WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОМБИНИРОВАННОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ИШЕМИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ С ГЕНАМИ VEGF165 И HGF ЧЕЛОВЕКА ...»

-- [ Страница 1 ] --

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ

НАУЧНО–ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС

На правах рукописи

Макаревич Павел Игоревич

РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОМБИНИРОВАННОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ИШЕМИЧЕСКИХ



ЗАБОЛЕВАНИЙ C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ С ГЕНАМИ

VEGF165 И HGF ЧЕЛОВЕКА 14.01.05 – Кардиология 03.01.04 – Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Е. В. Парфёнова Москва, 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Клиническая значимость разработок в области терапевтического ангиогенеза и актуальность задач

1.2 Механизмы васкуляризации в постнатальном периоде

1.2.1 Ангиогенез: механизмы и роль факторов, индуцируемых гипоксией (HIF) в его активации

1.2.2 Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления

1.2.3 Васкулогенез в постнатальном периоде

1.2.4. Роль АФР как ключевых регуляторов ангиогенеза, артериогенеза и васкулогенеза.. 22

1.3 Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и их роль в ангиогенезе

1.3.1 VEGF: краткая характеристика семейства факторов роста

1.3.2 Рецепторы VEGF и механизмы влияния VEGF на рост сосудов

1.3.3 Функциональная характеристика изоформ VEGF-A и их участие в ангиогенезе........ 24

1.4 Фактор роста гепатоцитов как плеотропный АФР и его биологическая активность25 1.4.1 Структура и механизмы активации HGF

1.4.2 Рецептор с-met и его тирозинкиназная активность

1.4.3 Роль РGF в развитии и его участие в постнатальной васкуляризации и регенерации. 27

1.5 Взаимодействие между VEGF165 и HGF в регуляции ангиогенеза

1.6 Клиническая и прогностическая значимость уровня VEGF165 и HGF при ишемических заболеваниях

1.6.1 Клиническая и прогностическая значимость VEGF165 в патогенезе ишемических заболеваний

1.6.2 Изменения содержания HGF при сердечно-сосудистых заболеваниях

1.7 Терапевтический ангиогенез: развитие направления и генная терапия

1.7.1 Клинические исследования генной терапии VEGF165 при КИНК и ИМ

1.7.2 Клинические исследования генной терапии HGF при КИНК

1.7.3 Клинические исследования генной терапии с помощью FGF

1.8 Факторы, определяющие эффективность генной терапии и возможности усовершенствования существующих методов

1.8.1 Выбор вектора для генной терапии: баланс эффективности и безопасности............... 38 1.8.2 Выбор способа доставки вектора в ишемизированную ткань

1.8.3 Дозировка и продолжительность лечения

1.8.4 Использование комбинированной генной терапии для стимуляции ангиогенеза........ 43

1.9 Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Группа больных ИБС с постинфарктной ХСН и контрольная группа здоровых добровольцев

2.2 Молекулярные и биохимические методы

2.3 Цитологические методы

2.4 Эксперименты на животных

2.5 Гистологические методы и опыты ex vivo

2.6 Микроскопические методики

2.7 Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты

3.1 Исследование содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови и определение их значимости как биомаркеров тяжести течения и развития постинфарктной ХСН........ 62 3.1.2 Оценка содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови больных ИБС

3.1.3 Корреляционный анализ содержания VEGF165 и HGF и уровня маркеров тяжести ХСН в сыворотке крови больных ИБС

3.1.4 Регрессионный анализ показателей содержания VEGF165 и HGF и выявление пороговых значений, ассоциированных с ИБС

3.2 Конструирование и оценка экспрессионной активности плазмид с генами человеческих VEGF165 и HGF in vitro

3.2.1 Конструирование плазмид с генами VEGF165 и HGF и амплификация пДНК в бактериях E. Coli

3.2.2 Определение содержания бактериального эндотоксина в плазмидной ДНК............... 71 3.2.3 Продукция VEGF165 и HGF трансфицированными клетками HEK293T





3.2.4 Оценка функциональных свойств секретируемых VEGF165 и HGF на культуре клеток HUVEC

3.3. Отработка плазмидной трансфекции in vivo и оценка продукции человеческих VEGF165 и HGF в ткани экспериментальных животных

3.3.1 Оценка эффективности трансфекции скелетной мышцы мыши in vivo при использовании чрескожной электропорации

3.3.2 Оценка продукции VEGF165 и HGF человека в скелетной мышце мыши и миокарде крысы с помощью эксплантной культуры

3.3.3 Определение содержания VEGF и HGF человека в гомогенатах скелетной мышцы мыши и миокарда крысы после введения плазмид

3.4 Оценка ангиогенной эффективности плазмид с генами VEGF165 и HGF на мышиной модели ишемии задней конечности

3.4.1 Динамика восстановления кровотока в ишемизированной задней конечности мыши после введения плазмид с генами VEGF165, HGF или их комбинации

3.4.2 Гистологический анализ образцов ишемизированных скелетных мышц после введения плазмид с генами VEGF165, HGF или их комбинации

3.5 Оценка ангиогенных свойств плазмид с генами VEGF165 и HGF при введении в ишемизированный миокард крысы

3.5.1 Влияние введения плазмид с генами VEGF165 и HGF на размер ИМ и площадь постинфарктного фиброза

3.5.2 Оценка плотности сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами VEGF165, HGF или их комбинации

3.5.3 Гистологическая оценка моноцитарной инфильтрации периинфарктной зоны миокарда после введения плазмид с генами VEGF165 и HGF

3.6 Изучение молекулярных механизмов действия комбинации VEGF165 и HGF на ангио- и артериогенез

3.6.1 Анализ активации МАР-киназных сигнальных молекул при стимуляции эндотелия VEGF165, HGF или их комбинацией

3.6.2 Влияние VEGF165 и HGF на продукцию эндотелием МСР-1 и интерлейкина-8........ 93 3.6.3 Оценка активации транскрипции генов MCP-1 и IL-8 в культурах HUVEC и TIME после стимуляции VEGF165 и HGF

3.6.4 Анализ активности регуляторного каскада NFB методом иммуноблоттинга............ 96 3.6.5 Оценка активности транскрипционных факторов HIF и промотора гена IL-8 с помощью плазмид с генами люцифераз

Глава 4. Обсуждение результатов исследования

Заключение

Выводы

Список сокращений и обозначений

Список литературы

–  –  –

Актуальность темы исследования Одной из ведущих медико-социальных проблем развитых стран являются ишемические заболевания: ишемическая болезнь сердца (ИБС) и инфаркт миокарда (ИМ), ишемия нижних конечностей, в том числе критичеcкая (КИНК), а также острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) [60].

Несмотря на значительный прогресс в развитии медикаментозных, эндоваскулярных и хирургических методов лечения, заболеваемость и смертность от ишемической патологии остается высокой [25; 131; 262]. Отчасти это обусловлено отсутствием в арсенале современной медицины эффективных средств, стимулирующих рост новых сосудов в ишемизированных тканях.

Среди разработанных в последние годы способов решения этой проблемы наиболее перспективным является терапевтический ангиогенез и, в частности, генная терапия с использованием кДНК ангиогенных факторов роста (АФР) [91].

Данный метод, основанный на стимуляции естественных процессов роста сосудов, представляет собой доставку в пораженные ткани дополнительных копий гена белка [261], который, будучи наработанным экспрессионным и синтетическим аппаратом клетки, секретируется ей и стимулирует рост новых сосудов, что приводит к восстановлению кровоснабжения ткани [99; 228].

Начиная с первой работы д-ра Джеффри Иснера [242], наиболее часто для терапевтического ангиогенеза использовали плазмиды – мобильные генетические элементы в виде кольцевой молекулы ДНК. Плазмиды способны трансфицировать ткани млекопитающих, включая человека; они безопасны с позиций мутагенеза и интеграции в геном, могут вводиться в ткань многократно и вызывают транзиторную (до 10-14 дней) продукцию белка. Именно плазмидные конструкции с генами АФР в настоящее время широко используются в клинических испытаниях по терапевтическому ангиогенезу [195] и наиболее полно охарактеризованы в исследованиях у пациентов с ишемическими заболеваниями [91; 99; 103].

Плазмидные векторы с генами различных ангиогенных белков (VEGF, HGF, PDGF-BB, FGF, ангиопоэтина-1, uPA и др.) показали эффективность и безопасность на моделях ишемии конечностей и миокарда у животных [139; 152; 250; 269], а также в открытых исследования и клинических испытаниях I-II фаз [20; 43; 76; 83; 89; 149; 170; 199; 223; 375]. Значительная часть клинических работ была посвящена использованию основного регулятора ангиогенеза - VEGF и его изоформ (VEGF165 и VEGF121) [83]. Также активно испытывались в клинике плазмидные конструкции с генами HGF [226] и белков из семейства FGF [87].

Однако плацебо-контролируемые исследования с двойным слепым контролем, подтвердившие безопасность метода, не показали достаточной эффективности генной терапии c использованием гена одного фактора роста [53; 87; 91; 120; 149; 225; 375]. Мета-анализы проведенных контролируемых клинических исследований генной терапии также не выявили достаточной эффективности используемых протоколов. У больных с ишемическими заболевания не было получено убедительных данных об уменьшении тяжести течения заболевания или улучшении прогноза [2; 53; 375]. Одной из причин таких результатов может являться наличие у них коморбидных патологий: сахарного диабета 2 типа, дис- и гиперлипидемий и других метаболических расстройств, приводящих к снижению эффективности ангиогенной терапии. Также считается, что для стимуляции такого сложного и многоступенчатого процесса, как ангиогенез, в регуляции которого участвует спектр факторов с взаимно дополняющими эффектами [68; 205], увеличения продукции в тканях только одного из них недостаточно [23; 91; 150]. Это обосновывает актуальность разработки новых комбинированных подходов к терапевтическому ангиогенезу с использованием имеющихся в арсенале безопасных методов доставки [30].

При решении этой задачи на первый план выходит выбор физиологически релевантных комбинаций генов для доставки. Для этого возможно использование оценки содержания АФР в крови больных с ишемическими заболеваниями. Этот подход основан на том, что повышение уровня АФР сопровождает ишемическую патологию и считается компенсаторной реакцией организма на снижение перфузии и повреждение тканей, а также на коморбидные метаболические изменения и сдвиги гомеостаза, вызыванные заболеванием [132; 156; 174; 284].

Поддержание этой реакции путем локальной доставки генов АФР может оказывать благоприятное влияние на трофику и функциональную сохранность ткани, страдающей от острой или хронической ишемии.

Принято считать, что комбинированные подходы в генной терапии для ангиогенеза базируются на аддитивном или потенцирующем действии АФР на клетки, задействованные в формировании новых кровеносных сосудов. К ним относятся ЭК, ГМК, перициты, резидентные стволовые клетки, циркулирующие мононуклеарные клетки костного мозга, ЭПК и др. Среди перечисленного спектра ключевую роль играют клетки эндотелия, поэтому усиленное действие комбинации АФР на эндотелиоциты считается одним из наиболее важных механизмов повышения терапевтической эффективности.

При разработке комбинированных методов терапевтического ангиогенеза также следует учитывать и плеотропизм эффектов АФР, так как они касаются процессов, сопровождающих и поддерживающих ангиогенез. Прежде всего это касается воспаления, и, в частности, аккумуляции моноцитов/макрофагов, играющих ключевую роль в формировании коллатеральных сосудов и их ремоделировании [354; 420].

Известно, что многие АФР (VEGF165, bFGF, HGF, TGF-) могут выступать в роли положительных или отрицательных регуляторов воспалительных процессов [165; 338]. С учетом роли воспалительных цитокинов и клеток в регенерации и ангиогенезе встает проблема не только выбора белков для комбинированной доставки в ткани, но и изучения возможных механизмов их совместного влияния на эти процессы.

Цель исследования Разработать метод терапевтического ангиогенеза, основанный на использовании сочетания генов VEGF165 и HGF, встроенных в оригинальные плазмидные конструкции;

изучить механизм совместного влияния этих факторов на ангиогенез и репаративные процессы в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах на моделях инфаркта миокарда и ишемии конечностей у экспериментальных животных.

Задачи исследования

1. Исследовать уровни VEGF165 и HGF в периферической крови больных ИБС с постинфарктной ХСН и сопоставить их с клиническими характеристиками пациентов и маркерами ХСН.

2. Оценить эффективность комбинированного введения плазмид с генами VEGF165 и HGF в восстановлении кровотока и стимуляции васкуляризации скелетных мышц на модели ишемии задней конечности у мыши.

3. Исследовать ангиогенную и тканепротективную эффективность комбинированного использования плазмид с генами VEGF165 и HGF на модели инфаркта миокарда у крысы.

4. На культуре эндотелиальных клеток человека изучить молекулярные механизмы сочетанного влияния VEGF165 и HGF на процессы васкуляризации, для чего оценить активацию сигнальных каскадов, продукцию клетками хемокинов и активацию факторов транскрипции при совместном воздействии VEGF165 и HGF.

Научная новизна В рамках данной работы впервые проведена оценка функциональной активности in vivo нового отечественного плазмидного вектора для генной терапии – pС4W, разработанного сотрудниками ФГБУ РКНПК МЗ РФ, и созданных на его основе конструкций с оптимизированными последовательностями генов VEGF165 и HGF. Впервые исследована терапевтическая эффективность комбинации генов VEGF165 и HGF для стимуляции васкуляризации ишемизированных тканей экспериментальных животных и продемонстрирована возможность повышения эффективности влияния плазмидной генной терапии на ангиогенез в скелетных мышцах и в миокарде при использовании сочетанной экспрессии VEGF165 и HGF. Впервые проведена оценка влияния сочетанной экспрессии VEGF165 и HGF в ишемизированном миокарде на аккумуляцию в нем моноцитов/макрофагов и получены данные, позволяющие предполагать, что разнонаправленность этого влияния может быть фактором, препятствующим аддитивному эффекту этих ангиогенных белков на артериогенез в миокарде. Это обусловливает необходимость учета влияния различных ангиогенных факторов на процессы воспаления при подборе их комбинаций для терапевтического ангиогенеза. Впервые получены данные о сочетанном влиянии VEGF165 и HGF на продукцию хемокинов клетками эндотелия в культуре и раскрыты механизмы этого эффекта, связанные с активацией транскрипционных факторов NFB и факторов, индуцируемых гипоксией – HIF-1 и HIF-2.

Практическая значимость Разработан новый метод терапевтического ангиогенеза, основанный на сочетанной экспрессии двух АФР - VEGF165 и HGF в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах.

Проведена доклиническая оценка эффективности комбинации оригинальных плазмид, несущих эти АФР, на моделях инфаркта миокарда и ишемии конечностей. Результаты работы могут быть положены в основу создания нового лекарственного средства для генной терапии ИБС и КИНК, представляющего собой плазмидную конструкцию с генами VEGF165 и HGF человека.

Апробированные в работе оригинальные плазмидные конструкции, несущие оптимизированные последовательности генов VEGF165 и HGF человека, могут быть использованы для разработки на их основе препаратов для генной терапии других заболеваний, для которых повышенная продукция этих факторов роста в тканях-мишенях может оказывать терапевтический эффект.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных ИБС и постинфарктной ХСН имеется повышение уровня VEGF165 и HGF в крови по сравнению со здоровыми добровольцами. При этом повышение содержания VEGF165 коррелирует с содержанием найтриуретических пептидов, а рост концентрации HGF ассоциирован с развитием ИБС. Данный факт может отражать напряжение компенсаторных механизмов, направленных на стимуляцию ангиогенных процессов и защиту ткани от ишемического стресса и повреждения.

2. Комбинированная экспрессия VEGF165 и HGF в ишемизированной скелетной мышце мыши с помощью плазмидного вектора pC4W позволяет увеличить эффективность стимуляции как ангио- так и артериогенеза, улучшить восстановление кровотока в конечности и уменьшить ишемическое повреждение тканей конечности по сравнению с экспрессией только одного из этих факторов.

3. Совместное введение в периинфарктную зону сердца крысы плазмид с генами VEGF165 и HGF позволяет более эффективно стимулировать ангиогенез, но не увеличивает эффективность влияния на артериогенез и уменьшение размера постинфарктного фиброза.

4. Экспрессия VEGF165 и HGF разнонаправленно влияет на моноцитарную инфильтрацию периинфарктной зоны, играющую важную роль в миокардиальном артериогенезе, в результате чего при комбинированной экспрессии этих факторов HGF, вероятно, подавляет стимулирующее действие VEGF165 на таксис моноцитов, что может определять отсутствие усиления артериогенеза.

5. VEGF165 и HGF обладают аддитивным действием на активацию в культивируемых эндотелиальных клетках внутриклеточных сигнальных каскадов - МАР-киназ ERK1/2 и р38, контролирующих их пролиферацию и миграцию, что может быть одним из механизмов усиления ангиогенного эффекта при совмеcтной экспрессии этих факторов в ишемизированных тканях.

6. VEGF165 и HGF обладают разнонаправленным действием на активность NFB и продукцию клетками эндотелия MCP-1, в результате чего при их комбинировании HGF подавляет VEGF165-индуцированный рост его секреции. Этот механизм может быть ответственен за уменьшение аккумуляции моноцитов в периинфарктной зоне и отсутствие аддитивного влияния на артериогенез при сочетанной экспрессии VEGF165 и HGF.

Степень достоверности и апробация результатов Полученные в ходе работы над диссертацией результаты были доложены на российских и зарубежных международных научных конференциях. Результаты были представлены на конгрессах ведущих научных обществ - Американского общества генной и клеточной терапии (ASGCT) в 2010 и 2014 гг., Европейского общества генной и клеточной терапии (ESGCT) в 2010-11 гг., Европейского общества кардиологов (2013 г), Российского кардиологического общества (2014 г.) и опубликованы в сборниках тезисов этих мероприятий. Также в их число вошли IV Всероссийская научная конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина»

(2011 г.) и международные конференции «World conference of regenerative medicine» (2009 г.) «International meeting on angiogenesis» (Амстердам, Голландия, 2011 и 2014 гг.) Результаты, полученные во время работы над диссертацией, были использованы при выполнении государственных контрактов № 02.512.11.2203 «Разработка метода применения рекомбинантных генетических конструкций, экспрессирующих гены ангиогенных факторов роста, для терапии заболеваний, обусловленных недостаточным кровоснабжением тканей и органов», №11.519.11.6042 «Идентификация новых молекулярно-генетических и клеточных биомаркеров отягощенного течения сердечной недостаточности при ее сочетании с метаболическими расстройствами» и №12411.1008799.13.179 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантной плазмидной конструкции, несущей гены факторов роста, для лечения ишемических заболеваний». Результаты исследования также были использованы при реализации международного проекта FP7/2007-2013 «Studies Investigating Comorbidites Aggravating in Heart Failure (SICA-HF)» под эгидой 7-ой Рамочной программы ЕС совместно с европейскими партнерами.

Загрузка...

По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них - 11 в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Получен патент №2522778 «Cредство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения»

Апробация работы состоялась 7 сентября 2014 г на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, лаборатории генных и клеточных технологий, лаборатории постгеномных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза ФГБУ РКНПК МЗ РФ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Клиническая значимость разработок в области терапевтического ангиогенеза и актуальность задач По данным ВОЗ на долю ССЗ приходится около 33% всей смертности [208; 209]. Одной из основных причин развития ССЗ является связанное с развитием атеросклероза сужение просвета или полная окклюзия сосудов [116; 143]. Таким образом, основной задачей в их лечении становится восстановление кровоснабжения ткани с целью сохранения ее функциональной активности, уменьшения выраженности ишемии и связанных с ней тяжелых состояний (ИМ, ОНМК, трофических язв и гангрен конечностей).

Несмотря на широкие возможности медикаментозных, эндоваскулярных и хирургических методов лечения ССЗ существует достаточно многочисленная когорта больных с тяжелыми хроническими поражениями сосудистого русла и тканей, у которых невозможно проведение интервенционных процедур: шунтирования, стентирования и ангиопластики.

Достаточно частыми противопоказаниями являются сопутствующие заболевания – онкологические, расстройства в эндокринной сфере и др. [118].

С учетом высокой стоимости и потенциальных осложнений возможности реваскуляризации ограничены у пациентов с хроническими диффузными окклюзиями и протяженными атеротромботическими поражениями в магистральных артериях. У таких пациентов имеется повышенный риск острого тромбоза или рестеноза после оперативного или интервенционного вмешательства [70; 214]. Отдельного упоминания заслуживают пациенты, которым уже были проведены операции шунтирования или стентирования с последующим развитием рестенозов, т.е. возможности хирургического лечения оказываются фактически исчерпаны [84; 244].

В связи этим приобрела актуальность разработка способов восстановления кровотока, базирующихся на принципиально новых подходах. Одним из таких методов стал терапевтический ангиогенез, включающий методы, направленные на стимуляцию естественных процессов восстановления кровотока в ишемизированных тканях. При этом последнее происходит не за счет формирования искусственного анастомоза или пластики сосудов, пораженных атеросклерозом, а в результате экзогенной активации физиологических процессов, приводящих к росту новых сосудов и ремоделированию существующих коллатералей[234].

Естественные процессы роста сосудов обладают достаточно высокой эффективностью, о которой свидетельствуют многолетние резервы компенсации недостаточного кровоснабжения у пациентов с ИБС и КИНК. При этом следует принимать во внимание комплексность данных процессов, сложность их регуляции и большое количество участников процесса, каждый из которых имеет важную, а иногда и критическую значимость для успешности восстановления перфузии ткани.

1.2 Механизмы васкуляризации в постнатальном периоде В настоящее время выделяют три способа формирования сосудов в постнатальном периоде: васкулогенез, ангиогенез и артериогенез [34; 267].

Васкулогенезом принято называть истинное формирование кровеносного сосуда de novo из прогениторных клеток, дифференцирующихся в клетки сосудистой стенки. В основном данное понятие относится к периоду эмбрионального развития и закладке кровеносной системы из первичного сосудистого сплетения и ангиобластных клеток мезенхимного происхождения [117; 206]. Однако имеются данные, указывающие на то, что в постнатальном и взрослом организме также могут происходить процессы васкулогенеза за счет эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) [15; 121; 167; 254]. В некоторых работах концепция постнатального васкулогенеза за счет дифференцировки ЭПК подвергается сомнению а их участие в стимуляции роста сосудов ограничивается паракринными эффектами – продукцией АФР и других цитокинов [22; 88; 187; 224],.

В постнатальном периоде ключевую роль играют процессы ангиогенеза, под которым понимают формирование нового сосуда за счет пролиферации и миграции клеток эндотелия с образованием нового отростка. Начинаясь еще в эмбриогенезе после формирования первичного сосудистого сплетения, во взрослом организме он является основным способом расширения кровеносного русла (в основном, капиллярного), играя роль в восстановлении трофики при ишемии, участвуя в заживлении ран и некоторых патологических процессах [196]. К последним относятся рост опухолей, диабетическая ретинопатия и др.

Третьим процессом, обеспечивающим поддержание адекватного кровотока и его восстановление, является артериогенез – увеличение просвета сосуда и толщины его стенки под влиянием возросшего напряжения сдвига (англ. shear stress) и механического растяжения стенки сосуда. Артериогенез играет ведущую роль в компенсации потерь кровоснабжения при стенозах или полных окклюзиях сосудов и приводит к формированию коллатерального кровотока [196]. Наиболее чувствительными к возникающему градиенту давления являются области артерио-артериолярных анастомозов, однако показана обратимость начальных этапов артериогенеза при недостаточно длительном повышении давления или его быстрой нормализации [98].

Таким образом, при ишемических заболеваниях компенсация кровоснабжения возможна за счет формирования новых сосудов - ангиогенеза и ремоделирования предсуществующих артериол с превращением их в функциональные коллатеральные артерии - артериогенеза.

Также нельзя исключать вклада постнатального васкулогенеза, хотя его роль в восстановлении кровоснабжения при ишемической патологии остается предметом дискуссий. Остановимся подробнее на двух первых процессах.

1.2.1 Ангиогенез: механизмы и роль факторов, индуцируемых гипоксией (HIF) в его активации Основным стимулом для ангиогенеза является гипоксия [73], которая может быть связана как с ускорением потребления кислорода тканями (при активном росте организма, физических нагрузках, эндокринных расстройствах, ускорении обмена при анаболических процессах), так и с уменьшением его поступления (нарушение притока крови, анемия и другие причины).

В нормальных условиях кровеносный сосуд представляет собой структуру, состоящую из неделящихся клеток. Стабильность сосуда поддерживается уравновешивающими сигналами от белков, стимулирующих или подавляющих ангиогенез (VEGF, Notch-1, ангиопоэтин-1, FGF, тромбоспондин и др.). При ишемии, воспалении, заживлении ран и опухолевом росте это состояние смещается, и компоненты сосудистой стенки выходят из стабильного статуса. Клетки эндотелия, стромы и ГМК обладают способностью к рецепции парциального напряжения кислорода за счет наличия у них чувствительных к гипоксии молекул из класса пролилгидроксилаз (PHD-1, PHD-2) [54]. Основной функцией PHD является регуляция активности транскрипционных факторов, индуцируемых гипоксией (HIF). Последние представляет собой гетеродимеры, состоящие из конститутивно экспрессирующейся HIFсубъединицы (известной также как ARNT) и одной из трех кислород-зависимых субъединиц (HIF-1, HIF-2 или HIF-3). Гетеродимеры HIF- и одной из -субъединиц формируют факторы транскрипции HIF-1, HIF-2 и HIF-3 соответственно [400].

Наиболее хорошо изучены структура и функциональная активность субъединиц HIF-1 и HIF-2. Аминокислотные последовательности HIF-1 и HIF-2 идентичны на 48%, а различия между HIF-1 и HIF-2 заключаются в структуре N-концевого трансактивационного домена, определяющего специфику регулируемых ими генов [73; 317].

Эффекты HIF реализуются за счет наличия сайтов их связывания, которые получили название элементов, чувствительных к гипоксии (англ. hypoxia responsive elements, HRE). HREсиквенсы обнаружены в промоторных областях генов многих АФР, цитокинов, протеаз и молекул адгезии [342].

Гипоксическая индукция факторов из семейства HIF связана со стабильностью их субъединиц, так как субъединица экспрессируется на постоянном уровне и локализуется в ядре клетки. В условиях нормоксии -субъединицы HIF имеют средний период полужизни около 5 минут за счет активности PHD, которые гидроксилируют HIF-1 и -2 по консервативным остаткам пролина в домене кислород-зависимой деградации (ODD).

Гидроксилирование пролина приводит к присоединению к этому домену белка фон ХиппельЛандау (VHL), который формирует E3-убиквитинлигазный комплекс. Последний способствует полиубиквитинированию -субъединиц с последующей их протеасомной деградацией [401]. В условиях гипоксии активность обеих изоформ PHD ингибируется, что приводит к стабилизации HIF-1 и HIF-2. Альфа-субъединицы перемещаются в ядро, где гетеродимеризуются с HIF-, после чего факторы транскрипции связываются с HRE и активируют экспрессию HIFзависимых генов.

В условиях нормоксии транскрипционная активность HIF-1 и HIF-2 регулируется также за счет другого кислород-зависимого фермента, FIH-1 (англ. factor inhibiting HIF-1). FIHгидроксилирует 803-ий остаток аспарагина HIF-1 и HIF-2, препятствуя их взаимодействию с кофактором p300/CBP. По аналогии с РHD активность FIH-1 ингибируется в гипоксических условиях, что позволяет комплексу кофакторов p300/CBP связываться с HIF-1 и HIF-2, обеспечивая активацию экспрессии генов, несущих HRE-сиквенс (рисунок 1) [317].

Рисунок 1 – Схема кислород-зависимой регуляции активности факторов транскрипции семейства HIF при нормоксии и гипоксии (адаптировано из Loboda и др. [366]) Помимо классического кислород-зависимого пути активность HIF регулируется также на уровне транскрипции и посттрансляционных модификаций (гидроксилирование, фосфорилирование, ацетилирование/ деацетилирование и др.). Механизмы эти могут быть как кислород- так и кислород-независимыми, как селективными, так и неселективными по отношению к HIF-1 и HIF-2 изоформам [400]. В ряде работ указывается, что АФР могут стабилизировать -субъединицы HIF за счет активации МАР-киназных каскадов (в том числе и в нормоксии). Механизмом этого процесса считается стабилизирующее фосфорилирование субъединиц HIF этими МАР-киназами [396; 413; 432].

Возрастающая под влиянием гипоксии продукция АФР по ауто- и паракринному механизму запускает пролиферацию и повышает подвижность ЭК. За счет этого они становятся способными к миграции и формированию первичных тубулярных структур, которые являются основой будущего капилляра.

При гипоксии в периваскулярной зоне также идут процессы протеолиза, приводящие к деградации базальной мембраны, отделению перицитов от сосудистой стенки и разрушению межклеточных контактов между ЭК. Растущая при этом проницаемость приводит к тому, что из кровотока в ткань, окружающую дестабилизированный сосуд, выходят белки, которые формируют «временный» матрикс для миграции клеток [63]. Помимо механической дестабилизации сосуда в повышении сосудистой проницаемости важную роль играют NO, bFGF и факторы роста из семейства VEGF, активно секретируемые ГМК и эндотелием [222].

Внеклеточный матрикс (ВКМ), представляющий собой молекулярный комплекс из коллагенов, гиалуроновой кислоты, протеогликанов и гликозаминогликанов принимает активное участие в росте сосудов. В структуре ВКМ обнаружены ростовые факторы, цитокины, протеазы и целый ряд их ингибиторов. Долгое время его рассматривали как «опорный»

компонент тканей, однако в 1966 году Hauschka и Konigsberg было впервые показали, что интерстициальный коллаген способен стимулировать формирование трубчатых структур из миобластов [96]. Далее было подтверждено наличие на поверхности клеток рецепторов для белков матрикса [247]. Многолетние исследования в этой области показали, что ВКМ представляет собой активно взаимодействующую с клеткой структуру, регулирующую процессы пролиферации, адгезии, миграции, дифференцировки и апоптоза, а также регулирующую активность цитокинов.

Находящиеся в его составе биологически активные молекулы защищены от протеолиза [163], а связывание ФР, наработанных клетками, с ВКМ изменяет их локальную концентрацию, что позволяет регулировать взаимодействие лигандов с их рецепторами. При протеолизе ВКМ входящие в его состав АФР высвобождаются [232] и связываются с рецепторами на поверхности ЭК, ГМК и стромальных клеток, создавая «вторую волну» стимула для формирования сосуда или стабилизации первичного отростка. При этом многие АФР способны регулировать продукцию белков ВКМ, а также протеаз и их ингибиторов [192]. Резюмируя изложенное, можно утверждать, что протеолитическая деградация матрикса, сопровождающая ангиогенез, не только облегчает миграцию ЭК и высвобождает молекулы, которые дают клеткам стимул «занять пространство», но и формирует опосредованный сигнал на восстановление ВКМ с целью стабилизации сосуда [256].

Упомянутая активация ЭК представляет собой комплекс изменений, в результате которых клетки становятся подвижными и формируют филоподии [42], приобретают способность к митозу и миграции. На морфологическом уровне активация эндотелия приводит к увеличению цитоплазматического объема клетки и росту скорости метаболизма, а также изменениям экспрессионного профиля [104; 217]. Активированный эндотелий характеризуется повышенной плотностью молекул адгезии на своей поверхности и выраженными изменениями в структуре гликокаликса, которые облегчают взаимодействие ЭК с лейкоцитами [249].

Молекулярные механизмы переключения ЭК между активированным и неактивным состояниями до конца не изучены. В литературе имеются данные о роли регулятора сплайсинга р54, белков из семейств Hox и GATA и взаимодействии ЭК с коллагенами, высвобождаемыми при протеолизе ВКМ [31]..

Отрастание нового капилляра начинается с появления среди активированных ЭК так называемой «ведущей клетки» (англ. tip cell), осуществляющей навигацию сосудистого отростка по градиенту стимула, которым является концентрация АФР [10].

Особенностями «ведущей» клетки являются повышенная миграционная способность и высокая продукция матриксных металлопротеиназ (в частности, MMP-1 и -2), которые за счет своей протеолитической активности «прокладывают» через ВКМ путь для отростка. За ведущими клетками продвигаются «ведомые» клетки (англ. stalk cells), обладающие более короткими филоподиями [79], меньшим протеолитическим потенциалом и принимающие участие в формировании просвета будущего сосуда [35]. Оба типа клеток характеризуются высокой экспрессией белков системы Notch, причем ведущая клетка способна активировать «ведомый» фенотип в окружающих ее ЭК за счет продукции дельта-подобного лиганда 4 типа (Dll4), который связывается с рецептором Notch-1 [313]. С учетом того, что степень активации Notch-1 обратно пропорциональна вероятности формирования «ведущего» фенотипа, можно предположить, что в данном случае речь идет о механизме предотвращения одновременного формирования большого числа «ведущих клеток».

Появление у «ведущей клетки» присущего ей фенотипа связано с целым рядом факторов, однако одним из ключевых является соотношение рецепторов VEGFR1/VEGFR2.

Для «ведущих клеток» характерна более высокая плотность VEGFR2, причем «ведущая» роль не является зафиксированным состоянием клетки. Функциональная роль ЭК может меняться в зависимости от характера поступающих сигналов и стимулов, т.е. возможен переход «ведомой»

клетки в статус «ведущей», а при утрате «ведущей клеткой» своего фенотипа роста сосуда замедляется вплоть до появления новой лидирующей ЭК [115].

По мере увеличения длины отростка в новом сосуде появляются первые признаки формирования просвета. Длительное время не существовало единого мнения о механизме формирования тубулярной структуры из линейного отростка, состоящего из ЭК. Последние работы выделяют два пути образования просвета:

1) внутриклеточный с формированием просвета за счет расширения вакуолярного объема по пути, напоминающему интенсивный пиноцитоз [21].

2) внеклеточный механизм формирования полой структуры за счет расширения межклеточного пространства в тяже, состоящем из поляризованных ЭК [28; 111].

Данные, полученные при изучении васкуло- и ангиогенеза у рыбки данио (англ.

zebrafish, лат. Bracydahnio rerio), показали, что у позвоночных формирование просвета сосуда осуществляется, вероятнее всего, именно за счет расширения межклеточного пространства, а не вакуолизации цитоплазмы [28].

Регуляция диаметра просвета происходит под влиянием про- и антиангиогенных цитокинов. Показано, что под действием ангиопоэтина-1 может происходить его увеличение, а под влиянием тромбоспондина и белка tubedown-1 формируются сосуды меньшего диаметра [69]. Кроме того, морфология сосудов может в дальнейшем претерпевать значительные изменения под воздействием механических факторов – гидростатического давления, напряжения сдвига и др. [119]. Также имеются данные о возможности формировании анастомоза между двумя первичными отростками, идущими навстречу друг другу за счет слияния, после чего определяется направление кровотока в анастомозе. Предполагается, что после созревания анастомоза направление кровотока зависит от градиента давления в сосудах, от которых началось формирование отростков [34].

Финальный этап ангиогенеза характеризуется «выключением» активированного фенотипа «ведущей» клетки при ее контактном взаимодействии с перицитами. Экспрессия ММР резко падает [69], растет продукция тканевых ингибиторов протеаз – TIMP-2 и -3 [198;

246]. Также увеличивается активность оси Dll4-Notch1, за счет чего значительно уменьшается вероятность активации новой «ведущей» клетки под воздействием АФР [101]. Кроме того, при реверсивном изменении фенотипа эндотелия падает продукция большинства ФР, участвующих в активации ЭК, и повышается секреция стабилизирующих белков (например, PDGF, ангиопоэтина-1 и TGF-1) [42].

Стабилизация сосуда осуществляется за счет взаимодействия ЭК с перицитами, ГМК и белками матрикса. На начальных этапах его структура поддерживается, в основном, плотными клеточными контактами и адгезивными взаимодействиями между ЭК [111]. Затем происходит таксис перицитов и ГМК за счет наличия на них рецепторов АФР – Tie-2 для ангиопоэтина-1, PDGF-R1 для изоформ PDGF [145] и др. В результате уменьшается фенестрированность эндотелиального слоя, снижается его проницаемость, формируется сосудистая стенка и начинается наработка перицитами белков ВКМ.

Еще одним важным моментом финального этапа ангиогенеза является созревание сосудистой сети как единого аппарата и ее специализация в зависимости от типа сосудов, а также ткани и ее функциональных особенностей. Созревание капиллярной сети включает в себя диссоциацию тупиковых и избыточных ветвей, которая происходит за счет колебаний паракринных сигналов и тканевого напряжения кислорода [42]. Касательно последнего следует отметить, что после первичной нормализации содержания кислорода в ткани и угасания основного стимула возможно вторичное ветвление сформированных сосудов и определенные навигационные изменения в условиях нормоксии [114].

1.2.2 Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления Основным стимулом артериогенеза является изменение гемодинамических условий в сосудистом русле, чаще всего связанное с окклюзией или выраженным стенозом артерии среднего или крупного калибра [218]. При возникновении затруднения для кровотока формируются две зоны – высокого давления (преокклюзивная) и низкого (постокклюзивная область). Объем кровотока через сосуды, отходящие от преокклюзивной зоны, резко увеличивается, что приводит к их растяжению, деформации мембран ЭК и увеличению напряжения сдвига на их поверхности.

Увеличение напряжения сдвига воспринимается ЭК с помощью поток-чувствительных К+ и Cl- каналов [180] и связанных с ними g-белков [90]. При их активации запускается фосфорилирование MAP-киназ (ERK1/2, Rho и др.), растет активность факторов транскрипции [251], увеличивается продукция интегринов и коннексинов, а также ряда АФР [216].

Активированные напряжением сдвига ЭК обладают способностью рекрутировать в периваскулярное пространство моноциты за счет продукции MCP-1 (англ. macrophage chemoattractant protein-1) и ряда других цитокинов. Вторая ключевая молекула в этом процессе

– ICAM-1, которая экспонируется на поверхность ЭК и участвует в формировании адгезивного фенотипа, характеризующегося способностью захватывать лейкоциты из кровотока за счет «роллинга» (от англ. rolling – букв. качение) [104]. Рост продукции MCP-1 и ICAM-1 клетками сосуда связан с активностью ядерного фактора каппа-В (NF-B), который регулирует транскрипцию большого спектра белков системы воспаления и некоторых АФР [389; 434].

Рекрутированные моноциты и их дифференцированные формы – макрофаги и дендритные клетки – участвуют в протеолизе ВКМ. Как и при ангиогенезе в деградации матрикса ключевыми являются ММР различных типов и урокиназный активатор плазминогена (uPA) [245]. uPA участвует в протеолизе белков базальной мембраны сосудов (фибронектина, ламинина и др.), вызывает повышение экспрессии самих ММР и активирует ангиогенные молекулы, в частности, HGF и изоформы VEGF [245; 256]. В одной из работ было также показано, что за счет своей протеолитической активности моноциты способны «прокладывать»

маршрут в ВКМ для отрастания капилляров от артериол, что приводит к нормализации трофики ткани [167]. Кроме того, клетки моноцитарного звена участвуют в активации ГМК, повышая их способность к делению, гипертрофии и миграции [192]. В результате этого толщина медии, состоящей из ГМК, возрастает иногда в несколько раз [197], а вся коллатераль может увеличиваться в объеме от 2 до 20 раз [220].

Помимо этого моноциты продуцируют широкий спектр АФР [333], макрофаги резорбируют некротизированную ткань, которая появляется при окклюзии крупного артериального ствола, и участвуют в регенерации и поддержании трофики скелетной мышцы и миокарда. При этом следует особо отметить важность моноцитов в миокардиальном артериогенезе [381; 382; 420].

Драматической иллюстрацией роли воспаления и моноцитов в артериогенезе и репарации ткани при ИМ стало клиническое исследование 1976 года, в котором для уменьшения размеров инфаркта предлагалось назначение эффективного иммуносупрессора – метилпреднизолона [394]. Основанием для этого являлось логичное предположение о том, что подавление воспалительной инфильтрации и системного лейкоцитоза позволит уменьшить повреждение миокарда. По окончании испытаний полученные результаты были охарактеризованы некоторыми исследователями-клиницистами, как «катастрофические» [391].

Назначение метилпреднизолона повышало риск жизнеугрожающих аритмий и увеличивало размеры зон гипо- и акинеза, ухудшая прогноз, что привело к досрочному прекращению протокола.

Двумя годами позже в эксперименте на крысах было обнаружено, что подавление воспалительной реакции с помощью кортикостериодов приводит к дистрофии периинфарктной зоны миокарда, которую образно назвали «мумификацией» [350]. Из-за иммуносупрессии происходило резкое падение количества фагоцитов и, как следствие, сохранение большого объема некротизированной ткани. Эти изменения сопровождались замедленным разрешением инфаркта и нарушением васкуляризации и регенерации в периинфарктной зоне.

Специфическим образом роль моноцитов в миокардиальном артериогенезе была показана почти 30-ю годами позже в работе van Amerongen и соавт., в которой деплеция моноцитов с помощью клодроната приводила к резкому ухудшению эффективности артериогенеза при криотравме миокарда у мышей. Кроме того по истечении 4-х недель у животных, которым вводили клодронат, сохранялись некротизированные кардиомиоциты и была значимо хуже сократительная функция ЛЖ и выживаемость [418].

Следует заметить, что пример с назначением метилпреднизолона и подавлением репарации в миокарде не является казуистическим. В настоящее время среди возможных причин низкой эффективности артериогенеза при КИНК и ОНМК рассматривается, как ни парадоксально, прием аспирина – НПВС с ангиагрегантными свойствами. В работах на животных моделях было показано его подавляющее действие на артериогенез при ишемическом инсульте [59] и лигировании бедренной артерии [108]. При этом у животных, которым вводился аспирин, отмечалось уменьшение аккумуляции моноцитов в ткани.

Интересно, что наблюдавшийся эффект аспирина на церебральный артериогенез был полностью обратим параллельным введением Г-КСФ, вызывающего мобилизацию моноцитов [59].

По мере расширения кровеносного русла происходит снижение градиента давления и, таким образом, снимается основной стимул, который запускал артериогенез, а также снижается продукция хемоаттрактантов эндотелием. Экстравазация моноцитарных клеток прекращается, а тканевые макрофаги теряют протеолитический потенциал и прекращают продуцировать факторы, активирующие клетки сосуда. При стабилизации артериальной коллатерали значительно возрастает продукция белков матрикса, формируются гладкомышечная оболочка, базальная мембрана и адвентиция сосуда, обеспечивающего кровоток в обход точки окклюзии или стеноза.

Считается, что за счет описанных выше процессов возможно восстановление кровотока на 30-40% при критических стенозах и тромбозах [216]. При этом у больных существуют индивидуальные вариации в эффективности артериогенеза [202]. Это связывают с тем, что у них окклюзии и стенозы артерий возникают на фоне факторов риска: артериальной гипертензии, курения и связанной с ним гиперкоагуляции, гиперлипидемии, сахарного диабета и ожирения, для которых показано подавляющее действие на артериогенез [52].

К некорректируемым факторам, определяющим эффективность восстановления кровотока, относят анатомические особенности коллатеральных сосудов, плотность которых может варьировать и определять успешность компенсации нарушений кровотока [421].

Несмотря на то, что задачей и ангио- и артериогенеза является восстановление кровотока, эти физиологические процессы отличаются как по стимулу, их вызывающему, так и по характеру клеточных реакций, опосредующих ответ; в таблице 1 кратко суммированы основные отличия.

–  –  –

1.2.3 Васкулогенез в постнатальном периоде Процессы васкулогенеза, которые относятся к периоду закладки первичных сосудов из эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) в эмбриональном развитии, могут иметь место и в постнатальном периоде. Впервые ЭПК во взрослом организме были описаны Asahara [15], причем в последующем они были обнаружены не только в периферической крови и костном мозге [241], но и в составе стенки крупных сосудов [253].

Классический иммунофенотип для ЭПК характеризуется экспрессией VEGFR2, CD34 и CD133 [127; 128; 144]. Для ЭПК показана способность к мобилизации и направленной миграции в зону ишемии под влиянием градиента ФР, образующегося в поврежденной ткани.

На данный момент известно, что в эти процессы вовлечены VEGF165, HGF, ангиопоэтин-1, SDF-1 и другие цитокины [95; 253].

На сегодняшний день функциональное значение васкулогенеза в реваскуляризации при ишемии не определено. В экспериментальных работах на моделях ИМ и ишемии конечности продемонстрирована способность ЭПК стимулировать рост сосудов [56]. Это происходит за счёт экспрессии различных ангиогенных и антиапоптотических факторов и, возможно, встраивания этих клеток в стенку формирующихся сосудов. Последнее является спорным вопросом – по разным данным степень инкорпорирования ЭПК в сосуды в зоне ишемии варьирует от 0-3% до 40% [253]. Кроме того, на данный момент отсутствует консенсус в отношении набора антигенных маркёров, который характеризовал бы эндотелиальную клетку– предшественник. Всё это не позволяет однозначно определить роль этих клеток в процессах восстановления кровоснабжения в постнатальный период.

1.2.4. Роль АФР как ключевых регуляторов ангиогенеза, артериогенеза и васкулогенеза При всех описанных выше различиях все три процесса – ангиогенез, артериогенез и васкулогенез – являются частью единой реакции, направленной на рост сосудов, начиная с фазы развития организма и в течение всей жизни [205; 207; 246; 256; 257]. Эти процессы могут запускаться параллельно при нарушениях кровообращения для их компенсации или при физиологических процессах, сопряженных с увеличением количества сосудов.

Ключевыми факторами, управляющими ростом сосудов вне зависимости от инициирующего механизма, являются АФР с их митогенным действием на клетки сосудистой стенки и хемотактическими свойствами. Особую роль играют факторы из семейств VEGF и FGF, ангиопоэтины, HGF и белки из группы PDGF. Все они характеризуются широкой плеотропией функций, которая делает их своего рода “универсальными” регуляторами васкуляризации тканей [31; 32; 34; 233].

1.3 Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и их роль в ангиогенезе 1.3.1 VEGF: краткая характеристика семейства факторов роста Среди многообразия ФР, участвующих в процессах васкуляризации, одними из наиболее важных являются белки из семейства факторов роста эндотелия сосудов (VEGF).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |
 
Похожие работы:

«Малышева Наталья Николаевна РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ESCHERICHIA COLI И АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4 02.00.02 – Аналитическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических...»

«ТОРРЕС МИНЬО КАРЛОС ХАВЬЕР ОЦЕНКА СОРТОВ АМАРАНТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ ЛИСТОВОЙ БИОМАССЫ Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений 06.01.09 овощеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научные руководители: доктор, б. наук, профессор М. С. Гинс; доцент, к. с-х. наук Е.В....»

«Преловский Владимир Александрович АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ СТРУКТУРЫ НАСЕЛЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ЮЖНО-МИНУСИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ 25.00.23 – физическая география и биогеография, география почв и геохимия ландшафтов диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: кандидат географических наук...»

«УДК 622.276.6 Диева Нина Николаевна ГИДРОДИНАМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТЕРМОХИМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ПЛАСТЫ ТРУДНОИЗВЛЕКАЕМЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ Специальность: 01.02.05 – Механика жидкости, газа и плазмы диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Кравченко Марина Николаевна МОСКВА 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«КОНДРАТЬЕВА ТАТЬЯНА ДМИТРИЕВНА ЭКОЛОГО-БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ BACILLUS SUBTILIS, НА СИСТЕМУ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Замана С.П. Москва...»

«Херрера-Альварадо Луис Андрес РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ НЕФТЕШЛАМОВ НА ТЕРРИТОРИИ МЕСТОРОЖДЕНИЯ АUCA – EP PETROECUADOR В ЭКВАДОРЕ 03.02.08 – Экология (в химии и нефтехимии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Мазлова Елена Алексевна Москва – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ОБЗОР...»

«САЛЕНКО ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ПРОГРАММИРОВАНИЕ УРОЖАЙНОСТИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗОНЕ УМЕРЕННОГО УВЛАЖНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ОПТИМИЗАЦИИ ПРИМЕНЕНИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ 06.01.04 агрохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Есаулко...»

«ЭССЕР Арина Александровна НАНОКЛАСТЕРЫ И ЛОКАЛЬНЫЕ АТОМНЫЕ КОНФИГУРАЦИИ В СТРУКТУРЕ ИНТЕРМЕТАЛЛИДОВ 02.00.04 – физическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Блатов Владислав Анатольевич Самара – 2015 Оглавление Введение.. 6 Глава 1. Обзор...»

«ГОЛОВАНОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ КОМПЛЕКСНАЯ КОРРЕКЦИЯ ЗДОРОВЬЯ МУЖЧИН В УСЛОВИЯХ АЭРОБНЫХ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗОК 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры...»

«Знаменская Татьяна Игоревна МИГРАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОЛЛЮТАНТОВ В СТЕПНЫХ ЛАНДШАФТАХ ЮГА МИНУСИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ 25.00.23 – Физическая география и биогеография, география почв и геохимия ландшафта Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор географических наук Давыдова Нина Даниловна...»

«АФОНАСЕНКО КИРИЛЛ ВАЛЕНТИНОВИЧ ТЕХНОЛОГИЯ ХЛОПЬЕВ БЫСТРОГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОАКТИВИРОВАННОГО ЗЕРНА РЖИ Специальность: 05.18.01 Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени...»

«Ростокина Елена Евгеньевна ПОЛУЧЕНИЕ ОСОБО ЧИСТЫХ УЛЬТРАДИСПЕРСНЫХ ПОРОШКОВ АЛЮМОИТТРИЕВОГО ГРАНАТА ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МЕТОДОМ 02.00.01 – неорганическая химия (химические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических наук Гаврищук Евгений Михайлович Нижний Новгород –...»

«Якушин Роман Владимирович ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ЭЛЕКТРОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ 02.00.04 – физическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель д.т.н., профессор Колесников Владимир Александрович Москва2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Физика низкотемпературной плазмы...»

«Губанов Александр Алексеевич РАЗРАБОТКА ПРОЦЕССА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ УГЛЕРОДНОГО ВОЛОКНА С ЦЕЛЬЮ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОЧНОСТИ УГЛЕПЛАСТИКОВ 05.17.03 – Технология электрохимических процессов и защита от коррозии 05.17.06 – Технология и переработка полимеров и композитов ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«СОФРОНОВ Александр Петрович ЭВОЛЮЦИЯ И ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ КОТЛОВИН СЕВЕРО-ВОСТОЧНОГО ПРИБАЙКАЛЬЯ 25.00.23 – физическая география и биогеография, география почв и геохимия ландшафта Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель доктор географических наук Белов Алексей Васильевич Иркутск 201...»

«УДК 911.3:332.1 (430) БАННИКОВ Алексей Юрьевич Кластеры как новая форма территориальной организации химической промышленности Германии Специальность: 25.00.24 – Экономическая, социальная, политическая и рекреационная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор географических наук, профессор А.П. Горкин Москва – 2015 СОДЕРЖАНИЕ...»

«Шелаева Татьяна Борисовна Механохимическая активация стекольной шихты Специальность 05.17.11 – Технология силикатных и тугоплавких неметаллических материалов Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель кандидат технических наук, профессор Н. Ю. Михайленко Научный консультант доктор технических наук, профессор В. Ф. Солинов Москва – 2015 год Содержание Введение...»

«Бурганов Тимур Ильдарович ЭФФЕКТЫ СОПРЯЖЕНИЯ В СПЕКТРАХ ЭЛЕКТРОННОГО ПОГЛОЩЕНИЯ И КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА РЯДА 1,2-ДИФОСФОЛОВ И 1,2-ДИФОСФАЦИКЛОПЕНТАДИЕНИД-АНИОНОВ 02.00.04 – физическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор химических наук,...»

«РАЕНБАГИНА ЭЛЬМИРА РАШИДОВНА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНИЧЕСКОЙ ЭКСПЛУАТАЦИИ ГАЗОБАЛЛОННЫХ АВТОМОБИЛЕЙ ПУТЕМ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ СЛИВА ГАЗА Специальность 05.22.10 – Эксплуатация автомобильного транспорта Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель доктор технических наук, профессор Певнев Н.Г. Омск –...»

«ХОРОХОРИН АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ Стратегия развития современных нефтехимических комплексов, мировой опыт и возможности для России Специальность: 08.00.14. – Мировая экономика Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель доктор экономических наук, профессор, член-корреспондент РАН Е.А. Телегина Москва – 201 Оглавление ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Современный нефтехимический сектор в структуре мировой экономики 1.1. Современный мировой...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.