WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАГОТОВКИ КОСТНОГО МОЗГА ОТ ТРУПНЫХ ДОНОРОВ С БЬЮЩИМСЯ И НЕБЬЮЩИМСЯ СЕРДЦЕМ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы

«Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Департамента здравоохранения города Москвы»

На правах рукописи

Пономарев Иван Николаевич

ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАГОТОВКИ КОСТНОГО МОЗГА

ОТ ТРУПНЫХ ДОНОРОВ С БЬЮЩИМСЯ И НЕБЬЮЩИМСЯ

СЕРДЦЕМ



Специальность:

14.01.24 – трансплантология и искусственные органы 14.01.17 – хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Член-корр. РАН, проф., д.м.н. М. Ш. Хубутия д.м.н. Н. В. Боровкова Москва – 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.………………………………………………………………………..

Глава 1. Костный мозг трупных доноров как источник получения стволовых клеток для клинического применения ……………………………….

.

1.1 Стволовые клетки и источники их получения в клинической практике

1.2 Сбор костного мозга от трупных доноров ……………………………… 1.2.1 Проведение миелоаспирации при эксплантации органов …...…… 1.2.2 Оценка эффективности сбора костного мозга.………………….…

1.3 Перспективы применения клеток костного мозга трупных доноров в клинической практике ………………………………………………...

1.3.1 Качество стволовых клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем ……………………………..

1.3.2 Использование клеток костного мозга трупных доноров для изготовления комбинированных трансплантатов ……………… Глава 2. Материалы и методы…………………………………………………...

2.1 Характеристика и стратификация трупных доноров …………………...

2.2 Сбор костного мозга ……………………………..………………….….… 2.2.1 Техника пункции крыльев подвздошных костей ………………… 2.2.2 Техника миелоаспирации……………………………………...……

2.3 Оценка эффективности миелоаспирации..……………………………...

2.4 Изучение клеток костного мозга в культуре …………………………....

2.4.1. Получение культуры прилипающих к пластику клеток.…….......

2.4.2 Критерии и методы характеристики клеток костного мозга в культуре ……………………………………………………..……

2.5 Статистическая обработка данных……………………………………….

Глава 3. Новый хирургический метод сбора костного мозга от трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем

3.1 Увеличения эффективности заготовки костного мозга от трупных доноров с небьющимся сердцем ………

3.1.1 Использование при аспирации повышенного разряжения……… 45 3.1.2 Комбинирование простой аспирации и аспирацией-промыванием 51

3.2 Новые хирургические способы установки троакаров в крыло подвздошной кости для сбора костного мозга при укладке трупного донора в положение «на спине» …………………………...

–  –  –

автоматизированного сбора костного мозга..……………………… 3.3.1. Автоматизированный сбор костного мозга комбинированием простой аспирации и аспирации-промывания с использованием новой одноразовой многоканальной закрытой системы ………..

Глава 4. Перспективы использования костного мозга трупных доноров в клинической практике………………………………………………

4.1 Взаимодействие ядросодержащих клеток костного мозга трупных доноров в условиях, приближенных к in vivo ………….……………...

4.2 Сравнительная характеристика культуральных свойств прилипающих к пластику клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем ………………………………….……………...

4.2.1. Совместимость ММСК костного мозга трупных доноров

–  –  –

Заключение……………………………………………………………...………… Выводы……………………………………………………………….…………… Практические рекомендации…………………………………………….……….

Список сокращений и условных обозначений..………………………...……… 110 Список используемой литературы……………………………………….……… 111

ВВЕДЕНИЕ

Состояние вопроса В клинической практике для восстановления утраченной функции органов все чаще прибегают к методам «клеточной» терапии, подразумевающим достижение результата за счёт способностей стволовых клеток к самообновлению и дифференцировке в разных направлениях [Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998]. В зависимости от выраженности патологического процесса методы лечения включают стимулирование резидентных прогенеторных клеток или их ауто-, аллотрансплантацию.





Традиционно трансплантацию прогенеторных клеток применяют в лечении пациентов с онкогематологическими заболеваниями. Для них разработаны и постоянно совершенствуются протоколы подготовки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), дозы и схемы их введения [Felfly H., 2014]. В случае необходимости стимулирования регенерации соединительных тканей, как правило, используют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [Franchini M., 2003]. Однако, несмотря на интерес хирургов и травматологов-ортопедов к методам «клеточной» терапии, существует дефицит соответствующих унифицированных протоколов. Одной из причин этого является нехватка биологического материала, как для проведения научных исследований, так и для клинического применения.

По данным отечественной и зарубежной литературы источником получения большого количества прогенеторных клеток разных типов может быть костный мозг (КМ) трупных доноров (ТД) – людей, находящихся в состоянии биологической смерти или смерти мозга [Machaliski B 2006; Michalova J, 2011].

В настоящее время благодаря разностороннему сравнению разных методов получения КМ наибольшее распространение получил те из них, которые основаны на принципе аспирации. По технологии, утвержденной приказом Министра Здравоохранения СССР №482, аспирацию КМ у ТД с биологической смертью рекомендовано проводить шприцем через многочисленные проколы крыла подвздошной кости троакаром. Однако эффективность сбора часто ниже, чем у здоровых доноров, что связанно с отсутствием деятельности сердца и изменениями реологических, динамических свойств крови, наступающих вследствие этого.

У ТД со смертью мозга благодаря сохранению деятельности сердца есть возможность компенсировать грубые патологические изменения путем проведения интенсивной терапии [Хубутия М.Ш., 2011]. Однако активное развитие клинической трансплантологии способствовало смещению приоритетов в работе с ними к получению органов, пригодных для пересадки. В результате изза отсутствия способов миелоаспирации, приспособленных для выполнения в ходе операции мультиорганного забора, КМ остаётся несобранным.

Таким образом, до настоящего времени особенности посмертного сбора КМ наиболее изучены только для ТД с небьющимся сердцем. При этом существующие методы заготовки имеют ряд недостатков, негативно отражающихся на эффективности сбора и качестве получаемого биоматериала.

Разработка нового соответствующего актуальным техническим возможностям хирургического способа сбора КМ от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем, а также оценка возможности использования прогенеторных клеток получаемого костного мозга в клинической практике, вероятно, позволит сократить дефицит клеточного материала и даст импульс к клиническому изучению эффективности его применения.

Цель исследования Разработать новый хирургический способ заготовки костного мозга от трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем, и оценить возможность использования прогенеторных клеток получаемого костного мозга в клинической практике.

Задачи исследования

1. Определить пути увеличения эффективности заготовки костного мозга от трупных доноров с небьющимся сердцем.

2. Оптимизировать методику установки троакаров в крыло подвздошной кости для обеспечения одновременной заготовки от трупного донора костного мозга и других тканей, органов.

3. Разработать новую одноразовую многоканальную закрытую систему заготовки костного мозга, позволяющую получить от трупного донора большое количество жизнеспособных стволовых клеток.

4. Сравнить прогенеторные клетки костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем.

5. Оценить возможность использования клеток костного мозга трупных доноров для изготовления клеточно-тканевых композиций на основе биологических аллотрансплантатов, применяемых в клинической практике.

Научная новизна Разработан новый способ сбора КМ от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем. Экспериментально обоснованно использование большего разряжения и комбинирование простой аспирации с аспирацией-промыванием для увеличения эффективности заготовки КМ от ТД. Определены актуальные критерии системы для автоматизированного сбора КМ от ТД. На основании полученных результатов разработана новая одноразовая многоканальная закрытая система заготовки костного мозга, позволяющая проводить автоматизированную миелоаспирацию и получать от ТД большое количество жизнеспособных стволовых клеток. Показана возможность получения от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем стволовых клеток в количестве, сопоставимом с терапевтической дозой для системного применения взрослому человеку.

Проведена сравнительная характеристика клеток КМ ТД с бьющимся и небьющимся сердцем. Показано по каким культуральным свойствам клетки КМ ТД с бьющимся и небьющимся сердцем сопоставимы или различаются между собой, с образцами, выделенными из КМ здоровых доноров. Показана совместимость клеток КМ ТД с аллогенными тканевыми трансплантатами, применяемыми в клинической практике.

Практическая значимость Использование при сборе КМ разрежения 0,6-0,7 Атм увеличивает эффективность миелоаспирации и не влияет на жизнеспособность получаемых клеток. Применение метода аспирации-промывания позволяет получить от ТД с небьющимся сердцем биоматериал, с большим содержанием прогенеторных клеток. Однако их качество ниже, чем при использовании простой аспирации.

Последовательное выполнение методов простой аспирации и аспирациипромывания обеспечивает сбор жизнеспособных стволовых клеток в количестве, сопоставимом с терапевтической дозой для системного применения взрослом пациенту.

Использование оптимизированной хирургической техники пункции кости при укладывании ТД в положение «на спине» позволяет проводить одновременно сбор КМ и других тканей. При этом объединение троакаров с помощью ОМЗС обеспечивает возможность проводить сбор КМ одновременно из нескольких точек пункции кости, методами простой аспирацией, аспирацией-промыванием с использованием увеличенного разряжения. Конструктивные особенности ОМЗС позволяют автоматизировать сбор и оперативно переходить от одного метода сбора к другому не разгерметизируя накопительный контур.

Получаемые из КМ трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем ГСК и ММСК можно использовать для изготовления клеточно-тканевых конструкций на основе аллогенных тканевых трансплантатов.

–  –  –

Внедрение результатов работы Методика сбора костного мозга, разработанная в ходе данного исследования, внедрена в практику отделения консервирования тканей и производства трансплантатов НИИ СП им. Н. В. Склифосовского.

Материал диссертации использован в 1 патенте на изобретение: патент 2 523 563 С1 «Технология получения костного мозга от доноров-трупов с бьющимся и небьющимся сердцем» от 20.07.2014 г.

Личный вклад соискателя Автор непосредственно участвовал в планировании и проведении всех этапов исследования, выборе методов исследования, заготовке КМ от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем, оптимизации техники хирургических манипуляций, разработке конструкции новой одноразовой многоканальной закрытой системы для сбора КМ и её испытании, изучении и сравнении свойств стволовых клеток, получаемых от ТД, систематизации и интерпретации полученных клинических и экспериментальных данных, их анализе.

Аналитический обзор литературы также выполнен автором.

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на 5-й международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых в 2010 г., 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» в 2010 г., 5-м симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических клеток» в 2011 г., 6-м Всероссийском съезде трансплантологов с международным участием в 2012 г., 1-м Евразийском конгрессе «Трансплантация стволовых клеток» в 2013 г.

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них в журналах, рецензируемых ВАК РФ, – 2.

–  –  –

Библиографический указатель включает 111 источников, из них 25 – отечественных и 86 – зарубежных.

ГЛАВА 1. КОСТНЫЙ МОЗГ ТРУПНЫХ ДОНОРОВ КАК

ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ

КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Стволовые клетки и источники их получения в клинической практике 1.1 В клинической практике для восстановления утраченной функции органов все чаще прибегают к методам «клеточной» терапии, подразумевающим достижение результата за счёт способностей стволовых клеток к самообновлению и дифференцировке в разных направлениях [1, 20].

Первое свойство проявляется в сохранения после деления клеткамипотомками исходных фенотипа и свойств. Оно обеспечивает самостоятельное поддержание популяции стволовых клеток в организме. Дифференцировка – процесс, выражающийся в утрате клетками способности к самообновлению и приобретении ими свойств, позволяющих выполнять специфические функции.

От того, в каком направлении может происходить дифференцировка стволовые клетки, получение которых возможно в постнатальном периоде, разделяют на группы [10]:

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) – предшественники всех клеток крови миелоидного и лимфоидного рядов [25].

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) – клетки способны дифференцироваться в остеобласты, хондроциты и адипоциты [12, 62].

Тканеспецифичные прогенеторные клетки — представляют собой малодифференцированные клетки, располагающиеся во всех тканях и первыми включающиеся в процесс замещения погибших специализированных клеток.

В зависимости от выраженности патологического процесса методы терапии могут подразумевать стимулирование стволовых клеток или их трансплантацию.

Для активации пролиферации и дифференцировки прогенеторных клеток in situ, как правило, используют сигнальные молекулы [46, 87]. Однако сложность формирования из них стабильной лекарственной формы выражается в высокой стоимости лечения. При этом в случае гибели резидентных прогенеторных клеток или утраты ими способности воспринимать и адекватно отвечать на посланные сигналы «стимулирующая» терапия будет не эффективна.

Трансплантацию клеток традиционно применяют в лечении пациентов с онкогематологическими заболеваниями [59]. Для них разработаны и постоянно совершенствуются протоколы подготовки ГСК, дозы и схемы их введения [55].

В хирургии, травматологии и ортопедии, когда требуется замещение соединительных тканей, как правило, используют ММСК [7, 27, 92]. При этом вне зависимости от типа применяемых стволовых клеток для оценки эффективности и стандартизации протоколов лечения используют унифицированный термин «терапевтическая доза» - оптимальное количество клеток, позволяющее достичь ожидаемого эффекта [84, 62].

Планируя трансплантацию, специалисты так же принимают решение от кого будут получены стволовые клетки. В случае сбора биоматериала от пациента операцию называют аутотрансплантацией, а образцы - аутологичным.

Преимуществом этого варианта является идентичность геномов реципиента и клеток трансплантата, что способствует приживлению последнего в организме [35, 110]. Однако при генетической детерминированности патологического процесса для достижения реконвалесценции необходимо использовать клетки, не имеющие атипичные гены и обязательно от донора одного биологического вида с реципиентом. В этой ситуации процедуру называют аллотрансплантацией, а образцы аллогенным. При этом для снижения вероятности иммуноопосредованного повреждения трансплантата, которое может выразиться в снижении эффективности его применения, проводят тщательный подбор пары донор-реципиент исходя из степени их гистосовместимости [56].

Таким образом, в современном понимании стволовые клетки являются универсальными стабильными модулями, которые могут создавать устойчивые ростки новой здоровой ткани в больных органах. Однако естественные ограничения направлений дифференцировки стволовых клеток, получаемых от человека в постнатальном периоде, обуславливают необходимость взвешенного подхода к их клиническому применению. При этом от схожести генотипов донора и реципиента в значительной степени зависит судьба пересаженной клетки и её потомков в организме пациента.

Формально в большинстве тканей организме человека содержаться резидентные прогенеторные клетки, которые обеспечивают in situ физиологические процессы регенерации. Однако использовать для получения клеток в количестве, достаточном для формирования «терапевтической дозы», возможно лишь некоторые из них. В частности, жировую ткань специалисты рассматривают в качестве богатого источника ММСК [29]. Клетки выделяют из биоматериала, получаемого в результате хирургической операции. Ткань гомогенизируют, обрабатывают растворами ферментов и помещают в специализированные ростовые среды. Затем клетки, мигрировавшие из неё на ростовую поверхность, длительно масштабируют до накопления необходимого количества. В итоге зачастую получают культуру, состоящую из клеток, соответствующих международным минимальным критериям ММСК [4, 93].

Основным преимуществом использования жировой клетчатки является возможность получения аутологичных стволовых клеток из, как правило, утилизируемой иссеченной ткани. Однако в случае её отсутствия проводить хирургическое вмешательство специально для сбора биоматериала не целесообразно.

Идея получать стволовые клетки из невостребованных тканей получила развитие в работах с пуповиной и пуповинной кровью, остающимися после рождения ребенка. Этому способствует доступность биоматериала и достаточное его количество. Выделение клеток из «Вартонова студня» пуповины специалисты зачастую проводят способом, аналогичным применяемому в работе с жировой тканью [80]. Результатом работы является получение клеток, соответствующих международным минимальным критериям ММСК [45], но, как правило, аллогенных по отношению к потенциальному реципиенту. Общим недостатком использования жировой ткани и пуповины в качестве источника стволовых клеток является возможность получение только ММСК. При этом в случае необходимости накопления значительного их количества возможно длительно культивировать биоматериал [94]. В итоге активная пролиферация может истощить клетки, а многократные пассирования увеличивают вероятность спонтанного изменения их генотипа. Пуповинная кровь, в отличие от «Вартонового студня», помимо ММСК так же содержит ГСК. При этом их количество значительно преобладает [21, 79]. Биоматериал после сбора, оценки консервируют и в случае необходимости применяют, как правило, не разделяя на фракции [33]. Однако из-за сложности масштабировать ГСК их общего количества в пуповинной крови порой недостаточно для формирования терапевтической дозы [28, 34, 98]. В результате для изготовления трансплантатов, позволяющих с высокой вероятностью достичь требуемого результата, наиболее часто прибегают к получению биоматериала от взрослых аллогенных доноров.

В клинической практике наибольшая «терапевтическая доза» стволовых клеток используется в терапии пациентов гематологического профиля. С целью получения от донора-добровольца трансплантата для системного применения используют методы, подразумевающие увеличения в крови количества ГСК, или сбор КМ.

Для стимуляции миграции ГСК в кровь используют препараты, содержащие гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) [57]. Донору проводят фармакотерапию, а затем выполняют процедуру лейкоцитоафереза с получением концентрата ядросодержащих клеток крови. Их собранных мононуклеаров ГСК выделяют методом иммуномагнитной сепарации с помощью специализированных парамагнитных частиц, которые селективно связывающихся с рецепторами на их поверхности. Выделенные клетки могут быть сразу применены или законсервированы [69, 97]. Основным преимуществом описанной методики является малоинвазивность [85]. Однако трансплантация ГСК без клеток, формирующих для них естественное микроокружение, может отрицательно отражаться на эффективности лечения.

Загрузка...

В настоящее время специалистами признано, что наибольшее количество прогенеторных клеток разных типов содержится в КМ человека. В результате он является наиболее предпочтительным источником получения ГСК, ММСК для клинического применения [16]. Биоматериал у доноров, как правило, собирают из крыльев подвздошных костей (КПК) методом простой аспирации. Специальной иглой (троакаром) через кожу и мягкие ткани пунктируют кость и, создавая разрежение в накопительном устройстве, подключенном к троакару, собирают КМ. Из одного прокола заготавливают в среднем до 15-20 мл миелоаспирата, после чего меняют точку пункции. Процедуру повторяют до получения 1000-1500 мл биоматериала [38, 90]. При этом выполнение большого количества проколов троакаром мягких тканей, кости диктует необходимость проведения донору анестезиологического пособия. А кровопотеря, которая формируется при миелоаспирации и эквивалентна количеству полученного биоматериала, требует оперативного восполнения [40, 102]. В итоге сочетание высоких требований к соматическому состоянию, большого объема интраоперационной травмы, риска возникновения в послеоперационном периоде осложнений обуславливает дефицит доноров добровольцев [77, 105]. При этом из-за отсутствия возможности подобрать пару донор-реципиент и сформировать терапевтическую дозу клеток из консервированных образцов значимое количество пациентов не получают лечения [111]. В тоже время КМ трупных доноров (ТД), от которых заготавливают органы и ткани для пересадки, остаётся не востребованным.

В соответствии с действующими нормативно-правовыми актами ТД признают людей, находящиеся в состоянии гибели мозга или биологической смерти [5]. Смерть мозга констатируют в случае полного и необратимого прекращения у донора всех функций головного мозга, на фоне автономной сердечной деятельности. В большинстве стран мира, включая Российскую Федерацию, смерть мозга юридически признана эквивалентной смерти человека («социальная смерть») [3, 22]. Смерть мозга может развиваться в результате его первичного повреждения вследствие резкого повышения внутричерепного давления и обусловленного им прекращения мозгового кровообращения, а также открытой черепно-мозговой травмы, внутричерепных оперативных вмешательств на мозге и других факторов. Вторичное повреждение мозга возникает в результате гипоксии различного генеза. Благодаря наличию у доноров со смертью мозга самостоятельной деятельности сердца (ТД с бьющимся сердцем) у специалистов есть возможность компенсировать грубые патологические изменения, наступающие в результате нарушения основных витальных функций, и сохранять органы пригодными для трансплантации относительно длительное время [3, 19].

Биологическую смерть человека устанавливают в случае прекращения более чем на 30 минут деятельности сердца (ТД с небьющимся сердцем), дыхательной системы, активности мозга и при наличии других достоверных признаков смерти.

Традиционно от ТД с небьющимся сердцем получают ткани, в последующем подвергающиеся девитализации, КМ и некоторые органы (почки). Однако отсутствие у доноров с биологической смертью кровотока и газообмена сбор требует проведения сбора биоматериала в короткие сроки [24].

Таким образом, получить в короткие сроки ГСК и ММСК в количестве, достаточном для формирования терапевтической дозы, без дополнительного культивирования клеток можно только из КМ. Однако травматичность операции миелоаспирации зачастую исключают возможность проведения процедуры аутодонорства у некоторых групп пациентов, а также формирует дефицит доноров-добровольцев. Учитывая, что ТД с бьющимся и небьющимся сердцем являются признанным и активно используемым источником органов и тканей для трансплантации получение от них КМ является актуальным и перспективным направлением поиска возможностей компенсировать дефицит стволовых клеток в клинической практике [74].

Сбор костного мозга от трупных доноров 1.2 Вопросы сбора КМ от ТД специалисты наиболее активно изучали в 70-80 годах прошлого века на людях с биологической смертью. Полученные результаты дали основание рассматривать ТД как альтернативный источник получения КМ для клинического применения [11, 41]. При этом были сформированы показания и противопоказания к проведению миелоаспирации у ТД [6, 95].

Методы получения КМ от ТД условно делят на 2-е группы [39, 106]:

Подразумевающие экстракорпоральное выделение КМ из костей.

Кости, содержащие миелоидную ткань, иссекают у доноров и механически разрушают. Из полученных фрагментов клетки вымывают раствором [8, 68, 108].

Основанные на аспирации КМ. Кость через кожу и подлежащие мягкие ткани пунктируют специальной костной иглой - троакаром.

Затем к троакару подключают накопительную ёмкость и, создавая в ней разрежение, аспирируют КМ. Из одного прокола кости заготавливают не более 15-20 мл биоматериала, после чего меняют точку установки троакара. Процедуру повторяют до получения необходимого объема миелоаспирата [14].

Изначально считалось, что методы, относящиеся к первой группе, позволяют выделить из костной ткани максимальное количество прогенеторных клеток [14, 75]. Однако детальные исследования показали, что механические воздействия, направленные на разрушение костного материала, приводят к повреждению значительного количества прогенеторных клеток. При этом экстракорпоральная обработка биоматериала сопряжена с высоким риском контаминации его болезнетворными агентами. В результате специалисты практически отказались от использования этих методов в пользу аспирации.

В соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию посмертного костного мозга Министерства здравоохранения СССР» от 1989 года, сбор КМ от ТД проводят способом, аналогичным применяемому у живых доноров [6]. При этом в случае использования модулей, автоматизирующих аспирацию, рекомендовано использовать постоянное разряжение 0,4 Атм (300 мм рт.ст.) [14].

Однако эффективность стандартного метода у доноров, находящихся в состоянии биологической смерти, как правило, ниже. Вероятно, это обусловлено отсутствие давления в кровеносном русле и изменения реологических, динамических свойств крови, что препятствует прохождению её через кость. В результате рекомендованного разрежения зачастую недостаточно для эффективного вымывания стволовых клеток из губчатого вещества [14]. Таким образом, определение путей увеличения эффективности миелоаспирации от ТД с небьющимся сердцем является актуальной задачей, решение которой позволит получать больше стволовых клеток при сборе костного мозга.

Одним из возможных способов преодоления сопротивления току крови через кость представляется использование вакуума большей рекомендованной величины. Предположение основано на том, что при отсутствии давления в сосудистом русле основной силой, обеспечивающей миелоаспирацию, является разряжение, формируемое в накопительной емкости. Однако стоит учитывать, что среда, в которой находятся клетки при аспирации, «не сжимаема». В результате существует обоснованное опасение, что изменение баланса между давлениями внутри клетки и снаружи может отрицательно отразиться на её жизнеспособности. Таким образом целесообразно тщательное изучение влияние используемого при сборе разряжения на качество получаемого биоматериала. При этом стоит учитывать, что в случае выраженной посмертной гемокоагуляции и закрытия всех сосудов, кровоснабжающих область, использование вакуума любой величины не даст ожидаемого результат, поскольку будут отсутствовать пути разрешения разрежения, создаваемого в кости при аспирации.

В руководстве по «Асептической заготовке костного мозга от трупов в военно-полевых условиях» описан метод, подразумевающий нагнетание в кость, параллельно с аспирацией, раствора из экстракорпорального источника аспирация-промывание [14, 101]. В частности, для сбора рекомендуется использовать двухпросветный троакар по одному каналу, которого, происходит отвод биоматериала, а по второму - подача рабочего раствора. Однако объединению двух каналов в одной костной игле присущ существенный недостаток – происходит аспирацию в большей степени рабочего раствора, чем КМ [9]. Вероятно, разведение каналов аспирации биоматериала и нагнетания рабочего раствора позволит эффективнее вымывать клетки из губчатого вещества между ними. При этом максимальное удаление друг от друга, в пределах одной кости, точек пункции кости позволит задействовать в сборе наибольший её объем и исключит необходимость регулярной смены мест установки троакаров. Однако, эффективность предлагаемых модификаций метода аспирации-промывания требует изучения и сравнения с результатами сбора КМ из аналогичного объема кости методом простой аспирации.

1.2.1 Проведение миелоаспирации при эксплантации органов Активное развитие клинической трансплантологии способствовало смещению приоритетов в работе с ТД к получению от них органов, пригодных для пересадки. При этом после эксплантации органов работа с донором зачастую прекращается, а ткани, из которых можно изготовить биологические трансплантаты, и КМ остаются несобранными [23, 72, 73].

Описанные в литературе опыты по заготовке от мультиорганных ТД большого количества КМ подразумевают экстракорпоральное выделение клеток из костей. У доноров после эксплантации органов искали позвонки, которые затем подвергали механической обработке [47, 71, 88]. В результате специалистам удавалось получить значительное количество стволовых клеток разных типов.

Однако недостатки, присущие методам, основанным на экстракорпоральном механическом разрушении костей для выделения КМ, отрицательно отразились на качестве собранного биоматериала [53]. Вероятно, выбор способа получения биоматериала был обусловлен отсутствием после заготовки органов в кровеносном русле крови, в количестве достаточном для осуществления аспирации. Таким образом, адаптация способа миелоаспирации для обеспечения возможности его проведения в ходе стандартной операции по эксплантации органов до элиминации крови позволит получать от мультиорганных ТД КМ с высоким содержанием жизнеспособных клеток.

В настоящее время для сбора КМ методом аспирации донора укладывают в позицию «на животе». Такое положение дает возможность хирургам выполнять многократные пункции задней трети КПК (в которых наиболее выраженно губчатое вещество) через минимальное количество анатомических образований [6]. При эксплантации органов наоборот - ТД укладывают в положение «на спине», которое обеспечивает возможность выполнить необходимый доступ в грудную и брюшную полости. Таким образом, стандартное положение, используемое при сборе КМ, не предполагает и не позволяет одновременно проводить миелоаспирацию и заготавливать органы или другие ткани [73]. Это является существенным недостатком, поскольку для проведения исчерпывающей операции по эксплантации требуется изменение положение донора на столе, что увеличивает время работы с ним. В результате из-за превышения допустимых сроков заготовки тканей специалисты часто вынуждены отказываться от них.

Разработка новых способов пункции крыла подвздошной кости при укладке ТД в положение «на спине», обеспечивающих возможность одновременно выполнять заготовку КМ, органов или тканей, вероятно даст хирургам чаще проводить эксплантацию в максимальный объем.

Интеграции операции миелоаспирации в ход стандартной процедуры заготовки органов могут препятствовать и другие факторы. В частности, проведение классической аспирации КМ шприцем из КПК потребует активного манипулирования троакаром в области малого таза через общий лапаротомный доступ, что безусловно создаст помехи хирургам, выполняющим заготовку органов. При этом нарушение чёткой, слаженной и оперативной работы всех членов бригады может негативно отразиться на пригодности органов для трансплантации.

Гипотетически одномоментная установка в кость всех необходимых для сбора КМ троакаров и объединение их закрытой многоканальной системой позволит расположить накопительную емкостью и работу по созданию, поддержанию в ней разряжения вне операционного поля, что сведёт к минимуму вмешательство в процесс эксплантации органов. При этом проведение миелоаспирации с использованием модулей, автоматизирующих аспирацию биоматериала и перфузию рабочего раствора, значительно снизит участие хирурга в сборе КМ, фактически сведя его к однократной пункции костей в нескольких точках.

В литературе описано специальное устройства для автоматизированной заготовки КМ методом аспирации-промывания - аппарат взятия и трансплантации костного мозга (АВИТ-1) [14]. Он включает единый модуль, обеспечивающий аспирацию с перфузией, и систему, позволяющую проводить сбор биоматериала через двухпросветный троакар. Положительной особенностью такой компоновки является синхронизация скоростей отвода биоматериала и подачи рабочего раствора. Однако проведение миелоаспирации только через один двухпросветный троакар и обусловленная этим необходимость регулярной смены точки пункции кости делает затруднительным использование АВИТ-1 при эксплантации органов.

Таким образом, для проведения миелоаспирации в ходе заготовки от ТД органов и тканей необходима разработка новой одноразовой многоканальной закрытой системы, способной объединить в один накопительный контур сразу несколько троакаров. При этом возможность использовать систему для сбора КМ простой аспирацией и аспирацией-промыванием обеспечит возможность хирургу выбрать метод в зависимости от ситуации и в случае необходимости оперативно переходить от одного к другому. А совместимость системы со стандартным хирургическим оборудованием облегчит внедрение метода в клиническую практику.

Таким образом, вопросы получения КМ от ТД по-прежнему представляют интерес для специалистов. Однако из-за низкой интенсивности исследований в этой области заготовку биоматериала хирурги вынуждены проводить методами, разработанными на морально устаревшей материально-технической базе. При этом из-за того, что они не позволяют выполнять аспирацию одновременно с другими операциями по эксплантациям, КМ от ТД, признанных пригодными для забора органов, не получают. Вероятно, появление нового хирургического метода миелоаспирации от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем даст новый импульс к заготовке от них КМ. В данной ситуации наиболее целесообразным представляется комплексный подход: определение путей увеличения эффективности сбора и разработка нового технического обеспечение этого процесса, учитывающего особенности других операций эксплантаций и соответствующего актуальным техническим возможностям. При этом для обеспечения достоверности оценки эффективности сбора КМ характеристику получаемого биоматериала необходимо проводить с использованием современных объективных критериев.

–  –  –

Рассчитывая общее количество клеток в биоматериале, специалисты оценивают возможность формирования терапевтической дозы и прогнозируют вероятность приживления трансплантата. Помимо количественных показателей, для полноценной характеристики, в биоматериале так же исследуют жизнеспособность клеток:

Количество жизнеспособных клеток. В настоящее время для оперативной оценки жизнеспособности клетки используют критерии отражающие степень проницаемости цитоплазматической и ядерной мембран. Для этого используют красители, не способные проникать через неповрежденные мембраны [89]. Наиболее часто исследование проводят с применением трипанового синего, окрашивающего при проникновении в клетку её цитоплазму в синий цвет. При этом оценку результатов проводят визуально с помощью светового микроскопа, что ограничивает объем исследования и обуславливает субъективностью оценки. Увеличить чувствительность и специфичность исследования можно применяя краситель 7 аминоактиномицина D (7-AAD), который формирует нерастворимый комплекс ДНК [31]. В результате исследование позволяет судить о вовлечении в деструктивные процессы ядра клетки, что увеличивает достоверность оценки её жизнеспособности. При этом использование для оценки результата проточного цитометра позволяет увеличить объем исследования.

Таким образом, в настоящее время у специалистов есть техническая возможность оперативно определить в миелоаспирате параметры, непосредственно отражающие количество и качество стволовых клеток [31, 44].

Это увеличивает полноценность оценки эффективности сбора КМ поскольку исключает вероятность ошибочного суждения о концентрации ГСК и ММСК по косвенным признакам из-за разведения миелоаспирата кровью [60].

1.3 Перспективы применения клеток костного мозга трупных доноров в клинической практике Изложенное ранее позволяет заключить, что вопросы получения от ТД КМ, насыщенного прогенеторными клетками, могут быть с успехом решены технологическим совершенствованием и техническим оснащением процесса миелоаспирации. Однако для оценки возможности клинического применения стволовых клеток КМ ТД необходимо подтверждение наличия у них свойств, присущих клеткам, получаемым от здоровых доноров.

1.3.1 Качество стволовых клеток костного мозга трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем Не смотря на технический прогресс в лабораторной диагностике для исчерпывающей характеристики качества клеток возможностей проточной цитометрии по-прежнему недостаточно. Это обусловлено тем, что исследование подразумевает нахождение клеток в суспензии, а основные свойства они проявляют, только прикрепившись к ростовой поверхности и приняв типичную для них трехмерную ориентацию. Создание условий, имитирующих естественную среду обитания, подразумевают методы исследования клеток в культуре. Они позволяют оценить долю клеток в популяции, способных поддерживать постоянство внутренней среды, выполнять специфические функции и реализовывать митотическое деление. При этом поддержание на физиологичном уровне температуры окружающей среды, газового состава атмосферы и обеспечение необходимыми нутритивными веществами позволяют проводить изучение длительное время. В этом случае основными критериями характеристики клеток КМ является [18, 36, 52]:

Адгезия на пластик – отражает способность клеток фиксироваться к ростовой поверхности, выполненной из культурального пластика.

Позволяет косвенно судить о типе клетки и необходимости создания особых условий для обеспечения её фиксации и специфической ориентации в пространстве.

Количество колониеобразующих единиц – число жизнеспособных клеток, способных формировать самостоятельные колонии (клоногенные прекурсоры).

Скорость удвоения популяции – характеризует пролиферативную активность клеток. Позволяет прогнозировать сроки получения необходимого количества клеток.

Морфология клеток – отражает форму (приобретаемую после фиксации к ростовой поверхности), ядерно-цитоплазматическое отношение, наличие внутриклеточных вакуолей и другие характеристики строения.

Позволяет предположить тип клетки и её функциональную активность.

Фенотип клеток – отражает наличие или отсутствие на поверхности клетки специфических рецепторов. Позволяет по совокупности экспрессируемых рецепторов определить тип клетки [93].

Предрасположенность к дифференцировке – отражает способность клеток под влиянием факторов окружающей среды изменять морфологию, фенотип и приобретать специализированные свойства.

Позволяет подтвердить или опровергнуть принадлежность к прогенеторным клеткам [93, 99, 104].

В настоящее время, используя представленные и некоторые дополнительные критерии, специалисты разносторонне изучили свойства стволовых клеток КМ здоровых доноров, а также провели их сравнительную характеристику с образцами, выделяемыми из других тканей [13, 48, 49].

В результате были сформированы международные минимальные критерии принадлежности клеток к ММСК [93]:

1. Адгезия на пластик

2. Фенотип. Наличие рецепторов ( 95%) CD90, CD73, CD105. Отсутствие рецепторов ( 2%)CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79 или CD19, HLA-DR

3. Способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях К сожалению, автоматически проецировать полученные результаты на биоматериал, собираемый от ТД, не верно. Это обусловлено тем, что у ТД из-за нарушения функционирования основных витальных систем клетки КМ находятся в не физиологичных условиях [58]. В результате существует высокая вероятность, что грубые изменения внутренней среды организма могут негативно отразиться на жизнеспособности и других свойствах стволовых клеток, значимых для эффективности их клинического применения. При этом логично предположить, что у ТД с бьющимся и небьющимся сердцем выраженность нарушений может различаться из-за разной степени насыщения тканей кислородом [88]. Однако, не смотря на длительно существующий интерес специалистов к трупному КМ детального сравнения стволовых клеток, получаемых от ТД с бьющимся и небьющимся сердцем, до сих пор не проведено, что вероятно является одной из причин не востребованности этого биоматериала. Возможно характеристика даже в соответствии с минимальным набором актуальных критериев и сравнение свойств прогенеторных клеток, находившихся в разных условиях окружающей среды, позволит оценить целесообразность использования их в клинической практике и стимулирует интерес специалистов к детальному их изучению.

1.3.2 Использование клеток костного мозга трупных доноров для изготовления комбинированных трансплантатов Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений в биоинженерии является создание комбинированных клеточно-тканевых трансплантатов [64, 100, 107]. Такое подход позволяет не только заместить утраченные ткани, но и обеспечить сохранение клеток в месте применения. При этом совмещение клеток с носителем заблаговременно до имплантации способствует выполнению ими специфических функций.

Выбирая носитель, специалисты руководствуются его совместимостью с клетками человека, отсутствием токсичности, способностью естественным путем разрушаться и стимулировать процесс регенерации [67, 86]. В этой ситуации у биологических трансплантатов есть ряд преимуществ перед синтетическими. В частности, сохранение при изготовлении нативной структуры белков межклеточного матрикса способствует адгезии к нему клеток, что положительно отражается на интенсивности последующей ревитализации. При этом разрушив в аллогенном трансплантате клетки донора, удается значительно снизить вероятность его отторжения, а полное удаление молекулы главного комплекса гистосовместимости из структуры – практически исключить это. При этом продуктами лизиса органической основы является привычные для клеток пептиды и аминокислоты. Дополнительным преимуществом биотрансплантатов на основе аллогенной кости можно считать способность быть не только каркасом для формирующейся кости (остекондукция), но и выделять факторы, стимулирующие её рост (остеиндукция) [30, 63]. В результате по совокупности признаков специалисты часто отдают предпочтение предварительно девитализированным аллогенным трансплантатам на основе кости или децеллюляризированным матриксам на основе белков соединительной ткани.

Другим не менее важным компонентом комбинированного биологического трансплантата являются клетки, используемые при изготовлении [15, 37, 110].

В частности, от их типа зависит по какому пути специалисты будут стремиться добиться компенсации патологического процесса: замещению функции специализированных клеток или стимуляции их пролиферации. При этом от способностей клеток взаимодействовать со стандартными носителями, сохранять при этом жизнеспособность и пролиферативную, синтетическую активность зависят сроки, необходимые для изготовления трансплантата, и его стабильность [78, 109]. Изучение с этих позиций клеток КМ ТД с бьющимся и небьющимся сердцем позволит оценить возможность использования их в клинической практике в составе клеточно-тканевых трансплантатов на основе биологических носителей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика и стратификация трупных доноров Исследование проведено в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского в период с 2009 по 2013 годы на 76 трупных донорах (ТД) – людях, находящихся в состоянии биологической смерти или с констатированной смертью мозга [5].

Критерии включения ТД в исследование. ТД включали в исследование в случае соответствия критериям [6, 42, 51, 54]:

Возраст человека на момент смерти менее 70 лет;

Длительность отсутствия сердечных сокращений менее 6 часов;

Причиной смерти не были: травма, сопровождающаяся проникающим повреждением и обильной кровопотерей; Отравление (за исключением отравления этиловым спиртом); Асфиксия водой или рвотными массами.

В сыворотке крови отсутствовали антитела к ВИЧ 1 и 2 типа, вирусу гепатита С, сифилису, антиген гепатита В.

В анамнезе отсутствовали: неврологические заболевания с неясной этиологией (болезни двигательных нейронов, Альцгеймера, болезни Паркинсона), болезнь Крейтцфельдта — Якоба; Злокачественные опухоли; Генерализованные инфекционно–септические осложнения в случаях, когда диссеминированная инфекция являлась основной или одной из причин смерти донора, бактериального сепсиса с развитием септического шока и полиорганной недостаточности, генерализованной грибковой инфекции, грибковой колонизации легких, туберкулеза, менингита (вызванного L. monocytogenes, M. tuberculosis, простейшими, патогенными грибками); Гепатит любой этиологии, цирроз печени; Малярия; Случаи обострения язвенной болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки в последние 6 месяцев; Случаи острого или обострения хронического воспалительного заболевания любой локализации в течение последнего месяца; Кожные заболевания, психические болезни;

Наркомания.

Распределение ТД по наличию деятельности сердца:

ТД с небьющимся сердцем (биологическая смерть) – 66 человек, имевших признаки биологической смерти, признанные пригодными для изъятия тканей. Донорами были люди, внезапно умершие от острой сердечно-сосудистой недостаточности, инфаркта миокарда, гипертонической болезни, атеросклероза, ишемического и геморрагического инсульта, которым не проводили реанимационных мероприятий. Время с момента констатации смерти до заготовки КМ не превышало 4 часов [6, 24]. Возраст доноров на момент смерти был от 34 до 65 лет. Наибольшее количество доноров было в возрасте 54 лет.

ТД с бьющимся сердцем (смерть мозга) – 10 человек с констатированной смерть мозга на фоне самостоятельной деятельности сердца, признанные пригодными для изъятия органов и тканей. Донорами были пациенты медицинских учреждений, у которых на фоне работающего сердца и непрерывной искусственной вентиляции легких констатировали смерть мозга. Наиболее частой причиной гибели мозга было первичное поражения (черепно-мозговая травма) или вторичное поражение сосудистого генеза (инсульт).

Донорам до момента операции по заготовке органов и тканей проводили терапию, направленную на поддержание физиологичного уровня тканевого кровотока и оксигенации тканей [19]. Возраст доноров на момент смерти был от 21 до 61 лет.

Распределение ТД по исследованиям.

Разработка нового хирургического метода сбора костного мозга от трупных доноров с бьющимся и небьющимся сердцем включала изучение способов увеличения эффективности заготовки КМ от ТД и разработку с учетом полученных результатов, испытание новой одноразовой многоканальной закрытой системы, позволяющей одновременно проводить автоматизированную миелоаспирацию и сбор других органов, тканей (Таблица 2.1):

Возможность увеличения эффективности миелоаспирации использованием повышенного разряжения изучили в 2 этапа на 25 ТД с небьющимся сердцем. Исследование подразумевало параллельный сбор КМ из крыльев обеих подвздошных костей одного ТД с применением разных значений вакуума. Донору в каждое крыло подвздошной кости (КПК) одномоментно устанавливали по 2 троакара, которые объединяли на левой и правой стороне отдельными закрытыми системами с накопительными емкостями. Для создания и поддержания в накопительных контурах разряжения использовали хирургические отсосы. Длительность сбора КМ составляла 30 минут. При статистической обработке данных критерием исключения образцов был сбор менее 100 мл биоматериала.

На 1 этапе аспирацию КМ из одной КПК проводили, используя разряжение 0,4-0,5 Атм, из второй - 0,6-0,7 Атм. В исследовании задействовали 19 ТД. Средний возраст доноров на момент смерти был 52-64 года. В статистическую обработку были взяты данные, полученные от 13 ТД.

На 2 этапе сбор биоматериала проводили, применяя разряжения 0,6-0,7 и 0,9 Атм, соответственно. В исследовании задействовали 6 ТД. Средний доноров на момент смерти был 43-62 года. При статистической обработке были учтены данные полученные от 5 ТД.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
Похожие работы:

«Чэнь Ин Китайская опера ХХ – начала XXI века: к проблеме освоения европейского опыта Специальность 17.00.02 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: кандидат искусствоведения, доцент О.М.Зароднюк Нижний Новгород 201 Содержание Введение Глава I. На пути к освоению культурного опыта Западной Европы и России § 1. От религиозных контактов...»

«Мироненко Александр Владимирович ЭТНОКУЛЬТУРНАЯ СОЦИАЛИЗАЦИЯ ПОДРОСТКОВ В ПРОЦЕССЕ ОСВОЕНИЯ РЕГИОНАЛЬНОГО ФОЛЬКЛОРНОГО ТАНЦА 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель: кандидат педагогических...»

«Тельманова Анастасия Сергеевна СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЕ РАЗВИТИЕ ЛИЧНОСТИ ПОДРОСТКА В ИНТЕГРАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ШКОЛЬНОГО МУЗЕЯ 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор...»

«.   Азоев Эльхан Тофикович   Тактика двухэтапного коронарного вмешательства при лечении пациентов с хроническими окклюзиями коронарных артерий.   14.01.26сердечно-сосудистая хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Миронков Борис Леонтьевич     Москва 2015 год  ...»

«Дружинин Алексей Александрович ХУДОЖЕСТВЕННАЯ ДИОРАМА КАК ВИД ИСКУССТВА Специальность 17.00.04 – изобразительное и декоративно-прикладное искусство и архитектура Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: кандидат искусствоведения КОСТИНА О. В. Москва 2014 Том 1 ОГЛАВЛЕНИЕ Том 1 1 Введение..стр. 5 2 Глава 1. История развития диорамного искусства...»

«ШАХОВ Павел Сергеевич Музыкально-фольклорные традиции мордвы Сибири (приуроченные жанры) Специальность 17.00.02 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание учёной степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: кандидат искусствоведения, профессор Леонова Наталья Владимировна Новосибирск – ОГЛАВЛЕНИЕ Том I...»

«Рыжикова Варвара Андреевна Трансдермальная терапевтическая система бромокаина на основе биосовместимой микроэмульсионной композиции (14.01.24 – трансплантология и искусственные органы) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель,...»

«Цюй Ва ФОРТЕПИАННОЕ ТВОРЧЕСТВО ЧУ ВАНХУА В КОНТЕКСТЕ КИТАЙСКОЙ МУЗЫКИ ХХ ВЕКА Специальность 17.00.02 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: доктор искусствоведения, доцент Кром Анна Евгеньевна Нижний Новгород 201 Оглавление Введение Глава 1. Фортепианное искусство Китая. Прошлое и настоящее 1.1. Истоки. Формирование традиций в сфере...»

«Людмила Николаевна Шаймухаметова Мигрирующая интонационная формула и семантический контекст музыкальной темы. Диссертация на соискание учёной степени кандидата искусствоведения по специальности 17.00.02 «Музыкальное искусство»Научный руководитель: доктор искусствоведения, профессор М.Г. Арановский. Москва – 1994 г. Оглавление Введение Глава I. К изучению мигрирующей интонационной формулы как структурно-семантического стереотипа Глава II. Мигрирующие формулы с относительно...»

«Кузькина Анастасия Викторовна КИЕВСКИЙ РАСПЕВ В ОТЕЧЕСТВЕННОЙ РУКОПИСНОЙ ТРАДИЦИИ ВТОРОЙ ПОЛОВИНЫ XVII – XVIII ВЕКОВ Специальность 17.00.02 Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: доктор искусствоведения, профессор Заболотная Н.В. Москва – Содержание Введение Глава 1. Киевский распев в певческих рукописях 1.1. Особенности рукописных источников киевского распева...»

«ДАВЛЕТЧИН Ильдар Лукманович РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ ДОСУГА ПОДРОСТКОВ В СОЦИАЛЬНО-КУЛЬТУРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ДЕТСКОГО ОЗДОРОВИТЕЛЬНОГО ЛАГЕРЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Специальность 13.00.05 – «Теория, методика и организация социально-культурной деятельности» Научный руководитель:...»

«Гатауллин Александр Анварович Фридрих Робертович Липс: творческая деятельность и ее роль в развитии баянного искусства во второй половине XX – начала XXI века Специальность 17.00.02 Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: доктор искусствоведения, профессор Л. С. Дьячкова Москва – 201 2    Оглавление ВВЕДЕНИЕГлава 1. Фридрих Липс – исполнитель-новатор, аналитик и...»

«Лешуков Алексей Григорьевич СОЦИОКУЛЬТУРНАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ РАЗВИТИЯ РЕКЛАМЫ В РОССИИ 1861–1900 ГГ. 24.00.01 – теория и история культуры Диссертация на соискание ученой степени кандидата культурологии Научный руководитель – доктор исторических наук, доцент Чеботарев Анатолий...»

«СТАХАНОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА РОЛЬ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА БИОМАРКЕРОВ НЕОАНГИОГЕНЕЗА И ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СЕРДЦА 14.01.24 – трансплантология и искусственные органы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор...»

«НОВОДВОРСКАЯ Наталия Борисовна СОЦИАЛЬНО-ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ МЕНЕДЖЕРОВ СОЦИАЛЬНО ОРИЕНТИРОВАННЫХ НЕКОММЕРЧЕСКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель:...»

«Трухина Лариса Николаевна К ПРОБЛЕМЕ СТАНОВЛЕНИЯ ЖАНРА РУССКОЙ НАРОДНОЙ ПЕСНИ НА ЭСТРАДЕ. НА ПРИМЕРЕ ТВОРЧЕСТВА ОЛЬГИ ВАСИЛЬЕВНЫ КОВАЛЁВОЙ Специальность – 17.00.01 – Театральное искусство Диссертация на соискание учёной степени кандидата искусствоведения Научный руководитель – доктор искусствоведения, профессор, Уварова Елизавета Дмитриевна Научный консультант – кандидат искусствоведения,...»

«Коженкин Игорь Александрович ТРАНСФОРМАЦИЯ ТРЕБОВАНИЙ К РАЗРАБОТКЕ И ВНЕДРЕНИЮ СПЕЦИАЛЬНОЙ БИБЛИОТЕЧНОЙ МЕБЕЛИ И ОБОРУДОВАНИЯ В НОВЫХ СОЦИОКУЛЬТУРНЫХ УСЛОВИЯХ Специальность 05.25.03 – Библиотековедение, библиографоведение и книговедение Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный...»

«Цюй Ва ФОРТЕПИАННОЕ ТВОРЧЕСТВО ЧУ ВАНХУА В КОНТЕКСТЕ КИТАЙСКОЙ МУЗЫКИ ХХ ВЕКА Специальность 17.00.02 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Научный руководитель: доктор искусствоведения, доцент Кром Анна Евгеньевна Нижний Новгород 201 Оглавление Введение Глава 1. Фортепианное искусство Китая. Прошлое и настоящее 1.1. Истоки. Формирование традиций в сфере...»

«Гвоздев Алексей Владимирович «Многокомпонентная система исполнительской техники как основа интерпретаторского творчества скрипача» Специальность: 17.00.02 – Музыкальное искусство Диссертация на соискание ученой степени доктора искусствоведения Новосибирск ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. РАЗВИТИЕ ВЗГЛЯДОВ НА ПРОБЛЕМЫ ФОРМИРОВАНИЯ...»

«ДОРОФЕЕВА Юлия Юрьевна АКТИВИЗАЦИЯ ТВОРЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СТУДЕНТОВ СРЕДСТВАМИ ХУДОЖЕСТВЕННОЙ ФОТОГРАФИИ В ПРОЦЕССЕ ОБУЧЕНИЯ ДИЗАЙНЕРОВ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (изобразительное искусство) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель: доктор педагогических наук, профессор Шаляпин Олег Васильевич Омск СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..3 Глава I. НАУЧНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТВОРЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СТУДЕНТОВ..17 1.1....»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.