WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

«Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова

Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Табакмахер Валентин Михайлович

Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа

актинии Heteractis crispa

02.00.10 – Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата химических наук



Научные руководители:

к.ф.-м.н. Зелепуга Елена Александровна д.х.н. Монастырная Маргарита Михайловна Владивосток – 2014 Благодарности Прежде всего, я хотел бы поблагодарить моих научных руководителей и учителей, к.ф.м.н. Елену Александровну Зелепуга и д.х.н. Маргариту Михайловну Монастырную, за руководство, поддержку на всех этапах выполнения настоящей работы и помощь в оформлении данного исследования в виде диссертации. Они помогли мне понять логику проведения научного эксперимента, научиться писать научные статьи и понять основы научной этики. Особенно я благодарен за создание рабочей атмосферы исследовательского азарта, а также за научные дискуссии, которые легли в основу нашего исследования, и ценные советы, которые помогли мне развить собственные идеи и стать независимым ученым.

Я благодарю заведующего лабораторией химии пептидов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, д.х.н. Эмму Павловну Козловскую, за созданные условия и уникальные возможности для работы, а также ценные замечания и рекомендации при выполнении данного исследования. Я искренне признателен за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов исследования моим коллегам в лаборатории химии пептидов, к.х.н. Ирине Николаевне Гладких и к.х.н. Елене Владимировне Лейченко, а также аспирантам Оксане Владимировне Синцовой, Римме Сергеевне Калиной, Александре Николаевне Кветкиной и студентке Анастасии Андреевне Терентьевой. Я глубоко признателен к.х.н. Виктории Евгеньевне Чаусовой и к.б.н. Екатерине Сергеевне Ткачёвой за помощь и обучение экспериментальным методам белковой химии на начальных этапах выполнения данной работы. За сотрудничество и помощь в проведении биоиспытаний я благодарю сотрудника группы изучения биологически активных добавок, к.б.н. Ольгу Николаевну Кривошапко.

Я благодарен за помощь, методологические дискуссии и практические советы аспирантам и студентам лаборатории морской биохимии, Надие Муссаевне Тищенко, Евгении Петровне Быстрицкой, Василию Александровичу Голотину, Николаю Владимировичу Гончарову, Надежде Юрьевне Чернышевой, а также сотрудникам лаборатории химии ферментов к.х.н. Артёму Сергеевичу Сильченко, лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитетак.х.н. Ольге Вениаминовне Сидоровой и лаборатории инструментальных и радиоизотопных методов анализа к.х.н. Станиславу Дмитриевичу Анастюку.

Я глубоко признателен за сотрудничество и помощь всем сотрудникам и аспирантам лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, а также заведующему, д.х.н., академику РАН Евгению Васильевичу Гришину, за предоставленную возможность провести часть экспериментальной работы в данной лаборатории. Отдельно мне бы хотелось поблагодарить к.б.н. Ярослава Алексеевича Андреева и к.х.н. Дмитрия Игоревича Осмакова за обучение основам молекулярного клонирования и работы с рекомбинантными биополимерами.

Я искренне благодарен заведующему лабораторией межмолекулярных взаимодействий ИБМХ им. В. Н. Ореховича, д.б.н. Алексею Сергеевичу Иванову, а также к.б.н. Оксане Валентиновне Гнеденко за сотрудничество при проведении биосенсорных исследований и помощь в интерпретации полученных результатов.

Я благодарю сотрудников лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН, к.б.н.

Константина Вадимовича Киселёва и к.б.н. Алексея Петровича Тюнина, за плодотворные научные дискуссии, профессиональные консультации, ценные советы и рекомендации при выполнении экспериментальной части работы.

За поддержку на разных этапах выполнения работы я хочу поблагодарить сотрудников ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН: Андрея Владимировича Есипова, к.х.н. Сергея Анатольевича Дышлового, д.б.н., член-корр. РАН Валерия Викторовича Михайлова, к.х.н.

Викторию Васильевну Сова, к.б.н. Константина Анатольевича Дроздова, д.х.н. Ольгу Данииловну Новикову, д.х.н. Вячеслава Леонидовича Новикова, к.х.н. Дмитрия Константиновича Чистюлина; сотрудников ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.





Овчинникова РАН: д.х.н., член-корр. РАН Виктора Ионовича Цетлина, д.ф-м.н. Романа Гербертовича Ефремова, к.ф.-м.н. Антона Олеговича Чугунова, к.ф.-м.н. Павла Евгеньевича Волынского, к.х.н. Дмитрия Евгеньевича Нольде, к.ф.-м.н. Антона Александровича Полянского, к.ф.-м.н. Константина Сергеевича Минеева. За моральную поддержку я благодарю моих друзей: Константина Анатольевича Якимчука, Евгению Сергеевну Константинову, Алексея Анатольевича Косарева, Дмитрия Анатольевича Якимчука, Сергея Александровича Дегтярёва, Алексея Алексеевича Патрикеева, Элину Александровну Радченко, Ивана Андреевича Денисова, Вячеслава Леонидовича Макогина, к.х.н. Наталью Викторовну Агеенко, Алексея Владимировича Костеша, Вадима Валерьевича Искучекова, Максима Григорьевича Капранова, Марию Сергеевну Перловскую, к.б.н. Ольгу Владимировну Апаликову, Лидию Ивановну Титову и Олега Петровича Каминского.

Отдельно я благодарю к.б.н. Ирину Альбертовну Бронову и к.б.н. Евгения Витальевича Бердышева за то, что они убедили меня поступить в аспирантуру и заняться научноисследовательской деятельностью. За лояльность и поощрение моего интереса к этому занятию я благодарю моего отца, Михаила Иосифовича Табакмахера, мою мать, Татьяну Владимировну Табакмахер, и сестру, Ксению Михайловну Табакмахер.

Настоящая работа выполнена во многом благодаря поддержке, проявленному вниманию и интересу каждого из этих людей.

Оглавление Список используемых сокращений и обозначений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений

2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования

2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки

2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла

2.3.2. Трехпетлевые токсины змей

2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным /-мотивом

2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных

2.4. Полипептиды Кунитц-типа

2.4.1. Структура

2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами

2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие

2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа

2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей

2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков

2.4.3.4. Полипептиды Кунитц-типа яда скорпионов

2.4.3.5. Полипептиды Кунитц-типа яда конусов

2.4.3.6. Полипептиды Кунитц-типа земноводных

2.4.3.7. Полипептиды Кунитц-типа яда перепончатокрылых

2.4.3.8. Полипептиды Кунитц-типа яда актиний

2.5. Молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа актиний

2.5.1. Сериновые протеиназы

2.5.1.1. Классификация

2.5.1.2. Механизм катализа гидролитического расщепления пептидной связи..................35 2.5.1.3. Функциональное разнообразие

2.5.2. Ионные каналы – молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа

2.5.2.1. Общая характеристика ионных каналов

2.5.2.2. Потенциалзависимые ионные каналы. Kv каналы

2.5.2.3. Рецептор TRPV1

2.5.2.4. Структура и функциональные детерминанты TRPV1

2.5.2.5. Терапевтический потенциал агонистов и антагонистов TRPV1

3. Обсуждение результатов

3.1. Выделение ингибиторов Кунитц-типа из актинии H. crispa

3.2. In silico исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки H. crispa

3.2.1. Сравнительная характеристика структурных и функциональных особенностей.......52 3.2.2. Компьютерное моделирование пространственных структур полипептидов Кунитц-типа актиний

3.2.3. Расчетные физико-химические характеристики HCGS-полипептидов

3.2.4. Анализ молекулярного электростатического потенциала

3.2.5. Установление структурно-функциональных взаимосвязей

3.2.5.1. Структурные модели комплексов с -химотрипсином

3.2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином

3.2.5.3. Структурные модели комплексов с эластазой нейтрофилов человека

3.2.5.4. Структурные модели комплексов с рецептором TRPV1

3.3. Получение рекомбинантных полипептидов семейства Кунитца H. crispa.

Исследование физико-химических характеристик и биологической активности

3.3.1. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе кДНК

3.3.2. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе синтетических генов

3.3.3. Определение констант ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами

3.3.4. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами методом поверхностного плазмонного резонанса

3.3.5. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов.............98

4. Экспериментальная часть

4.1. Материалы и реактивы

4.2. Биологический материал, бактериальные штаммы и животные

4.3. Приборы и оборудование

4.4. Методы исследования

4.4.1. Выделение природных ингибиторов Кунитц-типа

4.4.2. Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа...............106 4.4.3. Методы получения рекомбинантных полипептидов и определения их физикохимических характеристик и биологической активности

4.4.4. Методы тестирования анальгетической активности

5. Заключение

6. Выводы

7. Список литературы

Список используемых сокращений и обозначений а.о. – аминокислотный остаток;

БПТИ (BPTI, апротинин) – бычий панкреатический ингибитор трипсина;

База данных EST (англ. expressed sequence tags database) – совокупность коротких нуклеотидных последовательностей, которые получены в результате секвенирования кДНК;

ДМФА – диметилформамид;

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИПТГ – изопропил--D-тиогалактозид;

ккал/моль – килокалорий на моль;

Кристаллическая структура – структура химического соединения, установленная с помощью рентгеноструктурного анализа;

МЭП – молекулярный электростатический потенциал;

об/мин – оборотов в минуту;

ОФ ВЭЖХ – обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография;

ПААГ – полиакриламидный гель;

Поисковая функция (scoring function) – математический метод (или набор методов), используемый для прогнозирования прочности нековалентного взаимодействия (сродства) между двумя молекулами в результате молекулярного докинга;

ПЦР – полимеразная цепная реакция;

СПН – сериновые протеиназы нейтрофилов;

Трис – тригидроксиметиламинометан;

ТФУ трифторуксусная кислота;

Фолд (англ. fold – клубок) – пространственная укладка белковой молекулы;

н.п. – пары нуклеотидов;

ЦНС центральная нервная система;

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЯМР – ядерный магнитный резонанс;

ЯМР-структура – структура химического соединения, установленная с помощью методов ЯМР-спектроскопии;

ASA – изменение площади поверхности молекулы, доступной растворителю (в результате образования комплекса);

ATP – аденозинтрифосфат;

BAPNA – п-нитроанилид N-бензоил-D,L-аргинина;

BSA – бычий сывороточный альбумин;

CS/ – цистеин-стабилизированный /-мотив;

DTXs – дендротоксины из яда черной мамбы;

EC (Ensime Classification) – современная международная система классификации ферментов;

EC50 – концентрация лиганда, вызывающая эффект, равный половине максимально возможного для данного лиганда после истечения определенного промежутка времени;

HNE (Human Neutrophil Eastase) – эластаза нейтрофилов человека;

IC50 – концентрация полумаксимального ингибирования;

ICK (Inhibitor Cystine Knot) – структурный мотив «цистеинового узла»;

Kd – константа диссоциации;

Ki – константа ингибирования;

Kv – потенциалзависимый калиевый канал;

dNTPs – дезоксинуклеозидтрифосфаты;

MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)

– времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией;

Mr – молекулярная масса;

PDB (Protein Data Bank) – база данных пространственных структур полипептидов;

PDB ID – уникальный шифр доступа пространственной структуры каждого белка в базе данных PDB;

PIP2 – фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат;

RMSD (Root-Mean-Square Deviation) – среднеквадратичное отклонение;

SDS – додецилсульфат натрия;

SLPI – секреторный ингибитор протеазы лейкоцитов;

SPR (Surface Plasmon Resonance) – поверхностный плазмонный резонанс;

TFT (Three-Finger Toxins, 3FTX) – трехпетлевые токсины змей;

TRPV1 (Transient Receptor Potential cation channel, subfamily V, member 1) – ваниллоидный рецептор/канал (управляет неселективным ионным каналом, является полимодальным детектором многих болевых стимулов);

Trx – тиоредоксин;

UniProt – универсальный протеиновый ресурс, белковая база данных;

UniProt AN (UniProt Accession Number) – уникальный шифр доступа каждого конкретного белка в базе данных UniProt.

1. Введение Полипептиды структурного семейства Кунитца – широко распространенная группа соединений, выделенных из ядов животных самого разнообразного систематического положения. Исследовательский интерес к соединениям данной группы, обнаруженным в актиниях, обусловлен проявляемой ими биологической активностью: анальгетической, антигистаминной, а также способностью ингибировать протеолитические ферменты, модулировать ионотропные рецепторы и блокировать потенциалзависимые ионные каналы.

Так, для некоторых представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa показана способность модулировать болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, ингибировать сериновые протеиназы, оказывать антигистаминное действие. Такое разнообразие функциональной активности указывает на возможный терапевтический потенциал данных полипептидов при лечении болевых и воспалительных состояний и патологий, связанных с нарушением регуляции системы протеолиза. Однако молекулярные механизмы биологического действия, проявляемого этими соединениями, в настоящее время требуют выяснения.

Данная работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью исследования является установление структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать нативные полипептиды Кунитц-типа из актинии H. crispa.

2. Провести биоинформационный анализ представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа H. crispa с целью выявления молекул, перспективных для получения их рекомбинантных форм.

3. С помощью расчетных методов идентифицировать структурные детерминанты полипептидов, ответственные за взаимодействие с биологическими мишенями.

4. Создать генетические экспрессионные конструкции и получить отобранные полипептиды в рекомбинантной форме.

5. Определить физико-химические характеристики рекомбинантных полипептидов, установить их функциональную и биологическую активность.

2. Литературный обзор

2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений Среди огромного многообразия продуцентов биологически активных полипептидов особое место принадлежит ядовитым организмам. Известны тысячи ядовитых животных самого разнообразного систематического положения, включая кишечнополостных (актинии, медузы, кораллы), иглокожих (морские ежи), моллюсков (брюхоногие и головоногие), членистоногих (пауки, скорпионы, многоножки, насекомые), рыб, амфибий, рептилий (змеи, ящерицы) и даже млекопитающих (утконос, землеройковые, толстый лори) [1].

Согласно современным представлениям, их яды являются биологическими секретами специализированных органов [2]. Они содержат соединения, которые нарушают нормальные физиологические и биохимические процессы в организме жертвы и выполняют алломональную и/или пищеварительную функцию для животного-продуцента. Чаще всего яд используется животными для охоты или защиты от естественных врагов. Однако иногда ядовитый секрет играет роль инструмента сохранения и укрепления системы внутривидовых иерархических взаимоотношений [2].

Поскольку в процессе эволюционного развития филогенетически отдаленных видов их яд меняется независимо и служит для выполнения разных задач, компонентный состав яда, система его доставки и физиологические мишени чрезвычайно разнообразны у различных организмов [2]. Известно, что компоненты ядов животных оказывают различное физиологическое действие на организм жертвы: гемотоксическое (затрагивающее сердечнососудистую систему), нейротоксическое (воздействующее на нервную систему и мозг) и цитотоксическое (разрушающее клетки локально), а также вызывают патологические состояния, связанные с дыхательной, мышечной, мочевыделительной и желудочнокишечной системами [3–5].

В результате интоксикации биологическими ядами у жертвы могут наблюдаться самые разнообразные симптомы, как локальные (местная боль, отек, волдыри, сыпь, некроз тканей), так и системные (головная боль, нарушение зрения, лихорадка, тошнота, рвота, диарея, увеличение лимфатических узлов, головокружение, мышечная слабость, потеря координации или паралич). Зачастую отравления сопровождаются дисфункцией кровеносной системы:

нарушениями гемостаза, тромбозом и коагуляцией крови, внезапными кровотечениями, и нередко воздействие ядов приводит к коллапсу и смерти жертвы [1].

Все эти симптомы имеют различную биохимическую основу. Молекулярными мишенями компонентов ядов являются мембранные рецепторы и ионные каналы, а также цитоплазматические мембраны. Нарушение их функции нейротоксинами ядов может приводить к выбросу нейромедиаторов и запуску каскадов физиологических реакций, приводящих к сердечной и дыхательной блокаде, потере чувствительности, параличу и т.д.

Ферменты, такие как фосфолипазы A2 и протеиназы, а также мембраноактивные пептиды/полипептиды, входящие в состав ядовитого секрета, могут вызывать формирование пор, лизис цитоплазматической мембраны, нарушение функционирования различных клеточных компонентов, высвобождение молекул, участвующих в иммунном ответе (цитокинов), что приводит к развитию отеков и воспалительного процесса. Ингибиторы протеиназ могут препятствовать разрушению других полипептидных компонентов яда за счет блокирования протеолитических систем жертвы [6]. Так или иначе, действие ядов животных направлено на дестабилизацию нормальных биохимических и физиологических процессов.

2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования Яды животных являются богатым источником уникальных биологически активных соединений с разнообразной структурой, функциональной активностью и специфичностью действия на молекулярные мишени в организме жертвы. Накопленные к настоящему времени структурные, генетические и филогенетические данные свидетельствуют о том, что в ходе эволюции природа «редактирует» [7] компонентный состав ядов животных таким образом, чтобы среди всего возможного разнообразия молекул в ядовитом секрете присутствовали наиболее эффективные с точки зрения биологической активности.

На данный момент известно два пути «формирования» состава яда. При реализации одного из них в состав яда «отбирается» лишь ограниченное число молекул, обладающих, как правило, широким спектром действия [7]. Так, например, основными компонентами яда медоносной пчелы являются фосфолипаза A2 и пептид мелиттин, обеспечивающие его высокую неспецифическую цитолитическую активность [8, 9], которая необходима для выполнения защитной функции.

Реализация другого пути привела к тому, что в ядах образовались чрезвычайно сложные многокомпонентные смеси, состоящие из солей, низкомолекулярных соединений (полиамины, аминокислоты, нуклеотиды, углеводы), а также белков различных структурных групп (от коротких пептидов до многодоменных глобулярных ферментов) и др. [10]. При этом соединения лишь одной или нескольких структурных групп количественно превалируют в таких ядах. Основными компонентами ядовитого секрета являются чаще всего соединения белковой природы [7].

В ходе эволюции для развития токсической функции в роли «шаблона» (при формировании компонентного состава яда) выступают различные молекулярные фолды [1].

Так, например, в змеином яде встречаются в основном полипептиды с тремя фолдами (фосфолипазы A2, трехпетлевых токсинов и Кунитца), в то время как в яде скорпионов присутствуют преимущественно полипептиды одного фолда (CS/) [11]. То же самое наблюдается и у других ядовитых животных, таких как моллюски-конусы, пауки, актинии.

Тем не менее, все компоненты ядов белковой природы имеют на молекулярном уровне несколько общих особенностей [1]. Практически все они являются секретируемыми полипептидами, содержащими, как правило, N-концевой сигнальный пептид. Для таких полипептидов характерно высокое содержание остатков цистеина, образующих дисульфидные связи, которые обеспечивают жесткость пространственной структуры и устойчивость к протеолитической деградации [2]. Стабильность полипептидных компонентов ядов в сочетании с их биологической активностью, селективностью и специфичностью действия позволяет рассматривать (и использовать) эти соединения в качестве уникальных инструментов в исследовании структуры и функции их молекулярных мишеней и моделей для разработки терапевтических препаратов [12].

На основании доступных данных о пространственной структуре и функциональной активности токсинов животных можно предположить наличие двух различных эволюционных механизмов, объясняющих их функциональное разнообразие [13]. Один из них – механизм дивергентной эволюции, широко распространенный среди ядовитых животных. Предполагается, что в рамках такого эволюционного механизма для развития нескольких различных функций используется древний консервативный мотив пространственной структуры (например, CS/-токсины скорпионов специфичны к разным ионным каналам) [14]. Другой механизм – направленная конвергентная эволюция токсинов у животных, принадлежащих к различным таксономическим группам, в результате которой полипептиды с разными молекулярными фолдами приобретают одинаковую функцию (как, например, нейротоксины актиний, скорпионов и змей, специфичные модуляторы K+каналов) [15–17].

Принято считать, что соединения белковой природы, обнаруженные в ядах животных, являются результатом эволюционного отбора [2], в процессе которого гены «обычных»

белков, участвующих, как правило, в ключевых регуляторных процессах, дуплицируются, и полученные при этом новые гены начинают селективно экспрессироваться в ядовитом аппарате животного. Во многих случаях происходит многократная дупликация (амплификация) генов, приводящая в сочетании с мутационным процессом к формированию мультигенных семейств и обширной функциональной дивергенции токсинов [18, 19].

Обычно кодируемые такими мультигенными семействами пептиды/полипептиды сохраняют молекулярную укладку (третичную структуру) полипептида, кодируемого анцестральным геном, однако функционально важные а.о. вне кора белковой глобулы заменяются и/или модифицируются для приобретения новых видов активности [19–21]. Некоторые авторы отмечают, что данные процессы могут приводить как к нео-, поли- и субфункциализации, так и деградации генов до нефункциональных копий (например, в результате делеций или мутаций нередко происходит потеря всякой функциональной активности зрелых полипептидов) или даже псевдогенов [20].

Экспрессия «токсических» мультигенных семейств часто приводит к тому, что в яд попадают не одна-две гомологичные молекулы, а десятки и даже сотни токсинов со сходной структурой. Совокупность таких соединений в яде животного принято называть природной комбинаторной библиотекой биологически активных полипептидов [7].

2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки Комбинаторные библиотеки формируются множеством высокогомологичных компонентов, имеющих зачастую различную специфичность и функциональную активность.

Такие библиотеки обнаружены в ядах змей, скорпионов, пауков, конусов и актиний [14, 19 22–27]. Отмечается, что, несмотря на структурные и функциональные различия компонентов, в полипептидных библиотеках реализуется лишь один тип молекулярной укладки [1, 18, 28–32].

2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла В ядах многих пауков, скорпионов и моллюсков семейства Conidae обнаружены библиотеки, насчитывающие десятки полипептидов с фолдом, описываемым структурным мотивом цистинового узла или ICK [33–38]. Особенность данной молекулярной укладки состоит в том, что одна из дисульфидных связей пронизывает кольцо, сформированное двумя другими и атомами основной цепи, образуя своеобразный молекулярный узел (рис. 1).

–  –  –

Полипептиды с такой молекулярной укладкой цепи называют также ноттинами (от англ. knot – узел). Подавляющее большинство ноттинов содержит 6 или 8 остатков цистеина, образующих 3 или 4 дисульфидных мостика, соответственно, стабилизирующих молекулу [7, 29]. Несмотря на то, что мотив ICK является общей структурной особенностью соединений данной группы, длина N- и C-концевых участков, а также некоторых петель между остатками цистеина может значительно варьировать даже для ноттинов яда, полученного от представителей одного вида. Согласно данным базы полипептидов ноттинового типа, в настоящее время известно более 2000 ICK-полипептидов (http://knottin.cbs.cnrs.fr/). Большинство представителей ноттиновых библиотек является нейротоксинами, специфически модулирующими K+-, Na+-, Ca2+- и Cl–-каналы. Однако известны ноттины, выполняющие функции ингибиторов протеиназ, антимикробных, инсектицидных и антигельминтных агентов, гуморальных регуляторов [7, 29, 40].

2.3.2. Трехпетлевые токсины змей Комбинаторные библиотеки так называемых трехпетлевых токсинов найдены в ядах змей семейств Elapidae и Hydrophidae [19, 20, 41–45]. Пространственная структура этих полипептидов характеризуется наличием трех -структурированных петель (I, II и III) и восьми консервативных остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи, которые стабилизируют уникальный фолд (рис. 2). Такая молекулярная укладка напоминает ладонь с тремя пальцами, поэтому в англоязычной литературе соединения данного структурного типа принято называть «трехпальцевыми» токсинами (three-finger toxins, TFT или 3FTX).

–  –  –

По длине полипептидной цепи TFT делят на короткие (60–62 а.о.) и длинные (66–75 а.о.). Известны полипептиды данной группы, имеющие дополнительный дисульфидный мостик на петле I либо II и/или удлиненный N-концевой участок, например, -бунгаротоксин (PDB ID 1KBA [47]) и кандоксин (PDB ID 1JGK). Интересной особенностью некоторых трехпетлевых токсинов является их способность образовывать ковалентные и нековалентные гомо- и гетеродимеры [41, 44]. Несмотря на все перечисленные структурные различия полипептидов данного типа, критическим образом влияющие как на аффинность, так и на специфичность их связывания с молекулярными мишенями, в целом структурный мотив 3FTX значительно консервативнее мотива ICK.

Трехпетлевые токсины проявляют удивительно разнообразную биологическую активность. В настоящее время наиболее полно охарактеризованы 3FTX, являющиеся нейротоксинами, которые высокоспецифично взаимодействуют с мышечными (-токсины) и нейрональными (-токсины) никотиновыми, а также мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами. Известны также трехпетлевые токсины, выполняющие функцию ингибиторов ацетилхолинэстеразы, ингибиторов процессов клеточной адгезии, блокаторов кальциевых каналов L-типа, блокаторов 1- и 2-адренорецепторов, а также пороформирующих кардиотоксинов и цитотоксинов, обладающих широким спектром биологической активности. Функции 3FTX, принадлежащих довольно большой и быстро растущей группе так называемых «токсинов-сирот» (orphan toxins), пока не установлены [20, 44].

2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным /-мотивом Согласно современным данным, наиболее обширной и подробно охарактеризованной группой токсинов из яда скорпионов являются полипептиды с цистеин-стабилизированным /-мотивом (CS/). Эти токсины составляют более 60 % всех токсических пептидных компонентов, обнаруженных в ядах исследованных скорпионов семейств Buthidae, Scorpionidae, Liochelidae, Caraboctonidae и Chactidae [48].

Данный мотив представляет собой -спираль, связанную дисульфидными мостиками с антипараллельным -листом [49]. Токсические полипептиды, несущие CS/-мотив, имеют, подобно ICK-токсинам, весьма серьезные структурные различия в длине N- и C-концевых участков, а также петель, соединяющих фрагменты упорядоченной структуры. В связи с этим, токсины данной группы принято делить на короткие (менее 45 а.о. – рис. 3, А) и длинные (55 а.о. и более – рис. 3, Б) [50].

–  –  –

Данные структурные различия сказываются на функциях, выполняемых CS/токсинами в организме жертвы. Большинство представителей данного структурного типа соединений является мощными нейротоксинами, способными модулировать и блокировать ионные K+-, Na+-, Cl–-каналы. Однако известны CS/-полипептиды яда скорпионов, участвующие в липолизе и оказывающие антимикробное действие [50], подобное действию дефензинов растений и насекомых, имеющих также цистеин-стабилизированный /-мотив [49, 53].

2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных Широкий спектр биологической активности, селективность и специфичность взаимодействия с молекулярными мишенями позволяет рассматривать полипептиды ядов различных организмов как перспективные модели для создания на их основе препаратов направленного действия, что привлекает к ним интерес фармацевтических компаний.

Изобилие гомологичных компонентов, представленных целыми библиотеками, значительно упрощает процесс установления и оптимизации структуры фармакофора при разработке препаратов, действие которых направлено на конкретные молекулярные мишени.

Существует множество примеров успешного применения белковых компонентов ядов в качестве инструментов исследования механизмов функционирования биомолекулярных систем, изучения различных терапевтических мишеней, а также в качестве лекарственных средств. Так, например, -бунгаротоксин из яда змеи Bungarus multicinctus уже в течение пятидесяти лет используют в качестве инструмента исследования ацетилхолиновых рецепторов [45]. Синтетический аналог -конотоксина MVIIA из моллюска Conus magus, блокатор потенциалзависимых Ca2+-каналов, используют под коммерческим названием «Приалт» (Зиконотид) в качестве анальгетика при терапии состояний хронической боли, церебральной ишемии и черепно-мозговой травмы [54]. В настоящее время проводятся работы по конструированию и испытанию терапевтических препаратов на основе CS/токсинов скорпионов, способных помочь в лечении астмы, сердечно-сосудистых заболеваний, СПИДа (чарибдотоксин, сциллатоксин), аутоиммунных заболеваний (мокатоксин-1), малярии (MeuTXK1) [55, 56].

2.4. Полипептиды Кунитц-типа Полипептиды семейства Кунитца (Кунитц-типа) – широко распространенная группа соединений, обнаруженных в животных самого разнообразного систематического положения (ленточные и кольчатые черви, кишечнополостные, брюхоногие и головоногие моллюски, скорпионы, клещи, пауки, перепончатокрылые, амфибии, рептилии, млекопитающие) [57, 58]. Представители данного семейства характеризуются укладкой полипептидной цепи, идентичной фолду бычьего панкреатического ингибитора трипсина (БПТИ, апротинин).

Структурный мотив полипептидов Кунитц-типа является одним из наиболее консервативных среди структурных мотивов компонентов белковой природы, продуцируемых ядовитыми организмами.

2.4.1. Структура Для полипептидов структурного семейства Кунитц/БПТИ характерна длина цепи в 50– 70 а.о. и наличие шести остатков цистеина, образующих 3 дисульфидных мостика.

Топология расположения дисульфидных связей (С1–С6, С2–С4, С3–С5) и длина петель между остатками цистеина (XnC1X8C2X15C3X7C4X12C5X3C6Xn)1 одинакова у подавляющего числа представителей этого семейства и является их уникальной структурной особенностью.

Наиболее полно охарактеризованный представитель данного семейства, БПТИ, способен в пикомолярных концентрациях ингибировать сериновые протеиназы, такие как трипсин, химотрипсин и калликреин [58]. Молекула БПТИ (6518 Да) состоит из 58 а.о. и стабилизирована тремя дисульфидными связями, обеспечивающими компактную и чрезвычайно стабильную третичную структуру (рис. 4).

–  –  –

В настоящее время появляется все больше сообщений о полипептидах, имеющих молекулярную укладку БПТИ, первичная структура которых не удовлетворяет приведенным формулам. Подробнее такие соединения описаны в разделе 2.4.3.

Основной особенностью Кунитц-фолда является изогнутый и скрученный вокруг своей оси на 180° -лист, сформированный двумя антипараллельными -стрендами, 1 (17–25 а.о.) и 2 (29–36 а.о.) (рис. 4). С одной стороны он обрамлен -изгибом (а.о. 25–29), а с другой – дисульфидным мостиком (Cys14–Cys38). Участки полипептидной цепи 1–14 и 38–56 а.о.

ковалентно связаны дисульфидной связью (Cys5–Cys55) и расположены таким образом, что остатки Arg1 и Ala58 приближены друг к другу. Еще один дисульфидный мостик стабилизирует область -изгиба (Cys30–Cys51). N-концевой участок цепи представляет собой короткую 310-спираль, а C-концевой – структурирован в более длинную и регулярную

-спираль (а.о. 48–56) [60].

Характер фолда и положение трех дисульфидных мостиков обеспечивают компактность и чрезвычайную стабильность молекулы, в которой возможность конформационных изменений ограничена лишь небольшими продольными перестройками участков главной цепи в областях 4–14 и 38–48 а.о. Такие изменения могут быть вызваны удлинением или укорочением N- и C-концевых спиралей и/или скручиванием -листа [60].

2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами Впервые высокоочищенный полипептид данного структурного семейства, БПТИ, был выделен Кунитцем и Нортропом в 1936 г. из бычьего панкреаса [61]. Полипептид проявляет чрезвычайно высокую ингибирующую активность в отношении трипсина и химотрипсина, а также является компетентным ингибитором плазмина, калликреина, тромбина и энтерокиназы [61–64]. Получение кристаллов апротинина (рис. 4) и его комплексов с трипсином (рис. 5) и химотрипсином и исследование их кристаллической структуры позволило не только установить молекулярную структуру и механизм комплексообразования, но и внести значительный вклад в понимание физических основ фермент-ингибиторных и белок-белковых взаимодействий [65–68].

Большинство обнаруженных почти за 80 лет полипептидов семейства Кунитца ингибирует сериновые протеиназы различной специфичности. Среди всех известных в настоящее время молекулярных мишеней полипептидов Кунитц-типа именно эти ферменты являются наиболее подробно исследованными, а механизм взаимодействия с ними – наиболее ясным. Установлено, что ингибиторы семейства Кунитца взаимодействуют с сериновыми протеиназами по стандартному субстратоподобному механизму и образуют устойчивые комплексы в стехиометрическом соотношении 1:1 (рис. 5) [58].

Рисунок 5. A – Схематичное изображение субстратоподобного механизма ингибирования сериновых протеиназ.

Серым цветом показан фермент, красная область – остатки активного центра. Зеленым цветом показан ингибитор, синяя область – связывающая петля, желтая – боковая цепь остатка в P1 положении. S1 – субцентр S1 активного центра фермента, P1–P1 – пептидная связь между остатками в положениях P1 и P1. Б – Ленточная диаграмма пространственной структуры комплекса БПТИ– трипсин (PDB ID 2PTC [59]). Трипсин показан серым цветом, БПТИ – зеленым, связывающая петля – синим, остатки активного центра трипсина – красным, остаток в положении P1 – желтым.

Визуализация выполнена с помощью программы DS Visualizer.

Стандартный (канонический) механизм ингибирования сериновых протеиназ полипептидами семейства Кунитца заключается в их нековалентном взаимодействии и образовании комплекса, подобного фермент-субстратному комплексу Михаэлиса. Ингибитор непосредственно блокирует активный сайт протеиназы, не претерпевая каких-либо конформационных изменений. Согласно данным рентгеноструктурного анализа [59], в комплексно связанном состоянии фермент и ингибитор формируют межмолекулярный антипараллельный -лист [58]. Кинетика связывания и сродство к ферменту значительно варьируют в ряду различных ингибиторов семейства Кунитца.

Фрагмент структуры, ответственный за ингибирование протеиназ, принято называть ингибиторной петлей связывания (L1 на рис. 4). Отмечается, что ее конформация универсальна и высоко консервативна для представителей разных структурных семейств ингибиторов сериновых протеиназ [69]. Петля, экспонированная в растворитель, имеет выпуклую форму и высоко комплементарна вогнутой области активного сайта фермента.

Кристаллографические исследования позволили установить, что на петле расположены Р3– P3 а.о. ингибитора, взаимодействующие с S3–S3 субцентрами связывания фермента1 [70–

1 Некоторые авторы относят к реактивному центру ингибитора также остаток P4 [76].

72]. Показано, что остатки, предшествующие и следующие за этим участком, также могут взаимодействовать с ферментом и вносить вклад в образование фермент-ингибиторного комплекса [62], однако в значительно меньшей степени. Реактивный сайт ингибитора (остатки Р3–P3) расположен на наиболее экспонированном участке связывающей петли [58].

Аналогично фермент-субстратному, взаимодействие между ферментом и ингибитором может быть представлено в упрощенной форме как реакция гидролиза/ресинтеза пептидной связи между а.о. в положениях Р1–P1 реактивного сайта [58]. На самом деле конформационная стабильность петли связывания является решающим фактором, препятствующим протеолитическому расщеплению ингибитора. Установлено, что Nконцевая часть петли связывания (Р) энергетически более значима для связывания с ферментом, чем C-концевая (Р) [73]. Молекулярное распознавание активного центра фермента обеспечивается, главным образом, Р1 и следующими за ним остатками (P1, P2, P3), которые имеют жесткую конформацию за счет стабилизирующего влияния дисульфидного мостика и начального фрагмента -листа [60].

Остаток в положении Р1 [74] является основной молекулярной детерминантой, определяющей специфичность распознавания активного центра протеиназы, а также энергетические параметры образуемого комплекса [75, 76]. В процессе образования комплекса фермент-ингибитор боковая цепь а.о. в положении Р1 глубоко проникает в субцентр S1 активного центра (S) фермента, образуя многочисленные межмолекулярные контакты и внося наибольший вклад в комплексообразование за счет гидрофобных и полярных взаимодействий [77]. В случае ингибиторов трипсина в положении P1 реактивного сайта обычно располагаются остатки основных аминокислот, Arg или Lys [78]. Так, в реактивном центре молекулы БПТИ расположен положительно заряженный остаток Lys (рис. 4, 5), который взаимодействует с активным центром трипсина (S1) с образованием прочного комплекса (Ki = 6 10-14 М). Изучение комплексов мутантов БПТИ по положению Р1 с трипсином показало, что замена Lys15 на любой остаток (кроме Arg) приводит к падению аффинности минимум на 6 порядков [64, 76]. С другой стороны, замены Lys15Leu, Lys15Phe, Lys15Tyr и Lys15Trp повышают сродство полипептида к химотрипсину, а замены Lys15Val, Lys15Thr и Lys15Ile – к эластазе нейтрофилов человека [75].

Остаток в положении P1 также вносит большой вклад в энергию ассоциации ингибитора с ферментом. Показано, что для БПТИ-подобных полипептидов характерно наличие Ala (реже Gly) в этом положении (рис. 4). Для полипептидов Кунитц-типа, не обладающих способностью ингибировать ферменты (например, дендротоксинов из ядов змей [79]), напротив, наблюдается высокая вариабельность а.о. в положении P1 [58]. Вполне вероятно, что присутствие в этом положении остатков с более объемной боковой цепью является ключевой структурной особенностью дендротоксинов, которая препятствует образованию прочного комплекса и обусловливает отсутствие у них ингибирующей активности в отношении сериновых протеиназ [80, 81].

В связывании с протеиназами участвуют не только а.о. связывающей петли ингибитора L1 (остатки 13–18)1, но и так называемого сайта слабых взаимодействий (остатки 34–39) петли L2 (рис. 4), дополнительно стабилизирующие данный комплекс. Таким образом, поверхность контакта формируют 1017 остатков ингибитора и 1729 остатков протеиназы, которые образуют многочисленные водородные связи и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия [58]. Для ингибиторов Кунитц-типа характерно также наличие высоко консервативного а.о.

Phe в положении P18, играющего важную роль в стабилизации структуры ингибиторной петли ввиду наличия в ней внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий а.о. [82].

2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие Несмотря на высокую консервативность фолда, многие полипептиды Кунитц-типа имеют уникальные структурные особенности, определяющие их специфическую функциональную активность. Исследованию взаимосвязи структуры и функции полипептидов этого семейства посвящено огромное количество статей и обзоров, а также диссертационных работ [57, 58, 83–86]. В настоящем обзоре внимание сконцентрировано, главным образом, на полипептидах Кунитц-типа, обнаруженных в ядах различных животных.

2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа Согласно системе классификации базы данных MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk) [87], полипептиды Кунитц-типа, ингибирующие протеолитические ферменты, относятся к семейству I2 клана IB ингибиторов протеиназ. Интересно, что некоторые представители этого семейства являются доменами больших белков, таких, например, как предшественник

-амилоидного белка Альцгеймера (APPI) [88] и -амилоид-подобного белка 2 (APLP2) [89].

Кроме того, известны представители этого семейства, имеющие мультидоменную структуру.

Так, плацентарный протеогликан бикунин содержит два последовательно соединенных Кунитц-домена (рис. 6) [90], ингибитор тканевого фактора свертывания крови человека (TFPI-2) [91] – три, а ингибитор протеиназ Ac-KPI-1 из нематоды Ancylostoma caninum включает двенадцать таких доменов [92]. Установлено, что практически все домены перечисленных белков способны ингибировать сериновые протеиназы.

1 Нумерация остатков соответствует аминокислотной последовательности БПТИ.

–  –  –

2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей Как упоминалось выше, семейство Кунитца включает в себя не только ингибиторы сериновых протеиназ. Так, например, полипептиды Кунитц-типа из яда змей функционально представлены как ингибиторами протеиназ, так и нейротоксинами, высокоспецифично блокирующими и модулирующими потенциалзависимые ионные каналы [93].

Впервые гомологи БПТИ змей (дендротоксины, DTXs) были выделены из яда черной мамбы Dendroaspis polylepis polylepis более 40 лет назад [79]. Аминокислотные последовательности этих токсинов содержат 57–60 а.о., стабилизированных тремя дисульфидными мостиками (рис. 7).

Несмотря на высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей (до 98 %), различные дендротоксины из яда змей рода Dendroaspis (-DTX, DTX I и DTX K) способны либо высокоспецифично блокировать потенциалзависимые Kv1.х каналы, либо ингибировать сериновые протеиназы (DTX E и DTX B) [30, 57]. Исключение составляют полифункциональные токсины DTX K и -DTXs, блокирующие Kv1.1 каналы и сериновые протеиназы. По-видимому, они являются промежуточным звеном в молекулярной эволюции полипептидов данной группы [94]. Показано, что за связывание с сериновыми протеиназами и потенциалзависимыми каналами отвечают разные участки полипептидных цепей (петля L1, C-концевой участок и а.о. 1-стренда соответственно, рис. 4, 7), что указывает на разные точки приложения адаптивной эволюции к последовательности полипептидов Кунитц-типа змей [30].

Полипептид Кунитц-типа из D. angusticeps, кальциклудин (CaC), состоящий из 60 а.о., не проявляет ингибирующей активности в отношении протеиназ и не модулирует K+- Na+-каналы.

потенциалзависимые и Однако CaC способен в наномолярных концентрациях специфически блокировать Ca2+-каналы L-типа [95]. На данный момент кальциклудин является единственным блокатором кальциевых каналов, имеющим Кунитцфолд.

Рисунок 7. – Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа змей и БПТИ:

-DTX, CaC, -Dtx1, -Dtx2, -DTX из D. angusticeps; DTX I, DTX K, DTX E, DTX B из D. polylepis polylepis; NnaTi, NnaChi из Naja naja; NniTi из N. nivea; NACI из N.

atra; VamTi, VamChi из Vipera ammodytes; EmaTi из Eristocophis macmahonii; PIVL из Macrovipera lebetina transmediterranea; Oh11-1, OH-TCI из Ophiophagus hannah; BF9, Bungaruskunin из Bungarus fasciatus; PILP-1 из B. multicinctus; RVV-II, BBPTI-1, СBPTI-1, СBPTI-2, СBPTI-3 из Daboia siamensis;

HhaTi из Hemachatus haemachatus; TSPI из Oxyuranus scutellatus scutellatus; Txln-1, Txln-2 из Pseudonaja textilis textilis; Pr-mulgin 1, Pr-mulgin 2, Pr-mulgin 3 из Pseudechis australis; BPTI из Bos taurus. Наиболее консервативные а.о. выделены оттенками серого, остатки Cys – желтым цветом, топология дисульфидных связей показана жирными линиями. Красной рамкой выделен реактивный сайт взаимодействия с протеиназами, зеленой – сайт слабых взаимодействий. Остатки, функционально важные для взаимодействия с Kv каналами, подчеркнуты.

-Бунгаротоксин (-BuTx), обнаруженный в яде B. multicinctus, имеет уникальную структуру, включающую две абсолютно разные полипептидные цепи, связанные дисульфидным мостиком. Цепь А (~14 кДа) формирует фосфолипаза-А2-подобный домен (PLA2), в то время как цепь Б (~7 кДа) имеет пространственную укладку, характерную для полипептидов структурного семейства Кунитца [96] (рис. 8). Показано, что, подобно большинству дендротоксинов, цепь Б -бунгаротоксина не способна ингибировать протеиназы, но блокирует потенциалзависимые K+-каналы.

–  –  –

Согласно литературным данным, некоторые полипептиды Кунитц-типа яда Hemachatus haemachatus содержат лишь два дисульфидных мостика, например, NNV inhibitor Ia [98]. Повидимому, это первый обнаруженный в яде змей представитель полипептидов семейства Кунитца, имеющий лишь 4 а.о. цистеина.

2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков Впервые о токсинах Кунитц-типа, продуцируемых пауками, стало известно в 2008 году благодаря работе китайских исследователей [99, 100]. В генетическом материале пауков Ornithoctonus huwena и O. hainana было обнаружено суперсемейство генов, кодирующих 46 высокогомологичых полипептидов Кунитц-типа, которые образуют комбинаторную библиотеку (хувентокины и хайнантоксины) (рис. 9). Полипептиды состоят из 59 а.о. и имеют уникальную структуру участок между вторым и третьим остатками цистеина укорочен на 2 аминокислотных остатка.

Анализ аминокислотных последовательностей токсинов данного суперсемейства позволил выделить две группы, представители которых различаются количеством дисульфидных мостиков. Токсины первой группы имеют 6 остатков цистеина, образующих, подобно каноническим полипептидам Кунитц-типа, три дисульфидные связи (рис. 9, А). В составе большинства токсинов второй группы в результате замены Cys34Tyr имеется лишь 5 остатков цистеина. До сих пор не установлено, как потеря Cys34 может сказываться на биологической активности данных токсинов; в настоящее время их принято относить к отдельному подсемейству полипептидов семейства Кунитца [99].

Недавно впервые был получен рекомбинантный ингибитор сериновых протеиназ Кунитц-типа AvKTI паука Araneus ventricosus, который состоит из 57 а.о. и, подобно БПТИ, имеет 6 остатков цистеина, образующих 3 дисульфидных мостика (рис. 9, А). Степень идентичности аминокислотной последовательности AvKTI с последовательностями хувен- и хайнантоксинов составляет лишь 40–50 %. Показано, что AvKTI способен в наномолярных концентрациях ингибировать трипсин, химотрипсин, плазмин и эластазу нейтрофилов [101].

Однако его активность по отношению к потенциалзависимым каналам пока не исследована.

–  –  –



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |


Похожие работы:

«Слюта Евгений Николаевич Особенности гравитационной деформации малых тел Солнечной системы в зависимости от их химического и минерального состава 25.00.09 – геохимия, геохимические методы поисков полезных ископаемых диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 004.002.01 на базе ФГБУН Института высокотемпературной электрохимии УрО РАН ПО ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НАУК. аттестационное дело № _ Решение диссертационного совета от 24 декабря 2014 г., № 11 о присуждении Зарубину Ивану Владимировичу, гражданину РФ, ученой степени кандидата химических наук. Диссертация «Гидрохимический синтез, состав, структура, функциональные свойства пленок PbS, Cu2S, PbSe, Te для контроля водных сред» в виде...»

«ЛЮБОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА НОВЫЕ ФТОРСОДЕРЖАЩИЕ АЛКОКСИСИЛАНЫ И МАТЕРИАЛЫ НА ИХ ОСНОВЕ. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА 02.00.08 – химия элементоорганических соединений 02.00.06 – высокомолекулярные соединения (химические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научные руководители: доктор химических наук Семенов Владимир...»

«Волкова Татьяна Сергеевна ИММОБИЛИЗАЦИЯ ОТРАБОТАННЫХ ВАКУУМНЫХ МАСЕЛ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ РАДИОНУКЛИДАМИ Специальность: 02.00.14 – радиохимия; 05.17.02 – технология редких, рассеянных и радиоактивных элементов ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«ВЕРЕЩАГИНА Татьяна Александровна МИКРОСФЕРИЧЕСКИЕ СОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ ЦЕНОСФЕР ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЖИДКИХ РАДИОАКТИВНЫХ ОТХОДОВ В МИНЕРАЛОПОДОБНОЙ ФОРМЕ 05.17.01 технология неорганических веществ Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук Научный консультант: Аншиц Александр Георгиевич, доктор химических наук, профессор...»

«ГАНЮШКИН Дмитрий Анатольевич Гляциогенные комплексы резкоконтинентального района северозапада Внутренней Азии 25.00.23 — Физическая география и биогеография, география почв и геохимия ландшафтов Диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Научный консультант доктор географических наук, профессор Чистяков К.В. Санкт-Петербург Оглавление Введение. Актуальность темы Территория и объекты исследования Цель и...»

«ИВАНОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПЕРЕМЕШИВАЮЩЕГО ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ САНИТАРНОГИГИЕНИЧЕСКИХ ИЗДЕЛИЙ 05.21.03 – Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины Диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук Научный руководитель д.т.н., проф....»

«Пашкевич Елена Борисовна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ И БИОПРЕПАРАТОВ ПРИ ОПТИМИЗАЦИИ ПИТАНИЯ РОЗ В УСЛОВИЯХ ЗАЩИЩЕННОГО ГРУНТА Специальность 06.01.04 – агрохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Надежда Владимировна Верховцева Москва – 2014 Содержание: Cтр. Введение.....»

«ВОРОНКОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА СВЕКЛОВИЧНЫЕ ПИЩЕВЫЕ ВОЛОКНА ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА В ТЕХНОЛОГИИ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 05.18.04 – Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств Научный...»

«Бабицкий Николай Александрович Синтез и исследование свойств боратов, фосфатов и борофосфатов висмута (III) 02.00.01 неорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель д-р хим. наук Жереб Владимир Павлович Красноярск 2014 Оглавление Введение Глава 1. Литературная часть 1.1 Фазовые...»

«Доронин Игорь Игоревич Противоопухолевые эффекты модифицированных фрагментов GD2-специфичных антител Специальность 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., Холоденко Р.В. Москва 2015 Оглавление Введение 1. Обзор...»

«Щербаков Юрий Дмитриевич УДК (550.4+552.11):552.333(571.66) ГЕОХИМИЯ И ПЕТРОЛОГИЯ ЩЕЛОЧНО-БАЗАЛЬТ-ТРАХИТКОМЕНДИТОВОЙ СЕРИИ СРЕДИННОГО ХРЕБТА КАМЧАТКИ Специальность 25.00.09 геохимия, геохимические методы поисков полезных ископаемых Диссертация на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Научный руководитель...»

«Москаленский Александр Ефимович ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТРОМБОЦИТОВ В НАТИВНОМ И АКТИВИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ, А ТАКЖЕ ИХ АГРЕГАТОВ, С ПОМОЩЬЮ СКАНИРУЮЩЕЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Специальность 03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. Научный руководитель:...»

«ФЕДОРОВА Марина Анатольевна ИСТОЧНИКИ И ПУТИ СНИЖЕНИЯ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ПОГРЕШНОСТЕЙ ПРИ ОЦЕНКЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ МЕТОДАМИ ИК-СПЕКТРОМЕТРИИ 02.00.02 – Аналитическая химия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук ОМСК – 2015 Посвящаю моей дочери, Федоровой Злате Оглавление Введение Глава 1. Методы определения...»

«ХУДЯКОВА ГАЛИНА ИВАНОВНА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРМОХИМИЧЕСКОЙ КОНВЕРСИИ КОКСОВОГО ОСТАТКА УГЛЯ МЕТОДОМ ТЕРМОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Специальность: 01.04.14 – Теплофизика и теоретическая теплотехника ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Рыжков А.Ф. Екатеринбург – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 1...»

«НВЕ ШВАН У СОРБЦИОННОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ВАНАДИЯ (V) ИЗ РАЗБАВЛЕННЫХ РАСТВОРОВ 05.17.02 – технология редких, рассеянных и радиоактивных элементов Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель – доктор технических наук, профессор Трошкина Ирина Дмитриевна Москва – 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Поведение рения в водных растворах 1.2. Сорбционное...»

«Суханова Татьяна Владимировна ВКЛЮЧЕНИЕ ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА В БИОСОВМЕСТИМЫЕ НОСИТЕЛИ 03.01.06 – биотехнология (в т.ч. бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.х.н. Марквичева Е.А. Москва 201 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. Биологически активные пептиды. 1.1 1.2....»

«Ржевская Александра Вячеславовна ТВЕРДОТЕЛЬНЫЕ АНИОНСЕЛЕКТИВНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ НА ОСНОВЕ ИОННЫХ ЖИДКОСТЕЙ Специальность 02.00.02 – АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: к.х.н., доц. Шведене Н.В. Москва 2015 Содержание Список сокращений Введение Глава 1. Литературный обзор 9 1.1. Свойства и применение ионных жидкостей 9 1.1.1. Физические и химические...»

«Гусев Алексей Николаевич КООРДИНАЦИОННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ФУНКЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПИРИДИЛТРИАЗОЛОВ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ, ОПТИЧЕСКИЕ И МАГНИТНЫЕ СВОЙСТВА Специальность 02.00.01 неорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук Научный консультант доктор химических наук, профессор В.Ф. Шульгин Симферополь, 20...»

«Булавина Екатерина Владимировна ЭЛЕКТРОВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРАТ-ИОНОВ НА МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ КОМПОЗИТНЫХ ЭЛЕКТРОДАХ С ИОНООБМЕННОЙ/УГЛЕРОДНОЙ ОСНОВОЙ Специальность 02.00.05 – электрохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Кравченко Т.А. Воронеж – 2015...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.