WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«Доронина Наталья Викторовна Уровень антител к HLA в прогнозе отторжения почечного трансплантата Специальность: 14.03.09. клиническая иммунология, аллергология 14.01.24. трансплантология ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное учреждение

здравоохранения г. Москвы

Научно-исследовательский институт скорой помощи

имени Н.В. Склифосовского

Департамента здравоохранения г. Москвы

на правах рукописи

Доронина Наталья Викторовна

Уровень антител к HLA в прогнозе отторжения

почечного трансплантата

Специальность: 14.03.09. клиническая иммунология, аллергология

14.01.24. трансплантология и искусственные органы

Диссертация



на соискание учёной степени

кандидата наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Н. В. Боровкова Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор М. Ш. Хубутия Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………..... 5 Глава 1. АНТИТЕЛА К СИСТЕМЕ HLA И ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)……….………………........ 11 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…….... 29

2.1. Общая характеристика обследованных больных ………… 29

2.2. Клинико – лабораторные исследования ……………………... 33 2.2.1. Метод комплементзависимой цитотоксичности в выявлении антител к HLA ………………..……………………….. 34 2.2.2. Метод определения антител к HLA, с помощью качественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) …………………………………………………………….….. 37 2.2.3. Скрининг антител к HLA I, II классов и MICA на платформе Luminex (x-MAP-технология) …………………......... 38 2.2.4. Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора (ДСА) с помощью прямой перекрёстной пробы - реакции кросс-матч, выполненной на платформе Luminex у реципиентов до и после трансплантации почки……………………………….. 41 2.2.5. Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора с помощью реакции кросс-матч, используя метод комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) у реципиентов до трансплантации почки……………………………..……………. 43 2.2.6. Метод идентификации антител к HLA донора (виртуальный кросс-матч) на платформе Luminex

2.3. Статистическая обработка результатов……………………….. 44 Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ

МЕТОДОВ ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ АНТИТЕЛ К СИСТЕМЕ 46

HLA…………………………………....

3.1. Сравнительный анализ методов комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к HLA………………………………..

3.2. Сравнительный анализ методов иммуноферментного анализа (ИФА) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к 50 HLA………….……………………………………………………….

3.3. Сравнительный анализ методов КЗЦ и мультиплексного анализа на платформе Luminex для проведения перекрестной пробы (кросс-матч реакции)………………………………………. 54 Глава 4. ВЛИЯНИЕ АНТИТЕЛ К HLA НА ТЕЧЕНИЕ

ПЕРИОДА У

ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННОГО

РЕЦИПИЕНТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ПОЧКИ………………………………………………………………..

4.1. Выявляемость предсуществующих антител к HLA у реципиентов из «листа ожидания»……

4.2. Влияние антител к HLA на течение посттрансплантационного периода

4.3. Мониторинг антител к HLA в посттрансплантационном периоде………………………………………………………………..

Глава 5. ОБРАЗОВАНИЕ DE NOVO АНТИТЕЛ К СИСТЕМЕ

HLA И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В РЕАКЦИИ ОТТОРЖЕНИЯ ПРИ

ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ

5.1. Способы выявления антител к HLA в посттрансплантационном периоде………………….…………….

5.1.1 Скрининг антител к HLA в посттрансплантационном 73 периоде 5.1.2 Идентификация выявленных антител……………………… 74 5.1.3 Разработка метода для выявления донор-специфических антител к HLA с использованием лимфоцитов селезёнки донора……………………………………………………………….…

5.2. Влияние выявленных de novo образованных антител к HLA на развитие ранней дисфункции трансплантата в посттрансплантационном периоде ………………………………..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………

ВЫВОДЫ………………………………………………………..........

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………...

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…..………………………………….........

–  –  –

MHC - главный комплекс гистосовместимости HLA - человеческие лейкоцитарные антигены АТ - антитела MICА – антиген ( гликопротеин), относится не к HLA PRA - панель - реактивные антитела КЗЦ - комплементзависимая цитотоксичность ХПН - хроническая почечная недостаточность АТТП - аллотрансплантация трупной почки СКВ - системная красная волчанка ИФА - иммуноферментный анализ PNPP - паранитрофенилфосфата IgG - иммуноглобулин G Anti - Hu IgG – античеловеческий иммуноглобулин IgM - иммуноглобулин M ДСА - донор-специфические антитела MFI - средняя интенсивность флуоресценции

ВВЕДЕНИЕ





Трансплантация органов в настоящее время считается полноправным клиническим методом, который широко используется во многих лечебных учреждений во всем мире. Трансплантация органов включает в себя новейшие достижения хирургии, реаниматологии, анестезиологии, иммунологии, фармакологии и других медико-биологических наук.

За последние десятилетия развитие более эффективных иммуносупрессивных препаратов, а также достижения в области хирургической техники привело к очевидному улучшению в долгосрочном выживании трансплантируемого органа. С другой стороны, иммунная система человека до сих пор не изучена до конца. Главная цель-формирование иммунологической толератности реципиента к трансплантату, по-прежнему не достигнута, хотя в этом направлении многое сделано. Успехи клинической трансплантации - низкая смертность, высокая выживаемость трансплантатов и низкая частота эпизодов отторжения, затрудняют доказательство преимуществ новых подходов [Данович Г.М., 2009].

Данные литературы свидетельствуют, что важную роль в развитии хронической почечной дисфункции трансплантата и к его утрате играет гуморальный ответ на аллоантигены [Хаитов Р.М., 2013; Шумаков В.И., 2005;

Ярилин А.А., 1999; Akalin E., 2008]. После трансплантации в организме реципиента развивается иммунный ответ на многочисленные антигены трансплантата. Наиболее изученные антигены человека, с которым связан иммунный ответ на трансплантат — это антигены HLA (иногда их называют трансплантационными антигенами) [Dupont B., 1989]. Иммунный ответ на трансплантат обусловлен в первую очередь распознаванием антигенов HLA донора лимфоцитами реципиента. Это вызывает активацию T-хелперов, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию B-лимфоцитов и цитотоксических T-лимфоцитов.

Предсуществующие донор специфические антитела к антигенам трансплантата являются ведущей причиной развития сверхострого и острого гуморального отторжения. При пересадке органа донор-специфические антитела, взаимодействуя с антигенами сосудов трансплантата и формируя комплекс антиген-антитело, вызывают активацию комплемента, что приводит к развитию иммунного воспаления. В свою очередь, эти процессы индуцируют механизмы гемокоагуляции, что приводит к отложению фибрина и образованию тромбов в сосудах. Нарушение кровотока в пересаженном органе приводит к его гибели.

В хроническом отторжении трансплантата принимают участие как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции. При этом наблюдается развитие иммуновоспалительной реакции, индуцированной иммунными комплексами, развитие в органе дегенеративно-дистрофических процессов, замещение паренхимы органа фиброзной тканью, повреждение эндотелия сосудов и их облитерация. Все это приводит к потере органом функции и его гибели. Следует заметить, что процессы хронического отторжения трансплантата слабо поддаются иммуносупрессивной терапии.

Антитела к HLA обнаруживаются более чем у 30% населения, их выявление свидетельствует о предшествующей иммунизации HLA. Она возможна при многократном переливании цельной крови, во время беременности и после трансплантации. Ряд авторов отмечает, что донор неспецифические антитела к HLA являются одним из факторов риска сверхострого, острого и хронического отторжения трансплантата и учитываются, как плохой прогностический показатель [PI. Terasaki, 2006; М.

Моrrel, 2011; M. Crespo, 2011]. Однако встречаются лишь единичные работы, указывающие на влияние предсуществующих антител к HLA на функцию трансплантата и течение раннего посттрансплантационного периода.

Цель исследования: Оценить влияние антител к HLA на развитие реакции отторжения почечного трансплантата.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ методов выявления антител к системе HLA.

2. Проанализировать выявляемость антител к HLA и MICA у пациентов из «листа ожидания» на трансплантацию почки.

3. Оценить влияние предсуществующих антител к HLA на развитие реакции отторжения трансплантата

4. Оценить влияние антител к HLA, образованных de novo, на развитие реакции отторжения трансплантата

5. Разработать алгоритм обследования пациентов в посттрансплантационном периоде для диагностики криза отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

Научная новизна В работе проведен анализ выявляемости антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости у реципиентов из «листа ожидания» в зависимости от группы крови, показано, что наиболее сенсибилизированными к HLA явились женщины А (II) группы крови (52,4%). Наименьшее число пациентов в наличием антител к HLA зарегистрировано среди мужчин О (I) группы крови (14,6 % пациентов).

Выявлена корреляционная зависимость развития реакции отторжения трансплантата от степени сенсибилизации к HLA оцениваемой на основании средней интенсивности флуоресценции при определении антител на платформе Luminex (=0,56 при p=0,001).

Разработан способ получения диагностикума для определения у реципиента образование de novo донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде, основанный на использовании лимфоцитов селезенки донора, длительных сроков хранения.

Практическая значимость Разработан алгоритм обследования пациентов в посттрансплантационный период, чтобы выявить антитела к HLA образованные de novo, которые играют существенную роль в развитии дисфункции почечного аллотрансплантата, кризе отторжения и его утрате. На основании мониторинга антител к HLA в посттрансплантационный период, который включает в себя: скрининг антител к HLA, выявление донор-специфических антител, используя диагностикум, а также идентификация антител к антигенам донора по локусам, даёт возможность корректировать иммуносупрессию и обоснованно проводить процедуры плазмафереза и оценивать их эффективность.

Использование скрининга антител к HLA на основе использования x-MAPтехнологии позволяет выявить предсуществующие антитела к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органа. Этих пациентов следует относить к группе риска развития реакции отторжения и проводить подготовку к трансплантации, направленную на снижение степени сенсибилизации к HLA.

Положения, выносимые на защиту Для более точного определения степени сенсибилизации к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органа используется мультиплексный анализ на платформе Luminex по xMAP-технологии.

У реципиентов при повышенной степени сенсибилизации к HLA частота развития криза отторжения возрастает.

У пациентов в посттрансплантационном периоде образование de novo антител к HLA может спровоцировать развитие криза отторжения.

Апробация диссертации Апробация работы состоялась 28 февраля 2014 года на заседании Проблемно-плановой комиссии № 9 «Трансплантация клеток, тканей и органов»

в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗ г. Москвы.

Основные материалы исследования доложены и обсуждены на:

городском семинаре «Почечная недостаточность после трансплантации • органов в многопрофильном стационаре», 2010 г., конференции «Новые технологии в лабораторной диагностики», 2011 г.

–  –  –

Публикации по теме диссертации Опубликовано 8 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК.

Результаты, полученные при выполнении работы, легли в основу изобретения: «Диагностикум для определения донор-специфических антител к главному комплексу гистосовместимости и способ его получения» / патент РФ на изобретение № 2491552, опубликовано: 27.08.2013 бюлл. № 24 / авт.: М.Ш.

Хубутия, Н.В. Боровкова, Н.В. Доронина, В.А. Гуляев, М.Г. Минина, С.В.

Жерздев, И.Н. Пономарев, В.Б. Хватов Внедрение результатов работы в клинику Результаты исследования используются в отделении пересадки почки и поджелудочной железы в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗ г. Москвы.

Разработанный способ получения диагностикума для определения донорспецифических антител к главному комплексу гистосовместимости внедрен в клиническую практику и активно используется в лаборатории иммунотипирования клеток и тканей НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. В настоящее время в криобанке НИИ СП им. Н.В. Склифосовского хранится 93 образца клеток селезенки доноров органов, которые применяются для определения донор-специфических антител для диагностики реакции отторжения.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. Библиографический указатель включает 122 источника, из них 104 иностранные авторы.

Работа иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами.

Глава 1. АНТИТЕЛА К СИСТЕМЕ HLA И ИХ

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Современное состояние технологий аллотрансплантации органов не позволяет осуществлять пересадку органов от произвольного донора произвольному реципиенту. И мало вероятно, что это станет возможным когда-либо в будущем, в связи с тем, что так устроена иммунная система человека. При пересадки органов и тканей человека процессы отторжения и приживления трансплантата определяются степенью биологической совместимости донора и реципиента. Ключевую роль в инициации и развитии реакции отторжения играют генетически детерминированные антигены тканевой совместимости, расположенные на 6 хромосоме человека, образуя так называемый главный генетический комплекс тканевой совместимости. У человека этот комплекс генов получил название системы HLA (Human Leukocyte Antigen) [2, 3, 5, 11, 13, 18, 31, 109]. Основные функции главного комплекса гистосовместимости - это распознавание собственных, чужеродных и собственных изменённых клеток, запуск и реализация иммунного ответа против носителей генетической чужеродности (антигены клеток, вирусы и пр.). Обеспечение генетического разнообразия и выживаемости человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии [3, 5, 6, 11, 14, 15, 31, 34]. У всех клеток данного индивида система HLA тождественна, едина и индивидуально неповторима. Полное соответствие по этим антигенам донора и реципиента возможно только у однояйцевых близнецов. Во всех других случаях развивается иммунологический конфликт – реакция отторжения.

Интенсивность, продолжительность и исход его определяется:

1. степенью антигенных различий между донором и реципиентом;

2. уровнем иммунной реактивности реципиента;

3. характером трансплантата;

–  –  –

1.1. Предсуществующие антитела к HLA и методы их определения Выживаемость аллогеннного трансплантата зависит от многих причин: состояние и времени холодовой ишемии трансплантата, возраст донора, тяжести состояния реципиента и др. Среди них особое значение имеет подбор донора и реципиента по HLA. Так по данным многих авторов [6, 11, 31, 42, 50, 53, 71, 102, 105, 113, 114, 117] совместимость по HLAантигенам улучшает выживаемость трансплантата на 15% в раннем и на 10% в позднем посттрансплантационном периоде. На выживаемость аллогенного трансплантата также влияет наличие сенсибилизации у реципиентов до трансплантации. Доля таких пациентов в «листах ожидания» постоянно растёт [7, 9, 13, 22, 23, 36, 78, 106].

Предсуществующие антитела (анти-HLA-антитела) - это иммуноглобулины класса G, образование которых связано с предсуществующей сенсибилизацией несовместимыми HLA-антигенами в результате гемотрансфузий, прошлых трансплантаций, беременностей [1, 6, 11, 26, 29, 39, 52, 68]. Иммуноглобулины класса М встречаются весьма редко.

У некоторых реципиентов присутствуют разнообразные аутоантитела, как следствие их основного заболевания. Выявляемые антитела обычно описываются термином «предсуществующие антитела» с тем, чтобы подчеркнуть, что эти антитела присутствуют у реципиента ещё до пересадки.

По данным отечественных авторов более половины пациентов, ожидающих повторной пересадки почки, одновременно сенсибилизированы против антигенов HLA класса I и класса II [1, 7, 9, 13, 82, 117]. Выявление неспецифической цитотоксичности (т. е. цитотоксичности не к лимфоцитам донора, а к набору лимфоцитов от разных лиц) не является прямым противопоказанием к пересадке. Даже высокий уровень анти-HLA антител не является абсолютным противопоказанием к пересадке почки, хотя результаты таких трансплантаций хуже, чем у несенсибилизированных пациентов:

выживаемость трансплантатов ниже, частота отторжений выше. Кроме того, само по себе долгое ожидание трансплантации ухудшает ее результат [4, 6, 21, 24, 27, 41, 45, 70, 91].

Высокий процент положительных проб (более 25%) свидетельствует о массивной сенсибилизации потенциального реципиента. В данном случае следуют общеизвестному правилу: реципиенту с широким спектром предсуществующих антител необходимо подыскать такого донора, к лимфоцитам которого у данного реципиента не выявлялись бы специфические предсуществующие антитела[10, 11, 13, 31, 32, 35, 47, 62]. В научной литературе уделяется большое внимание пациентам, сенсибилизированным к HLA. У пациентов с повышенным титром антител к главному комплексу гистосовместимости наблюдается отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции [7, 44, 46, 48, 72, 76, 77, 84, 93, 94, 95, 97, 122]. Отмечается, что такие пациенты требуют более тщательного подбора донорских органов, а также применения активных методов десенсибилизации на этапах подготовки к операции и в раннем послеоперационном периоде [7, 43, 51, 57, 59, 67, 68, 86]. По данным авторов, у 30% реципиентов из « Листа ожидания»

определяются HLA-антитела [1, 9, 12, 31, 69, 72, 82, 117]. В последние годы в зарубежной литературе стали появляться сообщения о роли антител к MICA в развитии нарушений функции почечного аллотрансплантата. Гены MIC [7, 22, 25, 46, 48, 54, 67, 110, 111, 114] (MHC class I-related chain A and B) были открыты в 1994 году. Они располагаются в области HLA-B генов I класса на 6 хромосоме. На настоящий момент открыто 7 локусов. Наиболее исследованы MICA и MICB гены, кодирующие гликопротеиды. Известно более 60 аллельных вариантов MICA и 25 – MICB. Белки, кодируемые генами MICA и MICB обеспечивают костимуляцию естественных киллеров и Т-лимфоцитов.

Эндотелиальные клетки, экспрессирующие на своей поверхности MICA, могут стать мишенью для развития как гуморального, так и клеточного иммунного ответа при отторжении трансплантата. Экспрессия MICA и MICB обнаружена в биоптатах трансплантированной почки в случае острого или хронического отторжения [7, 40, 54, 68, 73]. Зарубежные авторы предполагают, что в связи с высокой полиморфностью MICA и MICB и их экспрессией на эндотелиальных клетках, они могут быть мишенью для антител, индуцирующих отторжение. Пациенты с HLA и MICA антителами требуют более тщательного подбора донорских органов. Также с целью улучшения результатов трансплантации почки целесообразно проведение десенсибилизирующей терапии с применением плазмафереза [7, 19, 65, 86].

В большинстве центров трансплантологии практикуется уменьшение титра антител к HLA при помощи плазмафереза и иммуносорбции. Эффективность указанных методик подтверждалась результатами ретроспективных и проспективных исследований [19, 29, 51, 60, 61, 65, 69, 70]. Есть мнения о целесообразности внутривенного применения иммуноглобулинов [29, 51, 61, 65, 69], способных подавлять выработку антител к HLA.

Загрузка...

Пациенты, сенсибилизированные до пересадки почки, имели достоверно более низкую выживаемость трансплантатов. Особенно ярко этот феномен проявляется у пациентов, которые перенесли повторную трансплантацию [6, 12, 20, 22, 43, 45, 50, 55, 67, 74, 90, 98]. Если у реципиента есть предсуществующие антитела к HLA, способные специфически связываться с антигенами донора, после восстановления кровотока в трансплантате очень быстро, в течение минут или несколько часов развивается сверхострое отторжение трансплантата, неизбежно ведущее к утрате пересаженного органа [10, 16, 17, 31, 38, 39, 56, 66, 73, 85, 98. 99].

Таким образом, селекция пары донор-реципиент, кроме подбора по HLA-антигенам, предусматривает определение степени специфической и неспецифической пресенсибилизации реципиента к антигенам системы HLA донора. Поскольку в каждом из указанных случаев доза антигена и способ иммунизации различны, вырабатывающиеся антитела отличаются по титру, биохимической аффинности к соответствующему антигену, в ряде случаев - по изотипу, а также по специфичности и продолжительности персистенции в организме [10, 12, 30, 49, 52, 55, 112, 119].

1.2. Методы проведения анализа на выявление предсуществующих антител к HLA у реципиентов из «листа ожидания»

Первостепенной задачей является идентификация сенсибилизированных реципиентов еще на этапе постановки в «лист ожидания», определение уровня анти-HLA антител и, главное, их донорспецифичности.

Определение антител к системе HLA в сыворотке больного, которому планируется трансплантация органа, проводят при постановке в «Лист ожидания». В дальнейшем исследование предсуществующих антител к антигенам системы HLA рекомендуется выполнять 1 раз в 3-6 месяцев.[11, 12, 13, 34, 35]. В настоящее время используются различные методы определения предсуществующих антител к HLA. В конце 20-го века для выявления антител к антигенам HLA исследование проводили с помощью лимфоцитотоксического теста. Для этого использовали 30—60 образцов лимфоцитов, типированных по наиболее распространенным антигенам HLA.

Результат выражали в виде коэффициента серопозитивности. Он представлял собой отношение числа образцов лимфоцитов, вызывающих положительную реакцию, к общему числу образцов в панели, выраженному в процентах.

Коэффициент серопозитивности отражал риск сверхострого отторжения трансплантата, взятого от случайного донора. Если коэффициент серопозитивности превышает 80%, трансплантация возможна только от донора, полностью совместимого с реципиентом по антигенам HLA [6, 11, 34, 35]. Метод имеет ряд существенных недостатков. Одним из основных недостатков является тот факт, что жизнеспособность выделенных лимфоцитов доноров должна составлять не менее 80%. Возможна ложноположительная реакция, за счёт содержания в крови пациентов антител класса IgM (антилимфоцитарные антитела), не оказывающие влияния на приживление трансплантата, в отличии от антител класса IgG, а также ложноотрицательная реакция из-за нормального популяционного состава лимфоцитов периферической крови. В суспензии лимфоцитов, полученной из венозной крови донора, содержится 60-80% Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса и 10-25% Влимфоцитов, несущих на себе антигены гистосовместимости II класса. Из-за недостатка содержания В-лимфоцитов результаты анализа антител к HLA по II классу могут быть не корректными. Зачастую это расценивалось как отрицательный или сомнительный результат лимфоцитотоксического теста [11, 35, 108].

В настоящее время для обнаружения анти-HLA антител используют твердофазные методики: иммуноферментный анализ (ELISA). С помощью метода ИФА уже можно дифференцировать антитела к HLA по классам, но затруднительно проводить мониторинг, т.к. анализ рассчитан только на выявление антител к HLA к I и II классам, т.е. является качественным методом [12, 39, 74].

Еще большую чувствительность в выявлении антител к HLA продемонстрировал проточноцитометрический метод (FlowPRA®).

FlowPRA® скрининг-тест представляет собой откалиброванные реагенты для быстрого определения методом проточной цитометрии уровня PRA в сыворотке человека. Реактивность каждой микросферы FlowPRA®подтверждена проточной цитометрией с человеческой сывороткой и специфическими HLA моноклональными антителами. Этот тест «слишком чувствительный» и даёт много ложноположительных результатов [32, 66, 83, 83].

В настоящее время широко используется мультиплексный анализ, основанный на использовании xMAP-технологии на платформе Luminex. В 1998 было объявлено о создании новой мультиплексной технологии определения анти-HLA антител, основанной на применении очищенных молекул HLA сорбированных на микросферах (HLA-coated microspheres).

Метод основан на использовании панели микросфер, имеющих различные спектральные характеристики и покрытых очищенными HLA антигенами.

Это позволяет с максимальной точностью выявить антитела к известным кросс-реактивным группам антигенов I и II классов системы HLA и к MICA антигенам [1, 7, 49, 50, 54, 100].

2. Предсуществующие донор-специфические антитела к HLA.

HLA-антигены вызывают в организме реципиента иммунную реакцию, приводящую к выработке специфических антител (HLAантитела), которые могут приводить к кризу отторжения трансплантата.

Естественные антитела к антигенам групп крови – изоагглютинины также могут инициировать отторжение трансплантата, если пара «донорреципиент» несовместима по AB0. Однако если выполнено условие совместимости по группе крови, то наиболее частой причиной развития сверхострого отторжения являются анти-HLA антитела.

HLA антитела могут быть направлены против антигенов HLA класса I (HLA-A,-B, C) или класса II (HLA-DR, DQ) [2, 3, 5, 12] Первый класс генов включает локусы, детерминирующие синтез трансплантационных антигенов, стимулирующих выработку антител, цитолитических лимфоцитов, Т-супрессоров. HLA-антигены I класса экспрессированы на всех ядросодержащих клетках организма, на Т-лимфоцитах, играют ключевую роль в распознавании «своего» [2, 3, 13, 14]. Высокие титры предсуществующих антител к HLA-A, B, C всегда осуществляют цитотоксический эффект по механизму комплементзависимого лизиса, т.е.

такие предсуществующие антитела агрессивны и разрушают трансплантат.

Во II класс входят гены иммунного ответа, регулирующие его силу. HLAантигены II–го класса представлены на макрофагах, активированных Тлимфоцитах, В-лимфоцитах, дендритных клетках и клетках Лангерганса [2, 3]. Активация Т-хелперов антигенами II класса стимулирует выработку ряда факторов, включая интерлейкин (ИЛ)-2, являющийся одним из главных факторов роста лимфоцитов, выполняющих основную роль в отторжении трансплантата.

При несовместимости HLA-антигенов запускаются процессы пролиферации и активации Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+ реципиента, что сопровождается сопутствующей активацией процессов выработки аллоантител В-лимфоцитами. Как следствие, развивается клеточная и гуморальная реакция отторжения трансплантата [2, 3, 14, 31, 98, 99, 101, 104, 107, 120, 122]. Гуморальные механизмы опосредованы антителами, которые могут присутствовать в сыворотке реципиента перед трансплантацией или развиваться после пересадки чужеродной ткани. Взаимодействие антител с антигеном на поверхности пересаженных клеток приводит к некрозу клеток, а накопление иммунных комплексов в кровеносных сосудах активирует комплемент, что приводит к развитию острого некротизирующего васкулита или хронического фиброза интимы с сужением сосудов [37, 89, 92]. Клеточные механизмы отторжения вызывают T-лимфоциты, которые становятся сенсибилизированными к пересаженным антигенам. Эти лимфоциты вызывают повреждение клеток путем прямой цитотоксичности и путем секреции лимфокинов.

Повреждение Т-клетками характеризуется некрозом паренхиматозных клеток, лимфоцитарной инфильтрацией и фиброзом [2, 6, 8, 37, 89, 92, 122] Выявление в сыворотке реципиента антител к HLA донора свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата [10, 12, 38, 39, 44, 52, 118, 120].

Сверхострая реакция отторжения трансплантата (HAR-реакция) вызывается ранее образовавшимися анти-HLA или анти-АВ (группа крови) – антителами.

В настоящее время встречается редко, в связи с определением АВО - и перекрёстной пробы между донором и реципиентом перед выполнением трансплантации органа [11, 12, 105, 107]. Острая клеточная реакция отторжения трансплантата (ACR-реакция) встречается чаще, чем HARреакция, в 10-40% случаев. Патологические проявления возникают не ранее, чем на 5-й день с момента трансплантации. Максимальная вероятность возникновения в течение первых 3-х месяцев после трансплантации донорского органа, в некоторых случаях позднее данного срока [12]. Острая гуморальная реакция отторжения трансплантата (AHR-реакция) встречается реже, чем ACR-реакция, в 5-20% случаев [12]. Максимальная вероятность возникновения в течение первых 3-х месяцев после трансплантации донорского органа. Характерны конкретные гистологические признаки и/или C4d-положительный эффект при иммунном окрашивании, и/или наличие антител к HLA [12, 28, 33, 115]. Прогноз менее благоприятный, чем при ACRреакции, поскольку хуже поддаётся терапии. Хроническая реакция отторжения трансплантата (CAR-реакция) - это иммунный процесс, характеризующийся медленным течением. Диагностируется через несколько недель, месяцев и лет после операции, может несколько раз рецидивировать после подавления ее иммуносупрессивной терапией [22, 23, 29, 30, 64, 76, 77, 78, 79, 101, 103].

2.1. Методы выявления донор-специфических антител к HLA

Наиболее важным диагностическим тестом в подборе пары донорреципиент является реакция cross-match, позволяющая определить наличие у реципиентов антител к системы HLA донора. Более 40 лет «золотым стандартом» определения донор-специфических антител к HLA был серологический метод исследования, в основе которого лежит комплемент зависимый лимфоцитотоксический тест [11, 35, 80, 108]. Выявление у реципиента антител к HLA донора (cross-match реакция) является обязательной процедурой перед трансплантацией органа [1, 11, 12, 13, 80]. С момента введения в клиническую практику микролимфоцитотоксического теста методы определения антител к HLA (донор-специфических) постоянно совершенствовались. Дополненная анти-человеческим глобулином комплемент-зависимая цитотоксичность (anti-human globulin-augmented complement-dependent cytotoxicity, AHG-CDC) – более чувствительный метод постановки перекрестной пробы, в настоящее время используется во многих центрах при проведении предоперационного кросс-матча [30, 12, 80, 82].

Случаи антигенной несовместимости выявляются для определения перекрестной несовместимости (cross-match) не сепарированных лимфоцитов или Т-обогащенных лимфоцитов потенциального донора. Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности исключительно HLA-антигены I-го класса, а В-лимфоциты помимо HLA-I класса, также HLA-II-класса, поэтому В-лимфоцитарное перекрестное антигенное несоответствие считается более чувствительным, чем Т-лимфоцитарное. В селезенке содержится гораздо большее количество В-лимфоцитов, чем в периферической крови. Как следствие, определение перекрестной антигенной совместимости с использованием не сепарированных лимфоцитов из селезенки обладает большей чувствительностью, чем аналогичное исследование с использованием не сепарированных лимфоцитов из периферической крови [12]. Из-за этого могут выявляться ложноотрицательные реакции, обусловленные нормальным популяционным составом лимфоцитов периферической крови. В суспензии лимфоцитов, полученной из венозной крови донора содержится 60-80% Т-лимфоцитов, несущих на себе антигены главного комплекса гистосовместимости I класса и только 10-25% Влимфоцитов, несущих на себе антигены гистосовместимости II класса [3, 34, 35] Положительные результаты теста на Т-лимфоцитарную перекрестную антигенную совместимость обычно являются противопоказанием к выполнению трансплантации.

Положительные результаты теста на Влимфоцитарную перекрестную антигенную совместимость могут быть обусловлены различными причинами, в частности наличием HLA-антител I и II класса или алло-антител, иммунных комплексов, проведением терапии анти-В- лимфоцитарными препаратами (ритуксимаб, алемтузумаб), а также наличием не-HLA-аллоантиген (на сегодняшний день недостаточно изучено) [58, 60, 63, 80, 121]. При положительных результатах В-лимфоцитарной перекрестной антигенной несовместимости решение о выполнении трансплантации принимается в индивидуальном порядке. Обязательно учитывается уровень предсуществующих антител к HLA реципиента.

Следует принимать во внимание возможность получения ложноположительных результатов, клинически обусловленных часто проявляющихся выработкой аутоантител IgM. Минимизировать вероятность получения ложноположительных результатов перекрестной антигенной совместимости можно при помощи инактивации антител IgM дитиотреитолом (DTT), однако стоит помнить о том, что IgM-анти-HLAаллоантитела также обладают DTT-чувствительностью. Анти-HLA-антитела изотипа IgM встречаются редко, вследствие чего случаев перекрестной антигенной совместимости по типу IgM-анти-HLA почти не наблюдается [1, 12] В настоящее время активно используются новые методы выявления антител к HLA. Проточная цитометрия с целью определения перекрестной антигенной совместимости (flow cytometry crossmatch) может проводиться пресенсибизированным рецепиентам при высоком риске развития антительнопоследовательной реакции отторжения трансплантата. Однако при использовании данного высокочувствительного метода многим пациентам выставляются необоснованные противопоказания к трансплантации. Многие считали, что этот тест «слишком чувствительный» для постановки кроссматча у несенсибилизированных пациентов, и при рутинном применении может исключать подходящие пары донор-реципиент [32, 83]. В последнее время для проведения кросс-матч реакции между донором и реципиентом, как альтернатива серологическому методу, используют мультиплексный анализ на основе x-MAP-технологии на платформе Luminex (Donor Specific Antibody) (ДСА). Эта технология позволяет проводить «кросс-матч» между сывороткой реципиента и HLA-антигенами донора, сорбированными на микросферах. Технология основана на использовании панели микросфер, имеющих различные спектральные характеристики. Это позволяет с максимальной точностью выявить антитела к известным кросс-реактивным группам антигенов I и II классов системы HLA, в отличие от лимфоцитотоксического теста [1, 10, 100]. Также данный метод позволяет определять процент панель-реактивных антител (ПРА) и специфичность анти-HLA антител. Кроме высокой чувствительности этот метод обладает еще одним важным преимуществом: отсутствует необходимость в клетках донора [10, 100].

Согласно рекомендациям национальных и/или международных трансплантологических организаций потенциальные реципиенты, у которых выявлены антитела к HLA, должны проходить скрининг антител к HLA каждые 3 месяца, а также после каждого иммунокомпрометирующего события (переливание крови, трансплантация, беременность и удаление трансплантата) [12]. Результаты HLA-антительного исследования сыворотки реципиента отображаются в процентном соотношении на панели реактивов (%PRA) в зависимости от HLA-специфичности к каждому из антительных диагностикумов. Кроме того, необходимо использовать методики отделения антител к HLA-антигенам II класса от антител к HLA-антигенам I класса.

Таким образом, поскольку традиционное микролимфоцитотоксическое исследование характеризуется недостаточной чувствительностью, в некоторых случаях могут не обнаруживаться клинически значимые HLAантитела I и II класса [1, 10, 11, 49]. Некомплементофиксируемые антитела и вовсе не выявляются. В связи с назревшей необходимостью были разработаны более специфические и более чувствительные твердофазные методики, проточная цитометрия х-MAP-технологии на платформе Luminex.

Наличие не HLA-аллоантител также может влиять на выживаемость трансплантата [80]. Твердофазные анализы являются строго HLAспецифическими и не способны выявлять не HLA-антитела. В настоящее время не совсем ясно, экспрессируются ли клинически значимые не HLAантитела на поверхности В-лимфоцитов и не могут ли они распознаваться лимфоцитоксическими диагностическими методиками. Ни одна из имеющихся на сегодняшний день антительных скрининговых диагностических методик не позволяет надежно идентифицировать аллоантитела, что предопределяет необходимость комбинированного или попеременного использования лимфоцитоксических и твердофазных, цитометрических и х-MAP технологий антительных скрининговых методов [12].

3. Скрининг антител к HLA в посттрансплантационный период В настоящее время большой интерес представляет определение донор специфических антител (ДСА) в посттрансплантационном периоде, так как образованные de novo ДСА являются решающим фактором развития отторжения трансплантата [10, 88]. Ряд исследований показал четкую связь между развитием острого отторжения и наличием de novo донорспецифических анти-HLA антител [10, 88, 119, 114]. Если ДСА присутствуют, они должны повреждать трансплантат. Это ожидание основано на известном разрушительном действие донор-специфических антител к HLA при постановке реакции кросс-матч, между донором и реципиентом, которая обязательно проводится перед каждой трансплантацией органа [10, 11, 35]. В отличие от этой ситуации, вновь образующиеся антитела к HLA против трансплантата не вызывают немедленного отказа, как предварительно обнаруженные антитела [10, 22, 36, 39].Тем не менее, эти посттрансплантационные антитела к HLA могут, в конечном итоге, стать причиной хронического отторжения трансплантата [57, 64, 75].

Проблема состоит в том, что донор-специфические антитела к HLA могут не детектироваться в ранний посттрансплантационный период. Результаты последних исследований подтверждают эту идею адсорбированных ДСА убивающих трансплантат. ДСА могут быть обнаружены в элюатах отторгнутых трансплантатов [28, 33, 115], в игле после биопсии образцов [37, 89, 92] и в сыворотке после нефрэктомии [10, 12, 81]. Только в 11% случаев ДСА могут быть обнаружены до нефроктомии по сравнению с 97% после удаления отторгнутого трансплантата [37, 92]. В ходе пслеоперационной гуморальной реакции отторжения трансплантата образуются антитела к эндотелиальным антигенам донора. В 20-25% случаев указанные антитела могут обнаруживаься специфическими методами в плазме крови [10, 12, 49, 73, 100]. Зачастую острая гуморальная реакция отторжения трансплантата не диагносцируется. При интерпретации результатов биопсии определялся отёк тканей, а также кровоизлияния с очагами некроза. Для диагностики в соответствии с современными критериями Banff необходимым условием является определение фракции С4d комплимента в биоптате трансплантата [72, 93, 94]. Фракция C4d может быть идентифицирована в перитубулярных капиллярах. Эти антитела вызывают раннее повреждение трансплантата [28, 33, 115]. Было показано, что выживаемость трансплантатов с наличием C4d компонента комплемента в перитубулярных капиллярах достоверно ниже, чем без него. Есть данные о связи между присутствием анти-HLA антител в сыворотке реципиента почки и C4d в трансплантате [10, 12, 115].

При наличие у пациентов ACR-реакции, как можно быстрее определяют наличие анти-HLA-антител IgG к трансплантату [10, 12, 112, 120]. Выявление антител к HLA требует проведения дополнительных анализов идентификации антител по локусам. Важно использовать все методики для выявления донор-специфических антител к HLA и их идентификацию, чтобы своевременно провести коррекцию иммуносупрессивной терапии, направленной на предотвращение развития криза отторжения трансплантата и его утрату [96, 116].

У многих пациентов неблагоприятный исход трансплантации обусловлен хронической дисфункцией аллотрансплантата (CAR-реакция) [12, 101, 111]. Например, при гистологическом исследовании трансплантата почки идентифицируются признаки хронического процесса - интерстициальный фиброз (IF), тубулярная атрофия (ТА). После выполненной трансплантации почки регулярно контролируют уровень концентрации креатинина в плазме крови, клиренс креатинина, показатели артериального давления, а также протеинурию [12, 23, 24, 25, 29]. При наличии выраженных изменений указанных параметров, показана госпитализация для выполнения биопсии почечного трансплантата, а также для дальнейшего диагностического поиска, чтобы исключить инфекционную патологию и анти-HLA-антител [12, 22, 29, 36].

Благодаря масштабным мероприятиям, в частности созданию программы совместимости донор-реципиент Eurotransplant, в настоящее время удалось достичь больших успехов в вопросах трансплантации органов высокосенсибилизированным пациентам (PRA85%) [12, 47, 68, 74].

Алгоритм действия в отношении данной категории пациентов заключается в следующем: вначале у потенциальных реципиентов проводится тщательный анализ HLA-антительной специфичности для исключения неприемлимых HLA-антигенов и выявления допустимых HLA-антигенов, при которых ожидается получение отрицательных проб перекрестной антигенной совместимости. Затем соответствующая категория пациентов включается в программу Eurotransplant, и именно им отдается предпочтение при распределении донорских органов (в случае отрицательных результатов теста перекрестной антигенной совместимости) [12].

Профилактика сверхострой, острой реакции отторжения трансплантата должна включать в себя заблаговременное определение АВО-антигенной совместимости, а также перекрёстной антигенной совместимости (кросс – матч реакция). Всем пациентам находящимся в «листе ожидания» на трансплантацию органа, показан скриниг антител к HLA в плазме крови [1, 11, 12, 13]. Пациенты с высокой сенсибилизацией (более 50% PRA) распределяются на категории приоритетности в соответствии определённым количеством баллов антигенной несовместимости [12, 41, 45, 47]. Согласно рекомендациям национальных и международных программ по распределению донорских органов идентификация специфичности антител к HLA, а также определение перекрёстной антигенной совместимости у реципиентов с высокой сенсибилизацией позволяет также разделить антигены донора на две группы: допустимые и недопустимые (в зависимости от потенциальной возможности вызвать реакцию отторжения трансплантата) [12, 47, 113]. Эта информация поступает в специализированые базы данных (трансплантологические реестры), что позволяет исключить возможность нецелесообразной транспортировки донорских органов реципиентам с высоким титром антител к HLA [12, 113].

Таким образом, на современном этапе развития трансплантологии иммунологические проблемы являются основными в посттрансплантационном периоде [1, 5, 6, 9, 12, 13, 22, 119, 122]. На современном этапе технология подбора пары донор-реципиент необходимо:

• молекулярное HLA типирование с разрешением от низкого к высокому,

• скриниг антител к HLA с использованием методов на основе x-MAPтехнологии или ELISA

• определение специфичности антител к HLA для проведения виртуального кросс-матча

• кросс-матч перед трансплантацией методом более чувствительным, чем лимфоцитотоксический Однако остается не решенным ряд вопросов, которые требуют всестороннего изучения:

• потребность в стандартизации количества антител к HLA

• определение относительных рисков низкого уровня предсуществующих донор - специфических антител при трансплантации

• необходимость дальнейшего исследования значимости тех или иных специфичностй антител к HLA в развитии реакции отторжения трансплантата [99, 100, 112, 120] Еще одним из ключевых моментов является мониторинг антител к HLA в посттрансплантационном периоде, чтобы предотвратить криз отторжения и утрату трансплантатах [6, 10, 12, 55, 62]. Мониторинг содержания в сыворотке анти-HLA антител является одним из подходов ранней диагностики и контроля эффективности терапии отторжения [7, 12, 73,85, 89, 100, 122].

Таким образом, в нашей работе была поставлена цель: оценить влияние антител к HLA в прогнозе отторжения почечного трансплантата на основе исследования влияния предсуществующих антител к HLA на течение посттрансплантационного периода. Их влияние на функцию трансплантата, криз отторжения и выживаемость в посттрансплантационный период.

Провести сравнительный анализ методов выявления антител к системе HLA и оценить их эффективность, а также проанализировать выявляемость антител к HLA и MICA у пациентов «листа ожидания» на трансплантацию органов.

Одной из задач была оценка влияния антител к HLA, образованных de novo, на развитие реакции отторжения трансплантата и разработка алгоритма обследования пациентов в посттрансплантационном периоде для диагностики криза отторжения и оценки эффективности иммуносупрессивной терапии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Характеристика пациентов из «листа ожидания»

У 440 реципиента обследованы сыворотки крови на наличие предсуществующих антител к I и II классам HLA. Среди них было 245 мужчин и 195 женщин в возрасте от 28 до 63 лет. Исследование проводили на момент включения в «лист ожидания» на трансплантацию почки в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского в период с 2010 по 2013 годы. Причиной включения в «лист ожидания» было наличие у пациента хронической почечной недостаточности (ХПН). У 415 реципиентов ХПН развилась вследствие перенесенных хронического гломерулонефрита и пиелонефрита, или в результате поликистоза почек. У 25 пациентов ХПН развивалась на фоне сахарного диабета I типа.

Характеристика пациентов после трансплантации почки 68 пациентам в период с 2011 по 2013 годы в НИИ скорой помощи им.

Н.В. Склифосовского выполнена трансплантация почки. Из них 30 мужчин и 38 женщин в возрасте от 25 до 58 лет. Этих пациентов наблюдали в течение первых трёх месяцев посттрансплантационного периода. С момента аллотрансплантации трупной почки (АТТП) применялись следующие схемы иммуносупрессивной терапии:

1. В 70% случаях при АТТП реципиентов с отсутствием предсуществующих антител к HLA, назначали комбинированную 4-х компонентную иммуносупрессию:

• Циклоспорин (неорал, сандиммун) назначали в дозе 10-15 мг/кг, разделённой на два приёма в течение 1-2 недели. После чего дозу постепенно снижали, под контролем концентрации циклоспорина в крови, до достижения поддерживающей дозы 2-6 мг/кг сутки.

• Микофеноловая кислота (майфортик, селлсепт) в дозе 720 мг 2 раза в сутки.

• Симулект в дозе 40 мг (два введения по 20 мг). Первое введение проводили за 2 часа до трансплантации. Второе введение Симулекта проводили через 4 дня после операции.

• Преднизолон в дозе 100 мг в сутки.

2. В 30% случаев при АТТП у реципиентов со средней и высокой степенью сенсибилизации к HLA, при повторных трансплантациях, у пациентов с анамнезом системной красной волчанки (СКВ), геморрагическим васкулитом, у молодых женщин с А (II) группой крови, а также при АТТП и поджелудочной железы, применяли комбинированную 4-х компонентную иммуносупрессию и поликлональные антитела:

• Атгам (АТГ, иммуноглобулин антимоцитарный) в дозе 8-12 мг/кг в сутки.

• Такролимус (програф) в дозе 0,3 мг/кг в сутки.

• Микофеноловая кислота (майфортик, селлсепт)

• Циклоспорин (неорал, сандиммун)

• Преднизолон Особенности течения посттрансплантационного периода 68 обследованных реципиентов представлены в таблице 2. У 29 пациентов из 68 отмечалась отсроченная функция почечного трансплантата, которая могла быть обусловленная развитием, как острого канальцевого некроза, так и острым кризом отторжения. Этим реципиентам проводили программный гемодиализ от 3 до 7 процедур, в зависимости от состояния трансплантированного органа.

Развитие подтвержденного острого криза отторжения отмечали в 24 случаях, что у 8 реципиентов привело к потере почечного трансплантата (таблица 2).

Таблица 2 Особенности течения послеоперационного периода у обследуемых пациентов

–  –  –

Принципы формирования групп пациентов:

В зависимости от поставленных задач исследований пациентов распределяли на группы по следующим принципам:

I принцип С целью проведения сравнительного анализа методов выявления предсуществующих антител к системе HLA были сформированы группы пациентов, в зависимости от выбранного метода:

20 пациентов, у которых выявление антител к HLA проводили параллельно с помощью методов комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) и мультиплексного анализа.

20 пациентов, которым выявление антител к HLA проводили параллельно с помощью ИФА и мультиплексного анализа.

II принцип С целью сравнительного анализа методов проведения реакции кросс-матч обследовано 18 пациентов параллельно с помощью КЗТ и мультиплексным анализом.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
Похожие работы:

«Пеннер Регина Владимировна ФЕНОМЕН СОВРЕМЕННОГО СЕРИАЛА В КОНТЕКСТЕ ДИСКУРСОВ О СВОБОДЕ ЧЕЛОВЕКА 09.00.13 – философская антропология, философия культуры Диссертация на соискание ученой степени кандидата философских наук Научный руководитель: доктор философских наук профессор Апухтина Нина Георгиевна Челябинск – 2015...»

«НЕКРАСОВ Дмитрий Юрьевич ХУДОЖЕСТВЕННАЯ СПЕЦИФИКА ЦИФРОВОГО ИСКУССТВА (на примере творчества художника кино) Специальность 17.00.03 — Кино-, телеи другие экранные искусства Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: доктор философских наук, профессор Маньковская Надежда Борисовна Москва 201 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Понятийный аппарат изобразительного...»

«Тельманова Анастасия Сергеевна СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЕ РАЗВИТИЕ ЛИЧНОСТИ ПОДРОСТКА В ИНТЕГРАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ШКОЛЬНОГО МУЗЕЯ 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор...»

«ДАНИЛОВА АНАСТАСИЯ АНАТОЛЬЕВНА ФОРМИРОВАНИЕ КОРПОРАТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ В СОЦИОКУЛЬТУРНОМ ПРОСТРАНСТВЕ ВУЗА СРЕДСТВАМИ ДЕЛОВОЙ ИГРЫ Специальность: 13.00.05 – теория, методика и организация социальнокультурной деятельности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный...»

«Улановская Наталья Сергеевна РАЗРАБОТКА СТРАТЕГИИ БИБЛИОТЕЧНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В КОНЦЕ 1920-х НАЧАЛЕ 1930-х гг. (ВКЛАД В.Н. ДЕНИСЬЕВА) 05.25.03 – Библиотековедение, библиографоведение и книговедение Диссертация на соискание учёной степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – кандидат педагогических наук,...»

«Борисов Василий Борисович ПУТИ РАЗВИТИЯ И ВНЕДРЕНИЯ СИСТЕМЫ КОРПОРАТИВНОЙ КАТАЛОГИЗАЦИИ БИБЛИОТЕК (НА ПРИМЕРЕ РЕСПУБЛИКИ САХА (ЯКУТИЯ) 05.25.03 – Библиотековедение, библиографоведение и книговедение Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель: О.В. Шлыкова, доктор...»

«РУПЫШЕВА ЛЮДМИЛА ЭРДЭМОВНА ФЛОРОНИМИЧЕСКАЯ ЛЕКСИКА БУРЯТСКОГО ЯЗЫКА Специальность 10.02.02 – языки народов Российской Федерации (бурятский язык) Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель – кандидат филологических наук, доцент Б. Д. Цыренов Улан-Удэ ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«УДК 778.5.04.072.0 ББК 85.374 ММАРУСЕНКОВ ВЯЧЕСЛАВ ВАЛЕНТИНОВИЧ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ СЮЖЕТНО-ОБРАЗНОГО РЯДА ЛИТЕРАТУРНОГО ПРОИЗВЕДЕНИЯ СРЕДСТВАМИ КИНОИСКУССТВА Специальность 17.00.0 «Кино-, телеи другие экранные искусства» Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель доктор искусствоведения, профессор Л.А. Зайцева Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ Введение Стр. 3 Глава 1...»

«МУХАМАДЕЕВА АЙГУЛЬ АЛЬБЕРТОВНА ИСТОРИЧЕСКИЙ ОПЫТ ФОРМИРОВАНИЯ ДУХОВНОГО ОБЛИКА РОССИЙСКОЙ МОЛОДЕЖИ В КОНТЕКСТЕ КУЛЬТУРЫ МИРА (КОНЕЦ ХХ – НАЧАЛО XXI вв.) Специальность 24.00.01 – теория и история культуры Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель: Доктор исторических...»

«Мацукевич Ольга Юрьевна ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЙ РЕСОЦИАЛИЗАЦИИ ЛИЧНОСТИ ДЕЗАДАПТАНТОВ Диссертация на соискание ученой степени доктора педагогических наук по специальности 13.00.05 теория, методика и организация социально-культурной деятельности. Научный консультант: доктор педагогических наук, профессор Гладилина И.П. Москва ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. МЕТОДОЛОГИЯ СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЙ...»

«Олонцева Татьяна Андреевна ФОРМИРОВАНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНО-ИСПОЛНИТЕЛЬСКИХ УМЕНИЙ СТУДЕНТОВ-ХОРМЕЙСТЕРОВ В ПРОЦЕССЕ ИЗУЧЕНИЯ РУССКОЙ ПРАВОСЛАВНОЙ МУЗЫКИ 13.00.08 – теория и методика профессионального образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель кандидат педагогических наук, профессор Н.Ф. Спинжар Москва 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 Глава I....»

«Володченков Роман Геннадиевич ФОРМИРОВАНИЕ ХУДОЖЕСТВЕННЫХ ПРИНЦИПОВ В СОВЕТСКОМ БАЛЕТЕ 1960-80-х ГОДОВ [НА ПРИМЕРЕ ТВОРЧЕСТВА ХОРЕОГРАФА И.А. ЧЕРНЫШЁВА] Специальность – искусствоведение 17.00.01 – Театральное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: кандидат философских наук,...»

«НОВОДВОРСКАЯ Наталия Борисовна СОЦИАЛЬНО-ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ МЕНЕДЖЕРОВ СОЦИАЛЬНО ОРИЕНТИРОВАННЫХ НЕКОММЕРЧЕСКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель:...»

«Андрейко Евгения Олеговна М.Д. Михайлов: творческая деятельность, исполнительский стиль Специальность 17.00.02 Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: кандидат педагогических наук, профессор Агин М.С. Москва –   ОГЛАВЛЕНИЕ Том I ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. СТАНОВЛЕНИЕ И РАЗВИТИЕ М.Д. МИХАЙЛОВА КАК ПЕВЦА. 1 1.1. Детство и первые годы творчества 1.2. Творческие искания в...»

«Людмила Николаевна Шаймухаметова Мигрирующая интонационная формула и семантический контекст музыкальной темы. Диссертация на соискание учёной степени кандидата искусствоведения по специальности 17.00.02 «Музыкальное искусство»Научный руководитель: доктор искусствоведения, профессор М.Г. Арановский. Москва – 1994 г. Оглавление Введение Глава I. К изучению мигрирующей интонационной формулы как структурно-семантического стереотипа Глава II. Мигрирующие формулы с относительно...»

«Васильковская Маргарита Ивановна СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЕ ТВОРЧЕСТВО УЧАСТНИКОВ МОЛОДЕЖНЫХ ОБЪЕДИНЕНИЙ В ФОРМИРОВАНИИ ИНСТИТУТА ВОЛОНТЕРСТВА 13.00.05 – теория, методика и организация социальнокультурной деятельности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель: ДОКТОР ПЕДАГОГИЧЕСКИХ НАУК, ДОЦЕНТ ПОНОМАРЕВ В.Д. КЕМЕРОВО 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..3-17 ГЛАВА 1 ПЕДАГОГИЧЕСКИЕ...»

«ДАВЛЕТЧИН Ильдар Лукманович РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ ДОСУГА ПОДРОСТКОВ В СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ДЕТСКОГО ОЗДОРОВИТЕЛЬНОГО ЛАГЕРЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Специальность 13.00.05 – «Теория, методика и организация социально-культурной деятельности» Научный руководитель:...»

«СЕМЕНОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ЭСТЕТИКА АКВАРЕЛЬНОЙ ЖИВОПИСИ В ПОДГОТОВКЕ БУДУЩИХ ПЕДАГОГОВ-ХУДОЖНИКОВ Специальность 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (изобразительное искусство) Диссертация на соискание ученой степени доктора педагогических наук Научный консультант: доктор...»

«Пономарев Иван Николаевич ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАГОТОВКИ КОСТНОГО МОЗГА ОТ ТРУПНЫХ ДОНОРОВ С БЬЮЩИМСЯ И НЕБЬЮЩИМСЯ СЕРДЦЕМ Специальность: 14.01.24 – трансплантология и искусственные органы 14.01.17 – хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители:...»

«Андрейко Евгения Олеговна М.Д. Михайлов: творческая деятельность, исполнительский стиль Специальность 17.00.02 Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Том II ПРИЛОЖЕНИЯ Научный руководитель: кандидат педагогических наук, профессор Агин М.С. Москва – 201 ОГЛАВЛЕНИЕ Том II ПРИЛОЖЕНИЕ А. МАТЕРИАЛЫ О ТВОРЧЕСТВЕ М.Д. МИХАЙЛОВА. 5 А.1. Студийные записи концертов и выступлений М.Д. Михайлова...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.