого мозга мыши (Carter et al, 2006). Иммуногистохимическое исследование гиппокампа АРР трансгенных мышей показало, что при старении уровни НЕП были селективно снижены в нервных окончаниях и аксонах (Iwata et al, 2002). В соответствии с этими наблюдениями приводятся данные о наличии отрицательной корреляции между уровнями содержания НЕП в мозге и возрастом как у пациентов без деменции, так и у пациентов с диагнозом БА (Russo et al, 2005; Hellstrom-Lindahl et al, 2008; Miners et al, 2009).

Данные литературы свидетельствуют также о том, что экспрессия и активность НЕП в культуре нейрональных клеток, а также в коре и гиппокампе снижается после ишемии и гипоксии (Fisk et al, 2007; Nalivaeva et al, 2004), которые рассматриваются в числе факторов риска, предрасполагающих к развитию БА (Daulatzai, 2012). В общем, существует мнение о том, что содержание и активность НЕП понижена именно в тех областях мозга, которые уже на ранних стадиях развития БА характеризуются обилием сенильных бляшек. Так, было показано, что уровни НЕП снижены в гиппокампе (Yasojima et al, 2001 a; Carpentier et al, 2002; Miners et al, 2006), в височной извилине (Yasojima et al, 2001 b) и коре (Akiyama et al, 2001; Russo et al., 2005; Wang et al., 2005 b; Miners et al.,

2006) мозга пациентов с диагнозом БА (посмертное исследование). Тем не менее, в ряде исследований не было обнаружено существенной корреляции между уровнем НЕП в коре у пациентов с БА по сравнению с мозгом пациентов без нарушений внимания и памяти (посмертное исследование), что может быть связано как со способом хранения клинического материала, так и адекватностью применяемых биохимических тестов (Hellstrom-Lindahl et al, 2008; Miners et al, 2009).

В предпринятом в Японии эпидемиологическом исследовании было показано существование корреляции между уровнем экспрессии гена НЕП и развитием старческой (спорадической) формы БА (Sakai et al, 2004). Также имеются данные о том, что некоторые полиморфизмы в гене НЕП являются фактором риска развития БА (Helisalmi et al, 2004) и подверженность данному заболеванию возрастает еще в большей степени при наличии определенных полиморфизмов в гене инсулин-деградирующего фермента (ИДФ) (Vepsalainen et al, 2009), однако другие исследователи не смогли выявить наличие такой корреляции (Lilius et al, 2003).

Обнаружено, что НЕП также снижается в сосудистом сплетении мозга пациентов с БА (Carpentier et al, 2002; Miners et al, 2006). Это подтверждает его роль в амилоидной ангиопатии коры головного мозга. Более того, изменения содержания и активности НЕП при БА не ограничиваются тканью мозга, а затрагивают также спинномозговую жидкость.

У пациентов с мягким когнитивным снижением было зарегистрировано существенное снижение активности НЕП в спинномозговой жидкости, следующее за прогрессированием нейродегенерации в корковых структурах. Предполагается, что НЕП, расположенный пресинаптически, высвобождается в спинномозговую жидкость вследствие разрушения синапсов (Maruyama et al, 2005). Наличие обратной связи между уровнями НЕП и аккумуляцией А в коре (Hellstrom-Lindahl et al, 2008) и сосудистом сплетении (Carpentier et al, 2002) у пациентов с БА доказывает, что даже незначительное снижение уровней НЕП в течение нескольких десятков лет может приводить к накоплению А.

1.4. Образование амилоидного пептида А Амилоидный пептид А образуется из молекулы белка-предшественника, именуемого в иностранной научной литературе АРР (-Amyloid Precursor Protein) или просто АРР. АРР представляет собой конститутивный трансмембранный белок, состоящий из большого эктодомена, одного трансмембранного и короткого внутриклеточного доменов (Kang et al, 1987; Dyrks et al, 1988). Этот белок экспрессируется в различных клетках и тканях животных разного уровня эволюционного развития (Johnstone et al, 1991; Maldonado et al, 2002). Он принадлежит к небольшому семейству генов, включающих АРР-подобные белки 1 и 2 (APLP1 и APLP2) млекопитающих (Sprecher et al, 1993; Wasco et al, 1993), а также APL-1, APPL, APPa и b, характерные для Сaenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster и Danio rerio (Musa et al, 2001). Экспрессия APLP1 ограничена только нейронами, в отличие от APP и APLP2, которые широко экспрессируются в других тканях и органах млекопитающих (Tanzi et al, 1988; Slunt et al, 1994; Lorent et al, 1995). Ген, кодирующий APP человека, содержит 18 экзонов и локализован на 21 хромосоме (Yoshikai et al, 1990). Благодаря альтернативному сплайсингу 7 и 8 экзонов в организме обнаружено несколько мРНК, кодирующих изоформы АРР751, 770 и 695 (в зависимости от количества аминокислотных остатков в цепи). АРР695 – это изоформа АРР, которая преобладает в нейронах (Sandbrink et al, 1994). Важность АРР для нормального функционирования организма млекопитающих была подтверждена в исследованиях на животных с нокаутами белков семейства АРР.

Полученные данные показали, что при отсутствии всех трех генов белков семейства АРР наблюдается летальный исход на этапе эмбрионального развития или сразу же после рождения. Неполная экспрессия данных белков также приводила к тяжелым дефектам нервно-мышечных синапсов (Wang et al, 2005 a, Herms et al, 2004), что, безусловно, свидетельствует о важной физиологической функции данного семейства белков в нервной системе млекопитающих (Aydin et al, 2012).

Протеолитический процессинг АРР может идти по двум альтернативным путями: амилоидогенному с образованием А и неамилоидогенному (Рис. 3). В случае амилоидогенного пути на внеклеточный домен молекулы АРР сначала действует секретаза (BACE1 - -site APP cleaving enzyme 1), в результате чего образуется растворимый эктодомен sAPP и заякоренный в мембране С-концевой фрагмент, состоящий из 99 аминокислот (Vassar et al, 1999).

В случае неамилоидогенного пути, который в нормальных условиях является преобладающим (по нему расщепляется около 95% АРР), молекула белкапредшественника расщепляется под действием - секретазы (член семейства металлопротеаз ADAM – a disintegrin and metalloprotease) с образованием растворимого эктодомена sAPP и заякоренного в мембране С-концевого фрагмента длинной 83 аминокислотных остатка (Lammich et all, 1999; Hooper and Turner, 2002). -секретаза

–  –  –

APH1 PEN2

-секретазный комплекс Никастрин Пресенилин Рисунок 3. Амилоидогенный и неамилоидогенный пути протеолитического процессинга APP (адаптировано из Grimm et al, 2013).

расщепляет АРР внутри последовательности А (16 позиция), предотвращая образование А. Эти два пути протеолитического расщепления АРР локализованы в разных клеточных компартментах. Процессинг АРР по неамилоидогенному пути, характерный для большинства клеток, ассоциирован с клеточной мембраной (Parvathy et al, 1999; Ehehalt et al, 2003), в то время как амилоидогенный путь протекает в эндосомах с более кислым pH, являющимся оптимальным для работы BACE1 (Grbovic et al, 2003; Carey et al, 2005;

Rajendran et al, 2006).

Образующиеся С-концевые фрагменты АРР не зависимо от пути его процессинга расщепляются -секретазой с образованием нетоксичного пептида р3 (из С83 при неамилоидогенном пути) или А (из С99 при амилоидогенном пути) и внутриклеточного домена АРР, AICD (Amyloid precursor protein Intracellular Domain), который имеет важную регуляторную роль (для обзора см. Beckett et al, 2012).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
Похожие работы:

«Фролов Александр Акимович Функциональные особенности респираторной системы в предродовом периоде и в родах в зависимости от стереоизомерии женского организма и их влияние на состояние плода 03.03.01 физиология 14.01.01 акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук...»

«Тиунова Татьяна Алексеевна СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ОЦЕНКА УРОВНЕЙ ОНКОМАРКЕРОВ У ПРОЖИВАЮЩИХ В ПРОМЫШЛЕННОМ РЕГИОНЕ ЖЕНЩИН С ПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ 14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор...»

«Шведов Денис Николаевич РАННИЕ ПРИЗНАКИ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У СТУДЕНТОВ-БАКАЛАВРОВ В ПРОЦЕССЕ УЧЕБНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Орел 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ЧУДИНОВА Екатерина Леонидовна ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА, БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ 14.03.03 – патологическая физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д. м. н., член-корр. РАН, профессор, Заслуженный...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ И КОСМЕТОЛОГИИ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ АРИПОВА МУКАДДАМ ЛУТФИЛЛОЕВНА ОСОБЕНННОСТИ ТЕЧЕНИЯ РОЗАЦЕА НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ОПИСТОРХОЗА (14.01.10 – КОЖНЫЕ И ВЕНЕРИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Хардикова С.А. Москва 2015 Стр. Список сокращений..4 Введение..5...»

«ХИЖНЯК Роман Михайлович ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ (Zn, Cu, Co, Mo, Cr, Ni) В АГРОЭКОСИСТЕМАХ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮГО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ ЦЧО Специальность: 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор сельскохозяйственных наук, профессор С.В. Лукин Белгород, 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ВОНДИМТЕКА ТЕСФАЙЕ ДЕССАЛЕГН ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ УПРАЖНЕНИЙ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ГОРНОЙ ГИПОКСИИ И СУБТРОПИЧЕСКОГО КЛИМАТА ЭФИОПИИ 03.03.01 Физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Т. Шаов Нальчик-2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР...»

«ГУРЬЯНОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА ПОВЫШЕНИЕ ЗИМОСТОЙКОСТИ И ПРОДУКТИВНОСТИ ЯБЛОНИ РЕГУЛИРОВАНИЕМ УСТОЙЧИВОСТИ ПОКОЯ ОРГАНИЧЕСКИМ И МИНЕРАЛЬНЫМ ПИТАНИЕМ 06.01.08 – плодоводство, виноградарство Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Воробьев Вячеслав Филиппович Москва 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..4 1....»

«Сафина Татьяна Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ ПОЛУШАРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА В РЕГУЛЯЦИИ ЭРГОТРОПНЫХ И ТРОФОТРОПНЫХ ФУНКЦИЙ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный...»

«Палий Иван Николаевич ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ AGASTACHE FOENICULUM PURSH. И NEPETA CATARIA VAR. CITRIODORA BECK. В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО БЕРЕГА КРЫМА 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Ильницкий О.А. Оглавление ВВЕДЕНИЕ 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА О...»

«Митин Игорь Николаевич Психофизиологическая адаптация как ведущий фактор обеспечения безопасности дорожного движения 05.26.02. Безопасность в чрезвычайных ситуациях (медицина катастроф) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор В. Ю. Щебланов Москва,...»

«21 мая 2014 года на заседании Диссертационного совета Д.002.044.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН состоялось рассмотрение диссертации Карантыш Галины Владимировны «Онтогенетические особенности поведенческих реакций и функциональных изменений в мозге крыс в моделях ишемии/гипоксии» на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.01 – «Физиология». Присутствовало на заседании _20_...»

«ЯБЛОНСКАЯ Елена Карленовна ЭКЗОГЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОДУКЦИОННОГО ПРОЦЕССА, КАЧЕСТВА ЗЕРНА И УСТОЙЧИВОСТИ К ФИТОПАТОГЕНАМ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Научный консультант: Д.с.-х.н., профессор Котляров В.В....»

«Мезенцева Ольга Александровна ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ СТУДЕНТОВБАКАЛАВРОВ МЛАДШИХ И СТАРШИХ КУРСОВ С УЧЕТОМ ИХ ЦЕННОСТНЫХ ОРИЕНТАЦИЙ 03.03.01. Физиология Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Научный руководителькандидат биологических наук, профессор Овсянникова Н. Н. Москва...»

«Котельникова Светлана Владимировна НЕЙРОЭНДОКРИННЫЙ ГОМЕОСТАЗ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО СТРЕССА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ ОСВЕЩЕННОСТИ Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор Д.Л....»

«ИВАНОВА ЭМИЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ РАКА ЖЕЛУДКА И ТОЛСТОЙ КИШКИ Специальность:14.01.12 – онкология 14.03.03 – патологическая физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор КОНДАКОВА И.В. доктор медицинских наук ЧЕРЕМИСИНА...»

«СОКОЛОВА ЕКАТЕРИНА ПАВЛОВНА Эхография в диагностике внутрилегочных повреждений и осложнений у пострадавших с закрытой травмой груди 14.01.13. лучевая диагностика, лучевая терапия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н., профессор Е.Ю. Трофимова Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений ВВЕДЕНИЕ..5...»

«Хайбуллина Светлана Францевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА ХАНТАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: д.б.н., доцент Ризванов А.А. КАЗАНЬ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность исследования ГЛАВА 2. ОБЗОР...»

«ГАЛЯМИНА АННА ГЕОРГИЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ДЕПРЕССИИ И ТРЕВОЖНОСТИ В РАЗВИТИИИ СМЕШАННОГО ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНОГО РАССТРОЙСТВА: ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД (03.03.01) «физиология» Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: профессор, д. б. н. Н.Н. Кудрявцева Новосибирск 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«КАЛЮЖНЫЙ Евгений Александрович МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ УЧАЩИХСЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ 03.03.01 – физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты – доктор биологических наук, профессор В.Н.Крылов доктор медицинских...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.