WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

«ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНДОВ ПРОТОН-АКТИВИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ ...»

На правах рукописи

Нагаева Элина Ильдаровна

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНДОВ

ПРОТОН-АКТИВИРУЕМЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ

Специальность 03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов



Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный руководитель: Тихонов Денис Борисович доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Козлов Сергей Александрович, доктор химических наук, старший научный сотрудник лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ФГБУН Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук Казначеева Елена Валентиновна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией ионных каналов клеточных мембран ФГБУН Института цитологии Российской Академии Наук Ведущее научное учреждение: ФГБУН Казанский Институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита диссертации состоится «1» декабря 2015 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии Наук (194223, Санкт-Петербург, пр.

Тореза, д. 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, http://www.iephb.ru/sovet.htm

Автореферат разослан «______» _____________ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Парнова Р.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протон-активируемые ионные каналы (ASICs) относятся к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов и активируются в ответ на локальное закисление внеклеточной среды.

Впервые протон-вызванные ионные токи были описаны Крышталем и Пидопличко в 1980 году (Krishtal & Pidoplichko, 1980). Авторы предположили, что понижение pH внеклеточной среды активирует популяцию управляемых протонами ионных каналов.

Долгое время отсутствие селективных антагонистов порождало различные гипотезы относительно природы протон-вызванных токов. И только клонирование протонактивируемых ионных каналов в середине 90-х годов определило их как новое семейство рецепторов. С этого времени начались полномасштабные исследования по локализации, фармакологии и физиологии ASICs.

Протон-активируемые ионные каналы широко распространены как в периферической (ПНС), так и в центральной нервной системе (ЦНС) позвоночных животных. Плотность экспрессии субъединиц ASIC сильно отличается в разных структурах. Так, субъединицы ASIC1a, ASIC2a и ASIC2b чаще можно встретить в ЦНС, в таких областях как гиппокамп, миндалевидное тело, мозжечок, полосатое тело, кора больших полушарий и обонятельные луковицы (Alvarez de la Rosa et al., 2002; Bolshakov et al., 2002; Wemmie et al., 2003). В ПНС, напротив, преобладают ASIC1b и ASIC3 субъединицы; их можно встретить в чувствительных нейронах задних корешков спинного мозга, тройничного и блуждающего нервов. Ввиду столь широкого распространения, большое количество исследований показывают вовлеченность протон-активируемых ионных каналов во многие патологические и нормальные физиологические процессы, такие как восприятие болевых стимулов (Wemmie et al., 2006), процессы синаптической пластичности, страх и депрессия (Wemmie et al., 2004), наркотическая зависимость (Kreple et al., 2014). Стоит отметить, что все сведения о физиологической роли протонактивируемых ионных каналов являются косвенными, поскольку основаны на экспериментальных данных, полученных с использованием нокаутов по генам, кодирующим субъединицы ASIC.

Одной из основных проблем в изучении функции, строения и механизмов работы является ограниченный набор фармакологических инструментов, ASIC-каналов способных избирательно влиять на работу каналов с разным субъединичным составом.





Так, на настоящий момент только гомомеры ASIC1a и ASIC3 могут быть специфически ингибированы псалмотоксином 1 (PcTX1) (Escoubas et al., 2000) и токсином APETx2 (Diochot et al., 2004), соответственно. Таким образом, поиск и разработка стратегий синтеза новых специфических лигандов ASICs является актуальной научной задачей.

Обнаружение избирательных соединений даст ценный набор фармакологических инструментов для исследования физиологической функции протон-активируемых ионных каналов в ЦНС.

Цель и задачи работы. Ранее в лаборатории биофизики синаптических процессов ИЭФБ РАН был проведён скрининг гидрофобных моноаминных соединений из числа блокаторов глутаматных рецепторов на наличие активности в отношении протонактивируемых каналов. Именно этот класс соединений был выбран ввиду их простой химической структуры, включающей гидрофобную часть и терминальную аминогруппу.

Такой выбор предполагал решение сразу двух задач: поиск синтетических избирательных агонистов/антагонистов, а также движение в сторону выявления эндогенных соединений, являющихся моноаминами (катехоламины, серотонин, гистамин и пр.). В предварительных экспериментах на интернейронах гиппокампа крыс были обнаружены четыре блокатора NMDA рецепторов, способных модулировать протон-вызванные токи через нативные ASICs (nASICs). Эти четыре соединения имели довольно схожие химические структуры, однако оказывали разнонаправленное действие на нативные рецепторы. Два из них, ИЭМ-1921 и ИЭМ-2117, увеличивали амплитуду тока через nASICs при совместной аппликации с кислым раствором. Другие два соединения, 9аминоакридин и мемантин, напротив, ингибировали токи через nASICs. Соответственно, данная работа стала логическим продолжением проекта, начатого в 2012 году на интернейронах гиппокампа.

Целью настоящей работы являлось изучение действия гидрофобных моноаминов на протон-активируемые ионные каналы (ASICs), а также поиск эндогенных лигандов этих каналов.

В соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить действие четырёх найденных ранее соединений (9-аминоакридин, мемантин, ИЭМ-1921 и ИЭМ-2117) на все возможные гомомерные ASICs, экспрессированные в клетках линии CHO;

2. Выявить структурные компоненты гидрофобных моноаминов, определяющие их действие на протон-активируемые каналы разного субъединичного состава, используя структурно-функциональный подход;

3. Проанализировать механизм действия наиболее активных моноаминов: потенциалзависимость, кинетику действия, конкуренцию с агонистом;

4. Подобрать и протестировать эндогенные структурные аналоги исследованных соединений на активность в отношении ASICs.

Научная новизна. В данной работе впервые было показано и охарактеризовано действие нового химического класса лигандов протон-активируемых ионных каналов – гидрофобных моноаминов. Эти соединения, имеющие простую химическую структуру и состоящие из компактной гидрофобной части и терминальной аминогруппы, способны разнонаправленно модулировать работу всех функционально-активных гомомеров ASICs, в зависимости от субъединичного состава каналов.

Также были определены некоторые структурные детерминанты действия гидрофобных моноаминов на ASICs. Наличие протонируемой аминогруппы является критичным условием для реализации как ингибирующей, так и потенцирующей активности. Гидрофобная часть может варьировать, при этом V-образные структуры являются более эффективными потенциаторами ASIC2a каналов, чем плоские. Расстояние между гидрофобной группой и аминогруппой определяет потенцирование ASIC1a и ASIC2а каналов. При наличии двух метиленовых спейсеров потенцируются ASIC1a каналы, а при непосредственном примыкании - ASIC2a. Кроме того, был начат анализ механизмов взаимодействия данного класса веществ с ASIC-каналами, показавший, что существует как минимум два различных механизма ингибирования – зависящий и не зависящий от потенциала мембраны.

Впервые был обнаружен эндогенный модулятор ASICs – гистамин, способный избирательно потенцировать ASIC1a каналы. Действие этого соединения зависело от pH активирующего раствора. Максимальное потенцирование достигалось при слабом закислении. Физиологическая роль данного эффекта может состоять в обеспечении существенного тока через ASIC1a каналы при незначительном закислении в процессе синаптической передачи.

Теоретическая и практическая значимость данной работы заключается в том, что открытие нового класса лигандов протон-активируемых ионных каналов значительно расширило набор фармакологических инструментов, позволяющих избирательно влиять на каналы разного субъединичного состава. Намеченные в данной работе направления (выявленные структурно-функциональные закономерности, комплексность механизмов действия, открытие эндогенного модулятора) сами по себе являются довольно ёмкими, и дальнейшее их изучение представляется перспективным как с точки зрения фундаментальной, так и прикладной науки. Открытие непосредственного действия гистамина на ASICs позволяет по-новому взглянуть на физиологию гистаминергической системы, на её взаимовлияние с другими типами рецепторов. Кроме того, открытие взаимодействия ASICs и гистамина, делает поиск новых модуляторов/активаторов ASICs среди эндогенных моноаминов и их метаболитов весьма перспективным, приближая, тем самым, к более глубокому пониманию физиологической роли данного семейства каналов.

Результаты работы могут быть использованы для чтения лекций по физиологии, биологии клетки и биофизике для студентов биологических и медицинских специальностей высших учебных заведений.

Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде устных и стендовых докладов на Международном конгрессе FENS Featured Regional Meeting (Чехия, Прага, 2013); на Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); на международной школе-конференции «Горизонты современной нейронауки» (Нижний Новгород, 2014); на девятом форуме европейской федерации нейробиологов 9th FENS Forum of Neuroscience (Милан, Италия, 2014); на IV съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Сочи, Россия, 2014); на зимней международной научной школе «Современная биология и биотехнологии будущего» (Звенигород, Москва, 2015); на 11-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2015); на Международном конгрессе FENS Featured Regional Meeting (Салоники, Греция, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работах, 2 из которых

– статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 1 статья в международном журнале), и 8 тезисов.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит общей характеристики работы, обзора литературы по исследуемой теме – глава 1, описания методики – глава 2, описания результатов исследования и их обсуждения – глава 3, заключения – глава 4, выводов и списка литературы, который включает 193 источника (из них 190 иностранных). Работа иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения экспериментов, гомомерные ASIC-каналы экспрессировали в линии клеток яичника китайского хомячка (CHO). Для этого, культивируемые CHO клетки, высевали на стёкла площадью не более 25 мм2, равномерно распределённые по дну чашки Петри диаметром 35 мм. Трансфекция клеток плазмидами проводилась при помощи реагента «Липофектамин 2000» (Invitrogen, USA), в соответствии с протоколом производителя. Для экспрессии гомомерных каналов ASICs, клетки подвергали трансфекции с использованием 0.5 мкГ плазмиды, несущей ген, кодирующий нужную субъединицу (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a или ASIC3), совместно с 0.5 мкГ плазмиды, кодирующей последовательность флуоресцентного белка GFP - для дальнейшей идентификации трансфицированных клеток. Плазмиды, несущие гены ASICs, были любезно предоставлены нашей лаборатории доктором А. Старущенко.

Электрофизиологические эксперименты проводились через 36-72 часа после трансфекции.

Трансфицированные клетки детектировались по зелёному флуоресцентному свечению, при помощи микроскопа Leica DM IL (Leica Microsystems, Germany).

Токи, вызванные быстрым закислением среды, регистрировали при помощи метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации «целая клетка», позволяющего измерить интегральный мембранный ток через интересующий тип каналов.

Для этого был использован усилитель EPC-8 (HEKA Electronics, Germany); сигнал фильтровался в полосе частот 0-5 КГц, оцифровывался с частотой дискретизации 1 кГц, при помощи ЦАП-АЦП LIH 8+8 (HEKA Electronics, Germany), и далее записывался на персональный компьютер, при помощи программного обеспечения Patchmaster того же производителя (HEKA Electronics, Germany). Все эксперименты проводились при комнатной температуре (23-25°С).

Используемые растворы. Микропипеточный раствор содержал (в мМ): CsF 100, CsCl 40, NaCl 5, CaCl2 0.5, EGTA 5, HEPES 10 (pH доводился до 7.2 добавлением CsOH).

Внеклеточный раствор содержал (в мМ): NaCl 143, KCl 5, CaCl2 2.5, D-глюкоза 10, HEPES 10, MES 10, (pH доводился до 7.35 добавлением NaOH).

Растворы с низкими значениями pH, которые использовались для активации каналов, приготовлялись из базового внеклеточного раствора путём добавления HCl.

Тестируемые моноамины, были синтезированы ранее по нашему заказу В.Е. Гмиро в НИИ Экспериментальной Медицины города Санкт-Петербурга. Все остальные, используемые в данной работе и коммерчески доступные соединения, были приобретены в фирме Sigma.

Для получения стокового раствора соединения с концентрацией 5х10-2 М, навеска его кристаллической формы растворялась в бидистиллированной воде. Далее, нужный объём стокового раствора добавлялся к рабочим растворам с разными значениями рН. При приготовлении растворов тестируемых соединений, в каждом конкретном случае проверялся pH полученной смеси и, при обнаружении сдвига, доводился до необходимого при помощи 0.1 н раствора HCl или 0.2 н раствора NaOH. Для подачи тестовых соединений использовалась многоканальная система быстрой аппликации веществ ALAVM8 (ALA Scientific Instruments, USA). Интервал между тестовыми аппликациями составил 60 с.

Все данные представлены в виде «значение ± стандартное отклонение» на основе, как минимум, 5 экспериментов. Статистическая значимость эффектов была проанализирована при помощи парного t-теста с p=0.05 (значение амплитуды ответа в присутствии тестируемого соединения относительно контроля). Анализ формы ответа проводился путём измерения времени нарастания тока с 10% до 90% от максимальной амплитуды, и расчётом постоянной времени спада ответа, при помощи моноэкспоненциальной аппроксимации по методу наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие гидрофобных моноаминов на гомомерные ASIC каналы Для первичной оценки активности соединений применялся протокол совместной аппликации с закисленным раствором, имеющим pH близкий по значению к pH 50 для каждого типа рецептора.

Действие на ASIC1a каналы. Все протестированные соединения не вызывали токов через ASIC1a каналы, при совместной аппликации с нейтральным (pH 7.4) раствором. Из четырёх соединений, ранее протестированных на нативных каналах, только ИЭМ-1921 не проявил активности при закислении среды до рН=6.5, даже в концентрации 1000 мкМ.

Три других – 9АА, ИЭМ-2117 и мемантин вызывали концентрационно-зависимый ингибирующий эффект разной степени выраженности. Наиболее активным ингибитором оказался 9-аминоакридин. 1000 мкМ соединения вызывали 67±8% (n=6) ингибирование (Рис.1, А). В связи с тем, что подавление ответа было достаточно сильным, для этого соединения удалось построить кривую концентрационной зависимости ингибирования (Рис. 1, Б), и определить параметр IC50 = 400±100 мкМ (n=5).

Вторым по активности был широко известный и применяемый в клинике блокатор NMDA-рецепторов – мемантин (Chen et al., 1992). Максимальная тестируемая в экспериментах концентрация 1000 мкМ снижала амплитуду контрольного ответа наполовину (50±10%, n=6) (Рис.1, В). Аналог 9-аминоакридина с пятичленным центральным циклом – ИЭМ-2117, оказался наименее активным ингибитором ASIC1a каналов: 1000 мкМ соединения ингибировали 31±6% (n=5) ответа на pH 6.5 (Рис. 1, Г).

Поскольку насыщающий эффект действия как мемантина, так и ИЭМ-2117, не был достигнут, построить концентрационные кривые для двух данных соединений не представлялось возможным.

–  –  –

Рисунок 1. Действие гидрофобных моноаминов на ASIC1a.

А, примеры токов через ASIC1a каналы в отсутствии и в присутствии 1 мМ 9АА. Б, кривая концентрационной зависимости ингибирования ASIC1a каналов 9АА. В, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ мемантина. Г, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ ИЭМ-2117.

Действие на ASIC2a каналы. Все протестированные соединения не вызывали токов через ASIC2a каналы, при совместной аппликации с нейтральным раствором.

По сравнению с гомомерными ASIC1a каналами, ASIC2a менее чувствительны к изменениям pH раствора, потому первые токи наблюдались при понижении pH до 6.2.

Соответственно, оптимальное значение pH для активирующего раствора было установлено на отметке 5.0. В случае ASIC2a каналов, проявившие активность соединения вызывали не ингибирование, а потенцирование ответов. Только 9-аминоакридин – наиболее эффективный ингибитор ASIC1a каналов, не проявил активности в отношении ASIC2a гомомеров, даже в концентрации 1000 мкМ. Напротив, неактивное в отношении ASIC1a гомомеров производное фенициклогексила - ИЭМ-1921, оказало наиболее выраженное потенцирующее действие на ASIC2a-вызванные токи. 1000 мкМ соединения, при совместной аппликации с раствором, имеющим pH=5.0, увеличивали амплитуду ответа на 206±60% (n=8) (Рис.2, А).

ИЭМ-2117 оказывал схожий с ИЭМ-1921 потенцирующий эффект на ASIC2a каналы. 1000 мкМ вещества более чем в 2 раза увеличивали ответ через ASIC2a каналы (на 160±40%, n=7) (Рис.2, Б). Мемантин также потенцировал ASIC2a-вызванные токи. При этом, максимальный эффект вызывала концентрация в 500 мкМ, увеличивая ответ на предъявление раствора, имеющего pH = 5.0, ровно в 2 раза (на 100±20%, n=5) (Рис. 2, В).

Поскольку насыщающая концентрация вещества была достигнута, то в отличие от двух других соединений, для мемантина удалось установить параметр EC50 = 80±20 мкМ (n=5) (Рис. 2, Г).

–  –  –

Рисунок 2. Действие гидрофобных моноаминов на ASIC2a.

А, примеры токов через ASIC2a каналы в отсутствии и присутствии 1 мМ ИЭМ-1921. Б, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ ИЭМ-2117. Г, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ мемантина. Д, кривая концентрационной зависимости потенцирования ASIC2a каналов мемантином.

Действие на ASIC1b каналы. Субъединица ASIC1b является продуктом альтернативного сплайсинга гена accn2, дающего так же ASIC1a-субъединицу. Можно было предполагать, что действие исследуемых соединений будет схожим с ранее полученными результатами на ASIC1a. Однако это предположение оказалось верным только для некоторых из соединений. Как и в случае с ASIC1a, производное фенилциклогексила - ИЭМ-1921, не проявило активности в отношении ASIC1b каналов в

–  –  –

Рисунок 3. А, кривая концентрационной зависимости ингибирования ASIC1b каналов 9аминоакридином.

Б, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ 9АА. В, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ мемантина.

Загрузка...

Действие на ASIC3 каналы. ASIC3 каналы сильно отличаются по свойствам от других представителей данного семейства. Так, только ток через ASIC3 характеризуется наличием хорошо выраженного стационарного компонента. Пиковый компонент десенситизирует до стационарного за 0.9±0.2 с (n=6), после чего рецептор переходит в состояние равновесной десенситизации. Таким образом, ASIC3 это единственный представитель семейства ASICs, проводящие постоянный ток в присутствии агониста.

Все четыре исследованных соединения оказали потенцирующий эффект разной интенсивности на стационарный компонент тока, при совместной аппликации с активирующим раствором, имеющим pH 6.85.

Наиболее сильный эффект имел ИЭМ-2117:

1000 мкМ этого соединения увеличивали стационарный компонент ответа более чем в 10 раз (на 1100±400%, n=5) (Рис. 4, А). При этом, описанный эффект не являлся максимальным, и насыщающая концентрация ИЭМ-2117 не была определена.

также оказал выраженное потенцирующее действие на 9-аминоакридин стационарный компонент ответ ASIC3 каналов: 300 мкМ соединения увеличивали ответ в

3.5 раза (Рис.4, Б). Однако в случае 9АА это была максимально возможная потенциация, соответственно, удалось установить параметр EC50, который равнялся 120±20 мкМ (n=6).

Два оставшихся соединения, ИЭМ-1921 и мемантин, были менее эффективны;

максимальная тестируемая концентрация 1000 мкМ вызывала 120±40% (n=5) и 110±40% (n=6) потенциации, соответственно (Рис. 4, В-Г).

Несмотря на однонаправленный эффект всех четырёх соединений в отношении стационарного компонента тока через ASIC3 каналы, действие на пиковый компонент было различным. ИЭМ-2117 также потенцировал пиковый компонент, но с гораздо меньшей интенсивностью: 1000 мкМ соединения увеличивали пиковый компонент ответа на 87±40% (n=8) (Рис. 4, А). Мемантин также имел тенденцию к потенциации пикового компонента, однако эффект не был статистически достоверен ( 0.05, n=7) (Рис. 4, Г). В то же время, два других соединения ингибировали пик. 1000 мкМ ИЭМ-1921 вызывали 48±15% (n=5) ингибирования, действие 9-аминоакридина было более интенсивным и 1000 мкМ вещества практически полностью убирали пиковый компонент, оставляя только потенцированный стационарный (Рис. 4,.Г-Д).

Помимо потенцирования стационарного компонента протон-вызванного тока через ASIC3 каналы, ИЭМ-2117 был способен вызывать ток, при совместной аппликации с раствором, имеющим нейтральный pH (7.4). Ответ на 1000 мкМ соединения по амплитуде равнялся 77±12 % (n=5) от стационарного компонента контрольного ответа на раствор, имеющий pH 6.85 (Рис.4, Д). Таким образом, в нашей работе был найден активатор ASIC3-гомомерных каналов, схожий по эффективности с GMQ (Yu et al., 2010), однако имеющий совершенно другую химическую структуру.

Таким образом, нам удалось установить, что гидрофобные моноамины способны модулировать работу всех типов гомомерных протон-активируемых ионных каналов, и что направленность эффекта зависит от субъединичного состава. Однако оставалось не ясным, какие молекулярные детерминанты ответственны за выраженность ингибирующего и потенцирующего действия исследованных соединений. В связи с этим, было решено провести структурно-функциональный анализ, с использованием структурных аналогов всех четырёх соединений.

–  –  –

Рисунок 4. Действие гидрофобных моноаминов на ASIC3 каналы.

А, пример токов в контроле и в присутствии 1 мМ ИЭМ-2117. Б, пример наложения токов в контроле и в присутствии 300 мкМ 9АА. В-Г, пример наложения токов в контроле и в присутствии 1 мМ ИЭМ-1921 и мемантина, соответственно. Д, ИЭМ-2117 вызывает токи через ASIC3 каналы в нейтральной среде (pH 7.4). Для сравнения показан ответ на pH 6.85.

2. Структурно-функциональный анализ Исследование структурных аналогов исходных соединений проводилось на ASIC1a и ASIC2a гомомерах, экспрессирующихся главным образом в ЦНС позвоночных.

В ходе структурно-функционального анализа было протестировано 7 аналогов 9-аминоакридина, 4 аналога ИЭМ-1921 – производных фенилциклогексила, а также 6 аналогов мемантина – производных адамантана. Активность 500 мкМ каждого соединения оценивалась в протоколе совместной аппликации с активирующим раствором, имеющим pH 6.5 для ASIC1a и 5.0 для ASIC2a каналов.

–  –  –

3. На ASIC2a наблюдался только потенцирующий эффект соединений. Соединения с V-образной гидрофобной частью молекулы оказались наиболее активными потенциаторами. Любое изменение радикала (увеличение числа метиленовых спейсеров между аминогруппой и гидрофобной частью, дикатионный радикал) ведёт к снижению или потери потенцирующей активности;

4. На ASIC1a исследованные соединения оказывали как ингибирующий, так и потенцирующий эффект: последний был обнаружен при вставке одного и двух метиленовых спейсеров между гидрофобной частью и аминогруппой ИЭМ-1921.

Для более детального понимания принципов взаимодействия гидрофобных моноаминов с ASIC каналами был предпринят анализ механизмов работы наиболее активных соединений.

–  –  –

Рисунок 5. Влияние мемантина и 9АА на форму ответа ASIC1a каналов.

А, пример токов в контроле и в присутствии 1 мМ мемантина. Б, пример токов в контроле и в присутствии 1 мМ 9АА. Здесь и далее: на рисунках А и Б чёрным показан контрольный ответ на pH, серым - ответ на pH в присутствии тестируемого соединения, светло серым – ответ в присутствии вещества, нормализованный по амплитуде до уровня контрольного ответа.

Напротив, действие 9АА не зависело от потенциала мембраны (Табл. 1). Анализ pH-зависимости показал наличие конкурентно-подобного механизма действия этого соединения, проявляющегося в снижении сродства протонов к каналу. Ингибирующий эффект снижался, при увеличении концентрации протонов в среде: 300 мкМ 9аминоакридина ингибировали 79±6% (n=5) тока, при совместной аппликации с раствором, имеющим pH 6.8; при увеличении концентрации протонов до насыщающей (pH 5.0), та же концентрация 9АА ингибировала только 12±9% (n=5) ответа.

Таблица 1. Потенциал-зависимость действия.

–  –  –

Другим доказательством в пользу конкурентно-подобного механизма является характер действия 9АА на ASIC1b гомомеры. В присутствии 9АА не только уменьшалась амплитуда, но и замедлялась кинетика ответа ASIC1b, напоминая кинетику ответа на аппликацию раствора с низкой концентрацией протонов (Рис. 6, А-Б). В обоих случаях, подобная форма ответа может быть результатом асинхронности активации каналов.

А Б

–  –  –

Рисунок 6. 9АА замедляет кинетику ответа ASIC1b каналов.

А, пример токов в контроле и в присутствии 1 мМ 9АА. Б, примеры токов в ответ на более низкую (серый) и более высокую (чёрный) концентрацию протонов.

Сочетание двух разнонаправленных эффектов в пределах одного канала. Анализ pH-зависимости действия ИЭМ-1921 выявил, что выраженность потенцирующего эффекта уменьшается, при активации ASIC2a насыщающими концентрациями протонов (pH=4.0) по сравнению с активацией низкими концентрациями (рН=6.0) (Рис. 7). Такое действие может объясняться увеличением сродства протонов к каналу в присутствии ИЭМ-1921.

–  –  –

Рисунок 7. pH-зависимость действия ИЭМ-1921 на ASIC2a каналы.

Показан потенцирующий эффект при низкой (А) и высокой (Б) концентрации протонов в среде Помимо pH-зависимости, потенцирующая активность ИЭМ-1921 зависела от потенциала мембраны, уменьшаясь при гиперполяризации (Табл.1). То есть действие ИЭМ-1921 сочетает аллостерический механизм потенциации, аналогичный по рН зависимости но противоположный по знаку ингибирующему действию 9АА, а также потенциал-зависимый механизм ингибирования, характерный для мемантина.

Сочетание двух разнонаправленных эффектов наблюдалось также в действии гидрофобных моноаминов на ASIC3 каналы. 9-аминоакридин, как говорилось ранее, концентрационно-зависимо ингибировал пик ответа и в то же время потенцировал плато.

При этом коэффициенты Хилла, отражающие кооперативность связывания лиганда с рецептором, для двух этих эффектов различались.

Подобные явления можно объяснить наличием как минимум двух сайтов связывания гидрофобных моноаминов в ASICs: (1) находящийся во внутримембранной части канала и ответственный за потенциал-зависимое ингибирование и (2) находящийся во внеклеточной части канала и ответственный за ингибирование и потенцирование, не зависящие от потенциала. Наличие двух сайтов объясняет также сложные структурно-функциональные отношения, выявленные в предыдущем разделе.

4. Действие гистамина на ASICs.

Одной из основных стратегических задач выполненного исследования являлся поиск эндогенных моноаминов, способных модулировать работу протон-активируемых ионных каналов в физиологических условиях. Идея заключалась в том, что ASICs довольно широко распространены в ЦНС позвоночных и, следовательно, должны нести некую функциональную нагрузку. При этом, изменения pH, которые сопровождают нормальные физиологические процессы, недостаточны для их активации. Соответственно, мы предположили наличие положительных модуляторов этих ионных каналов среди постоянно присутствующих или периодически выделяющихся во внеклеточную среду соединений.

Благодаря проведённому структурно-функциональному исследованию, нам удалось обнаружить довольно эффективный потенциатор как ASIC1a, так и ASIC2a каналов – производное фенилциклогексила ИЭМ-2044. При подборе структурных аналогов этого соединения из числа эндогенных моноаминов, мы обнаружили, что гистамин во многом схож по строению с этим соединением (Табл. 2).

Проведенные эксперименты показали, что гистамин был способен избирательно потенцировать ASIC1а-вызванные токи, при совместной аппликации с кислым раствором.

По отношению к остальным субъединицам этот эндогенный моноамин не проявил активности даже в концентрации 1000 мкМ, хотя и не вызывал токов через ASIC1a каналы в нейтральной среде.

Таблица 2. Структурные формулы ИЭМ-2044 и гистамина.

Оба соединения имеют гидрофильный хвост одинакового строения.

–  –  –

Выраженность потенцирующего эффекта гистамина сильно зависела от pH активирующего раствора. Одна и та же концентрация в 1000 мкМ потенцировала ответ на аппликацию раствора, имеющего pH 7.0, в 3 раза (на 190±50%, n=6), а ответ на аппликацию раствора с насыщающей концентрацией протонов (pH 5.0) всего на 14±13% (n=5) (Рис. 8,А- Б).

–  –  –

Рисунок 8. pH-зависимость действия гистамина на ASIC1a каналы.

Действие 1 мМ гистамина в присутствии низкой (А) и высокой (Б) концентрации протонов. В, активационные кривые (зависимость амплитуды ответа от концентрации протонов) в контроле и в присутствии 1 мМ гистамина. Стрелкой показан параллельный сдвиг кривой.

Для более детального анализа действия гистамина, были построены кривые pHзависимости активации ASIC1a каналов в контроле и в присутствие 1000 мкМ гистамина (Рис. 8, В). На графике видно, что максимально-возможная амплитуда ответа остаётся прежней, однако под действием гистамина происходит параллельный сдвиг активационной кривой в более щелочную область. То есть, в присутствии лиганда, для активации канала требуется меньшая концентрация протонов, чем в контроле. Подобная зависимость действия потенциатора от концентрации агониста может указывать на два возможных механизма действия этого соединения: (1) агонистический эффект к одному из сайтов связывания протонов – поскольку в нейтральной среде гистамин не способен вызывать входящие токи, но, возможно, способен предоставлять протон терминальной аминогруппы в качестве дополнительного активатора ASIC1a; либо (2) за счёт аллостерического механизма, увеличивающего сродство протонов к связывающему сайту.

Выявленная pH-зависимость потенцирующего эффекта гистамина может иметь большое физиологическое значение. Поскольку аксоны гистаминергических клеток достигают практически все области мозга, проекции их могут распространяться и на структуры с высоким уровнем экспрессии ASIC1a субъединицы. В этих участках, в момент высвобождения гистамина из пресинаптической терминали, одновременно будет достигаться довольно высокая концентрация гистамина и понижение pH внеклеточного раствора. Сумма этих двух событий способна синергетически усилить амплитуду ASIC1a-вызванных токов, делая их значимыми для модуляции возбудимости.

ВЫВОДЫ

1. Гидрофобные моноамины – новый химический класс лигандов протонактивируемых ионных каналов. Эти соединения способны модулировать работу всех функционально-активных гомомеров ASICs, а также нативных каналов. При этом направленность действия (ингибирование или потенцирование) зависит от субъединичного состава каналов.

2. Протонируемая аминогруппа является необходимой структурной детерминантой активности гидрофобных моноаминов относительно ASICs. Гидрофобная часть может варьировать, при этом структуры являются более V-образные эффективными потенциаторами ASIC2a каналов, чем плоские. Расстояние между гидрофобной группой и аминогруппой определяет потенцирование ASIC1a и ASIC2а каналов. При наличии двух метиленовых спейсеров потенцируются ASIC1a каналы, а при непосредственном примыкании - ASIC2a.

3. Существуют два различных механизма ингибирования ASICs гидрофобными моноаминами, зависящий и независящий от потенциала мембраны. Возможно комплексное действие, состоящее в потенциал-зависимом ингибировании и потенцировании, независимом от мембранного потенциала.

4. Гистамин является эндогенным избирательным потенциатором ASIC1a каналов.

pH-зависимость его действия предполагает, что механизм потенцирования состоит в усилении сродства ASIC1a к протонам или в агонистическом действии.

5. Поскольку гистамин наиболее сильно потенцирует ответы, вызванные малыми закислениями среды, физиологическая роль данного эффекта может состоять в обеспечении существенного тока через ASIC1a каналы при незначительном закислении в процессе синаптической передачи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Tikhonova T.B., Nagaeva E.I., Barygin O.I., Potapieva N.N., Bolshakov K. V, Tikhonov D.B. Monoamine NMDA receptor channel blockers inhibit and potentiate native and recombinant proton-gated ion channels // Neuropharmacology. 2014. V. 89. P. 1–10.

2. Нагаева Э.И., Потапьева Н.Н., Тихонов Д.Б. Действие гидрофобных моноаминов на протон-активируемые ионные каналы ASIC1b // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 2. С. 102

– 109.

Тезисы докладов:

1. Nagaeva E.I., Potapieva N.N., Tikhonov D.B. Searching for potent monoamine modulators of acid-sensing ion channels: structure-functional project // FENS Featured Regional Meeting – Thessaloniki – 2015 – PSI-M04.

2. Нагаева Э.И., Потапьева Н.Н., Тихонова Т.Б., Тихонов Д.Б. Сравнение действия гидрофобных моноаминов на сплайс варианты гена accn2 – протон-активируемые ионные каналы ASIC1a и ASIC1b // XI международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» – Судак – 2015 – С. 288.

3. Барыгин, О.И., Нагаева, Э.И., Тихонова, Т.Б., Потапьева, Н.Н., Большаков, К.В., Тихонов, Д.Б. Сравнение механизмов действия моноаминных соединений на нативные и рекомбинантные протон-управляемые ионные каналы // XI международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» – Судак – 2015 – С. 78.

4. Нагаева, Э.И., Барыгин, О. И., Потапьева, Н.Н., Большаков, К.В.,Тихонов, Д. Б.

Влияние производных 9-аминоакридина и фенилциклогексила на рекомбинантные протон-управляемые ионные каналы ASIC1a и ASIC2a // Научные труды IV съезда физиологов СНГ – Сочи – 2014 – С. 53 – 54.

5. Nagaeva, E. I., Tikhonova, T. B., Barygin, O.I., Potapieva, N. N., Bolshakov, K.V., Tikhonov, D. B. Monoamine NMDA receptor blockers inhibit and potentiate native and recombinant acid-sensing ion channels // 9th FENS Forum of Neuroscience – Milan – 2014 -

Abstract

Number: 0271

6. Nagaeva, E. I. Monoamine NMDA receptor blockers inhibit and potentiate native and recombinant acid-sensing ion channels // International scientific school “Frontiers in Modern Neuroscience” – N. Novgorod – 2014 – Book of abstracts – P. 27 – 28.

7. Нагаева, Э.И., Тихонова, Т.Б., Барыгин, О.И., Потапьева, Н.Н., Большаков, К.В., Ким, К.Х., Тихонов, Д.Б. Новый химический класс лигандов протон-активируемых ионных каналов // Всероссийская молодежная конференция-школа «Нейробиология интегративных функций мозга» – Санкт-Петербург – 2013 – С. 54 – 55.

8. Nagaeva, E. I., Tikhonova, T. B., Potapjeva, N.N., Dorofeeva, N. A., Bolshakov, K. V., Tikhonov, D. B. New chemical class of ASIC3 potentiators // FENS Featured Regional Meeting – Prague – 2013 – Abstract Number: PIII-B-001.



Похожие работы:

«ПОХАЧЕВСКИЙ АНДРЕЙ ЛЕОНИДОВИЧ АДАПТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СЕРДЕЧНОГО РИТМА В ДИНАМИКЕ НАГРУЗОЧНОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У СТАРШИХ ШКОЛЬНИКОВ И СТУДЕНТОВ 03.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук Рязань, 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения...»

«СТЕФАНОВА Наталья Анатольевна ИССЛЕДОВАНИЕ КРЫС OXYS КАК МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск –2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск. Научный...»

«Борисевич Сергей Александрович ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КОЖИ ПРИ ЗАНЯТИЯХ СПОРТОМ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре теории и методики прикладных видов спорта педагогического института физической культуры и спорта Государственного автономного образовательного учреждения высшего образования города Москвы «Московский городской педагогический университет» (ГАОУ ВО МГПУ)...»

«Андриенко Людмила Алексеевна ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПЫЛЕВОГО ФАКТОРА 14.03.03 – патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Кемерово – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской...»

«Овчинников Руслан Константинович Создание и характеристика новой трансгенной модели бокового амиотрофического склероза, основанной на нейроспецифической экспрессии патогенной формы белка FUS 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук и в Федеральном...»

«Борисевич Сергей Александрович ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КОЖИ ПРИ ЗАНЯТИЯХ СПОРТОМ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре теории и методики прикладных видов спорта педагогического института физической культуры и спорта Государственного автономного образовательного учреждения высшего образования города Москвы «Московский городской педагогический университет» (ГАОУ ВО МГПУ)...»

«Мамаева Анна Станиславовна Регуляция оксидом азота клеточного цикла в культуре Arabidopsis thaliana in vitro в зависимости от функционирования пути передачи этиленового сигнала 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва, Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А....»

«Тян Юлия Аркадьевна Влияние стереоизомерии женского организма на репродуктивную функцию при нормальной и сниженной фертильности 03.03.01 Физиология 14.01.01 Акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научные...»

«АРТЕМЕНКОВ Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Смоленск Работа выполнена на кафедре теории и методики физической культуры и спорта ФГБОУ ВПО «Череповецкий государственный университет» Научный консультант: Брук Татьяна Михайловна, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой...»

«Иванов Андрей Дмитриевич ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ УГНЕТЕНИИ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ В ГИППОКАМПЕ БЕТААМИЛОИДНЫМ ПЕПТИДОМ Специальность 03.03.01 – «Физиология» Специальность 03.01.03 – «Молекулярная биология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в лаборатории нейрофизиологии обучения и в лаборатории молекулярной нейробиологии Института Высшей Нервной Деятельности и...»

«Кузьменко Александр Анатольевич РАСТИТЕЛЬНОСТЬ МОРЕННЫХ И ВОДНО-ЛЕДНИКОВЫХ РАВНИН ЮЖНОЙ ОКРАИНЫ СМОЛЕНСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Брянск 2014 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского» доктор биологических наук, профессор Научный руководитель: Булохов Алексей Данилович Официальные оппоненты:...»

«Никишина Юлия Олеговна РОЛЬ ДОФАМИНА МОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ГИПОФИЗА В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ ОРГАНИЗМЕ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,...»

«Фролов Александр Акимович Функциональные особенности респираторной системы беременных в предродовом периоде и в родах в зависимости от стереоизомерии женского организма и их влияние на состояние плода 03.03.01 физиология 14.01.01 акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2015 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и...»

«БОБОХОНОВ РУСТАМ САТТОРОВИЧ ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ КАРТОФЕЛЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПОСОБОВ УСИЛИВАЮЩИХ АДАПТАЦИОННЫЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА Специальность 06.01.01.– общее земледелие, растениеводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора сельскохозяйственных наук Душанбе – 2015 Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии сельскохозяйственных культур Таджикского аграрного университета им. Ш.Шотемур (1993-2014гг). Научный кондоктор...»

«Долгова Анна Сергеевна ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ. Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук Научный руководитель:...»

«Синдеева Ольга Александровна МЕХАНИЗМЫ СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОЙ ГЕМОДИНАМИКИ И ИХ РОЛЬ В РАЗВИТИИ ИНТРАКРАНИАЛЬНЫХ ГЕМОРРАГИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫС 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань – 2015 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«ТОМАШЕВИЧ НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА РОСТОВЫЕ И ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ, УРОЖАЙНОСТЬ И КАЧЕСТВО РИСА НА ПОЧВАХ ПРАВОБЕРЕЖЬЯ Р. КУБАНЬ 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский...»

«Дембицкая Юлия Владимировна Регуляция синаптической передачи активацией постсинаптических рецепторов, астроглией и внеклеточным матриксом мозга Специальность 03.03.01 — Физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Казань – 2015 Работа выполнена на кафедре нейродинамики и нейробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородского государственного...»

«Буряков Николай Петрович Физиологическое обоснование эффективности использования кормов с повышенным уровнем нитратов в рационах крупного рогатого скота 03.03.01 – Физиология 06.02.08 – Кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Дубровицы – 2010 Работа выполнена на кафедре кормления животных зооинженерного факультета ФГОУ ВПО Российского государственного...»

«Гурбанова Ляля Русдамовна Особенности вегетативной регуляции вариабельности сердечного ритма в репродуктивном, преи постменопаузальном периодах в зависимости от стереоизомерии женского организма 03.03.01 физиология 14.01.01 – акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.