WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


«Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью фотоактивируемого красителя на основе родамина ...»

На правах рукописи

_________________

Генералов Александр Андреевич

Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью

фотоактивируемого красителя на основе родамина

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2015



Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ), и в ФГБУН «Институте биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук» (ФГБУН ИБХ РАН).

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Зайцев Сергей Юрьевич;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Свирщевская Елена Викторовна

Официальные оппоненты:

Зубов Виталий Павлович - доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова», кафедра химии и технологии высокомолекулярных соединений, профессор, тел.: +7 (903) 252-47-92, Email: zubov@ibch.ru Захарова Людмила Алексеевна – доктор биологических наук, профессор, ФГБНУ «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, лаборатория клеточных и молекулярных основ гистогенеза, главный научный сотрудник, тел.: +7 906 055 29 56; +7 495 454 12 47, Email: zakharova-l@mail.ru.

Ведущая организация: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАН, тел.: (495) 526-43-74; (495) 526-45-16, Email: Vnitibp@mail.ru.

Защита состоится «___» _______ 2015 г. в _____ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, по адресу: 109472, г. Москва, ул.

Академика Скрябина, д. 23. Тел. (495)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и на сайте http://www.mgavm.ru/.

Автореферат разослан «____»_________2015 года и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Т.Н. Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Упаковка лекарственных средств в липосомы или наночастицы позволяет частично решать проблему токсичности препаратов для здоровых тканей, увеличить время циркуляции лекарства в крови, направлять системы доставки в нужный орган или ткань, например в опухоль. Использование систем доставки позволяет создавать многокомпонентные препараты, в состав которых можно включать несколько лекарственных препаратов, а также один или несколько целевых векторов – молекул, связывающихся со специфическими рецепторами на тканях.

Размер, заряд и гидрофобность системы доставки также во многом определяет биораспределение доставляемых лекарств, а также внутриклеточный транспорт молекул. Для разработки таких систем используют различные полимеры.

Хитозан, получаемый из хитина, является одним из перспективных биополимеров для разработки систем доставки. Хитозан совместим с тканями млекопитающих, малотоксичен, деградируется ферментами организма. Значительным преимуществом хитозана по сравнению с прочими биополимерами является наличие многочисленных реакционно-способных групп, что позволяет получить необходимые характеристики с помощью химических модификаций [Wang W., 2015; Abdelhamid HN., 2014]. В полимерную матрицу на основе хитозана и его производных могут быть включены вещества различной природы - белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, витамины, противоопухолевые препараты и др. [Xiaoyu Y., 2014; Cifani N., 2014; Park S., 2013].

Кроме того, в зависимости от молекулярной массы и степени модификации полимера различными заместителями, могут быть получены носители различного размера и заряда. Для эффективного использования хитозана для систем доставки требуется детальное понимание поведения хитозана и наночастиц на его основе в клетках и организме в целом.

Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной инструментальной биологии является применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей, обладающих селективными свойствами окрашивания тканей, клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов.





В данной работе использовали новый фотоактивируемый краситель на основе родамина ТМР-NN-813 для анализа внутриклеточного транспорта производных хитозана с различными физико-химическими свойствами.

Цель работы: Изучить транспорт производных хитозана с различными физикохимическими свойствами с помощью фотоактивируемого флуоресцентного зонда ТМРNN-813.

Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

Изучить спектральные характеристики и внутриклеточный транспорт 1.

флуорофора ТМР-NN-813.

Получить и охарактеризовать панель производных хитозана с различными 2.

физико-химическими свойствами.

Изучить и сравнить способность полученных производных хитозана 3.

связываться с макрофагальными и эпителиальными клеточными линиями методом проточной цитометрии.

Определить с помощью фотоактивируемого флуорофора ТМР-NN-8 4.

внутриклеточный транспорт производных хитозана в клетках млекопитающих.

Сравнить в динамике различия транспорта производных хитозана в 5.

эпителиальных и макрофагальных клетках.

Научная новизна работы. С помощью фотоактивируемого красителя ТМР-NNвпервые в мире показана внутриклеточная сортировка положительно заряженных производных хитозана в митохондрии клеток. Впервые в мире показан митоптоз и экзоцитоз митохондрий, нагруженных положительно заряженным хитозаном. Впервые в мире показано отсутствие транспорта через мембраны клеток хитозана с низкой степенью дезацетилирования (50-40%). Впервые в мире фотоактивируемый краситель на основе родамина ТМР-NN-813 использован для анализа внутриклеточного транспорта хитозана.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы связана с изучением механизмов транспорта хитозана с разными физико-химическими свойствами в эпителиальных и макрофагальных клетках в культурах in vitro, что является необходимым этапом при создании систем доставки лекарств. Практическое значение работы состоит в выборе производных хитозана, перспективных для использования в системах доставки лекарств, а также определение спектра патологий, для терапии которых такие системы могут использоваться. Показано, что системы доставки лекарств на основе положительно заряженных производных хитозана с высокой степенью дезацетилирования могут применяться для терапии патологий, вызванных дисфункцией митохондрий (митохондриальная энцефаломиопатия, миоклоническая эпилепсия, гликогеноз, кардиомиопатия, митохондриальный сахарный диабет, эклампсия и др.). Полученные в работе теоретические и практические данные используются в лекционном курсе и лабораторных практикумах ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по курсам дисциплин: "Биохимия" - 3 курс ВБФ, "Спектральные методы исследований" - 3 курс ВБФ, "Биохимия мембран" - 4 курс ВБФ, "Современные методы исследований в бионанотехнологии" - магистратура по направлению «Биология»

(магистерская программа «Биохимия и бионанотехнологии»).

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований при РАН «Молекулярная и клеточная биология»; "Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов"; ФЦП (П730, 14.740.11.0548-0724; 16.512.11.2069; 12.572.11.0008), а также грантом 7-ой Рамочной программы Евросоюза European Frame Program 7, NMP.2010.4.0-1, Development of nanotechnology-based systems for detection, diagnosis and therapy for cancer.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых и семинарах: в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2012международная конференция «Ломоносов и Гумбольдт: Научное сотрудничество России и Германии – от истоков до наших дней» (Москва, 2011).; XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011)_; 10-th international conference of the European chitin society (St.-Petersburg, 2011); Третья Международная научная конференция “Химическая термодинамика и кинетика” (Великий Новгород, 2013);

Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию ИБХ им. Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 6 статей в журналах (в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК) и 2 тезисов докладов на Российских и международных конференциях.

Личный вклад соискателя являлся основополагающим на всех этапах работы и состоял в непосредственном участии в выборе направления научного поиска, разработке цели и задач исследований по теме диссертационной работы; выполнении экспериментальных и теоретические исследований по теме диссертации; проведении биотехнологических, биохимических и цитологических исследований; анализе полученных результатов.

Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на 143 страницах машинописного текста и включают 56 рисунков, 10 таблиц и 3 страницы приложений. Список литературы содержит 221 источник, из них 208 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

Фотоактивируемый краситель на основе родамина ТМР-NN-813 имеет 1.

преимущества перед аналогами по устойчивости к выгоранию, возможности использования в широком диапазоне концентраций, позволяет достигать лучшего разрешения изображения.

Производные хитозана с низкой степенью дезацетилирования не 2.

транспортируются внутрь клеток и, соответственно, не могут использоваться для разработки систем доставки лекарств в эпителиальные (раковые) клетки.

Положительно заряженные производные хитозана с высокой степенью 3.

дезацетилирования транспортируются внутрь клеток, где локализуются преимущественно в митохондриях. Отрицательно заряженные производные хитозана транспортируются в лизосомы клеток.

Макрофаги эффективнее захватывают хитозаны, чем эпителиальные клетки 4.

и способны фагоцитировать производные с любой степенью дезацетилирования.

Накопление производных хитозана в клетках приводит к апоптозу 5.

(митоптозу) и экзоцитозу митохондрий во внеклеточную среду, что является частью метаболизма клеток и токсично только при высоких концентрациях хитозана.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена на кафедре химии имени профессоров С.И. Афонского, А.Г. Малахова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории клеточных взаимодействий ФГБУН ИБХ РАН в период с 2011 по 2014 год.

Фотоактивируемый флуоресцентный краситель ТМР-NN-813 предоставлен Беловым В.Н., Германия. В работе использовали трекеры клеточных органелл форм Sigma, Invitrogen и Мolecular Probes; хитозаны с молекулярной массой (ММ) 200 кДа и степенью деацетилирования (СД) 90%; хитозан 50 кДа и СД 90% (Sigma), хитозаны 12 и 7 кДа, СД 90% (Aladdin Chemistry Co., Ltd., Китай). Производные с низкой СД получали методом реацетилирования хитозана А1. СД определяли с помощью 1Н-ЯМР кондуктометрией. Среднюю ММ определяли методом вискозиметрии и фракционирования. Для визуализации транспорта все производных хитозана маркировали ФИТЦ. В работе использовали линии эпителиальных и макрофагальных клеток. Анализ проводили с помощью конфокальной микроскопии на приборе Eclipse (Nikon, Japan) и проточном цитометре FACScan (BD, USA). Результаты E2000 анализировали с помощью пакета статистических программ Excel. Определяли среднее значение и стандартные отклонения. Достоверные различия оценивали по T-критерию Стьюдента При р0,05 различия считали достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение физико-химических параметров и внутриклеточного транспорта ТМР-NN-813. При сравнении с тетраметилродамином (ТМР) краситель ТМР-NN-813 в неактивном виде не дает фонового свечения (Рис.1). Для определения мишени связывания красителя внутри клеток использовали коммерческие трекеры органелл.

–  –  –

Рис. 2. Ко-локализация ТМР-NN-813 и трекеров органелл: контроль (A), ЭПР (B), лизосомы (C), митохондрии (D,E), комплекс Гольджи (F).

Показали, что ТМР-NN-813 окрашивает не только митохондрии, но и проходит в цитоплазму и ядро (Рис. 2). Основной мишенью ТМР-NN-81 являются митохондрии (Рис.2).

Не наблюдали ко-локализации с эндоплазматическим ретикуломом, лизосомами, аппаратом Гольджи. Рядом экспериментов показано преимущество фотоактивируемого красителя ТМР-NN-813 по сравнению с ТМР по устойчивости к выгоранию, контролируемой интенсивности сигнала, лучшей визуализации внутриклеточных органелл.

Получение и характеристика производных хитозана с различными физикохимическими свойствами. В работе была получена панель производных хитозана, различающихся по степени дезацетилирования (СД) (хитозаны А1-А3), молекулярной массе (ММ) (хитозаны А-D), наличию гидрофобных остатков (хитозан E), а также имеющих отрицательный заряд (хитозан F) (Таблица 1).

Для получения производных с низкой СД провели реакцию реацетилирования в мягких условиях. СД и ММ определяли методом Н-ЯМР и вискозиметрией по Уббелоде соответственно (Рис. 3).

Для производных А1-А3, В, С и Е уточняли ММ с помощью нового метода фракционирования хитозанов в ассиметрическом потоке с детекцией по статическому светорассеянию. Показали, что при снижении СД производные отличаются по упаковке молекулярных цепей, что выражалось в изменении условной вязкостной массы (Таб. 2).

Таблица 1 - Характеристика хитозанов

–  –  –

СД – степень дезацетилирования хитозана, %; 2СЗ – степень замещения NH2- групп на COOHгруппы, %/степень замещения NH2- групп на остатки додеценовой кислоты, %;

3 ММ – молекулярная масса, килодальтоны.

–  –  –

Гидрофобизованные производные хитозана были получены из хитозана с ММ 50 кДа на основе додеценилхитозана (Таблицы 1-2, Е и F соответственно). Степень замещения по жирнокислотным остаткам в обоих случаях была около 9%, что является достаточным для изменения свойств хитозана; степень замещения по сукцинильным группам в хитозане F составила 70%, что определяли методом 1H-ЯМР (Рис. 4).

Все полученные производные были коньюгированы с ФИТЦ для визуализации, диализованы и хранились при +40С. Все препараты были стабильными, по крайней мере, 2 месяца.

–  –  –

Сравнение связывания производных хитозана с клетками методом проточной цитометрии. Связывание с поверхностью клетки является первым шагом в транспорте хитозана внутрь. Для количественной оценки связывания разных хитозанов использовали метод проточной цитометрии.

А Б

–  –  –

Показали, что хитозан А1 связывается значительно эффективнее, чем все остальные хитозаны. В целом связывание убывало в ряду А1EA2=A3=B=C=D=F. Связывание хитозана с клетками не означает обязательного дальнейшего транспорта внутрь клеток.

Для анализа транспорта внутрь клеток использовали проточную цитометрию. Клетки инкубировали в присутствии хитозанов 72 ч, после чего анализировали распределение хитозана в клетках. Пример внутриклеточной и мембранной локализации хитозана приведен на рисунке 5-А, где видно изменение светимости хитозана A1 в клетках (по оси Y) со временем.

А Б Рис. 5. Распределение хитозана А1 и А2 в клетках MiaPaCa-2 через 72 ч инкубации.

Рисунок показывает неизменное распределение хитозана А2, 5-Б ассоциированного с мембранами клеток и не попадающего внутрь клетки, где происходит его процессинг.

Анализ транспорта хитозана через мембрану показал, что хитозаны А2 и А3 с низкой СД не проходят в клетки. Хитозаны с низкой ММ проходили в клетки аналогично хитозану А1. Гидрофобизованный отрицательно заряженный хитозан F хуже проходил в клетки, чем положительно заряженный хитозан Е.

Для определения токсичности производных хитозана использовали проточную цитометрию и МТТ-тест.

Для выявления апоптотических и некротических клеток использовали окрашивание с помощью DiOC6, красителя, чувствительного к потенциалу митохондрий, и йодистого пропидия (PI), попадающего только в поврежденные клетки.

Известно, что потенциал митохондрий апоптотических клеток снижается, что приводит к снижению флуоресценции DiOC6. Показали, что только хитозаны, проходящие внутрь клетки, вызывают частичную гибель клеток, при этом наблюдается гиперполяризация митохондрий (Рис. 6).

Анализ пролиферации клеток 4 линий, включая линию MiaPaCa-2, методом МТТ не показал значительной токсичности (менее 20%) при инкубации те же 72 ч, что может означать не только токсичное действие на клетки, но и стимуляцию пролиферации остальных клеток.

Рис. 6. Оценка апоптоза клеток MiaPaCa-2, вызванного хитозанами А1 (Б), А2 (В) и А3 (Г). Клетки инкубировали 72 ч инкубации с хитозанами (100 мкг/мл), отмывали от хитозанов, окрашивали DiOC6 и йодистым пропидием (PI) и анализировали на проточном цитометре. А – отрицательный контроль.

Данный феномен требует дальнейшего изучения. Эффект хитозанов с низкой ММ был аналогичен хитозану А1 и проявлялся в достоверном увеличении доли апоптотических и некротических клеток в культурах при отсутствии токсического эффекта в целом на популяцию клеток по оценке в МТТ-тесте. В результате проведенной работы было показано, что производные хитозана с низкой СД, а также отрицательно заряженные гидрофобные производные (в частности додеценил сукциноил сукциноил хитозан) не проходят внутрь клеток. Хитозаны с высокой СД и любой ММ, в том числе гидрофобные, попадают в клетки млекопитающих. Для прохождения хитозана в клетки требуется более 24 ч. При высокой концентрации хитозан вызывает апоптоз и некроз клеток. При физиологических концентрация токсичность всех полученных хитозанов была низкой (0-20%).

Анализ внутриклеточного транспорта производных хитозана. Клетки инкубировали с хитозанами 24, 48 и 72 ч. На линиях MDCK и MiaPaCa-2 показали, что большая часть молекул хитозана собирается в комплексы, которые длительно локализуются на поверхности эпителиальных клеток (Рис.7). Так, через 24 ч хитозаны А1 и А2 оставались на поверхности клеток. В то же время, инкубация в течение 24 ч макрофагальных клеток RAW267.4 c хитозанами приводила к его транспортировке в митохондрии (Рис. 7, желтый цвет).

В отличие от эпителиальных клеток макрофаги экспрессируют маннозный рецептор, связывающий хитозан, а также способны фагоцитировать корпускулярный материал. Одновременная окраска митохондрий с помощью ТМР-NN-813 показала, что хитозаны А1-А3 попадают в митохондрии макрофагов (желтый цвет), что соответствует специфическому транспорту положительно заряженных хитозанов в митохондрии.

Аналогичный анализ провели с хитозанами с разной ММ. Транспортировка положительно заряженных хитозанов через мембраны эпителиальных клеток идет медленно (более 24 ч). Во все времена инкубации на эпителиальных клетках можно видеть наночастицы хитозана, ассоциированные с мембраной клеток. Макрофагальные клетки более эффективно захватывали хитозаны и транспортировали их в митохондрии (Рис.8).

Наличие жирных остатков оказывает неоднозначное действие и требует более детального изучения. На рисунке 9 приведены изображения клеток RAW264.7, обработанные хитозанами Е (А) и F (Б) в течение 48 ч и окрашенные ТМР-NN-813 для визуализации митохондрий. Положительно заряженный гидрофобный хитозан Е накапливался в митохондриях аналогично хитозанам А1, В-D, что постепенно приводило к их деполяризации (снижение окраски ТМР-NN-813).

Отрицательно заряженный гидрофобный хитозан приводил к обратному эффекту

– гиперполяризации митохондрий (Рис. 9. Б). В обоих случаях наблюдали увеличение размера митохондрий.

Картина транспорта отрицательно заряженного хитозана F не соответствовала митохондриальной локализации. Поскольку в литературе сообщается, что хитозан транспортируется в лизосомы, мы провели окрашивание клеток лизотрекером и показали ко-локализацию отрицательно заряженного хитозана F с лизосомами (Рис. 10).

Рис. 7. Мембранная локализация хитозанов А1 (А, В) и А2 (Б, Г) (зеленые) на клетках MDCK (А и Б) и внутриклеточная – на клетках макрофагов RAW 264.7 (В и Г) через 24 ч после внесения. Клетки окрашены ТМР-NN-813 (красный). Колокализация с митохондриями показана стрелками.

Лизосомы и митохондрии значительно отличаются друг от друга по рН. Показано, что митохондрии и лизосомы имеют оппозитные по отношению к нейтральному значения рН (8 и 5 соответственно). Поскольку мы обнаружили положительно заряженные хитозаны в митохондриях, а отрицательно заряженные – в лизосомах, то решили проверить, что происходит в этом случае с зарядом хитозанов. Инкубация хитозанов в буферах с рН 8 и 5 показала, что в обоих случаях хитозаны нейтрализуют свой заряд. Соответственно, можно сделать вывод, что клетки распределяют заряженные молекулы по органеллам, нейтрализуя суммарный локальный заряд.

Рис.8. Транспорт хитозанов (зеленый) с разной ММ А1 (А), В (Б), С (В) и D (Г) в макрофагальные клетки RAW264.7 через 48 ч после внесения. Частичная колокализация хитозанов с митохондриями (красный) дает желтый цвет.

Рис. 9. Митохондриальная локализация хитозана Е (А), но не хитозана F(Б) в клетках RAW264.7 через 48 ч после внесения. Хитозан Е локализуется в деполяризованных митохондриях, а хитозан F вызывает гиперполяризацию митохондрий, но в них не находится.

Рис. 10. Транспорт гидрофобизованных хитозанов (зеленый) в митохондрии (А и Б) или лизосомы (В и Г) зависит от заряда. Хитозан Е имеет положительный заряд и транспортируется клеткой в митохондрии (А). Хитозан F имеет отрицательный заряд и транспортируется в лизосомы (Г). Ядра окрашены Хехст (синий). Ко-локализации соответствуют желтые участки.

Митоптоз и экзоцитоз митохондрий. Последним этапом явилось определение дальнейшей судьбы хитозанов. Избыточное накопление хитозанов в клетке приводит к изменению заряда митохондрий. В случае накопления в митохондриях положительно заряженных хитозанов наблюдается снижение потенциала митохондрий и последующий из экзоцитоз (Рис. Отрицательно заряженный хитозан вызывал 11А). F гиперполяризацию митохондрий и их экзоцитозу (Рис.11Б). Изменение размера и потенциала митохондрий называется митоптозом.

Рис. 11. Экзоцитоз положительно заряженных хитозанов E (А и В) с деполяризованными митохондриями. Экзоцитоз хитозана F с лизосомами и параллельный экзоцитоз гиперполяризованных митохондрий (Б).

Мы показали, что митоптоз не приводит к гибели клеток, а вызывает экзоцитоз таких митохондрий. Процесс митоптоза регистрировался в культурах с хитозанами, способными проходить внутрь клеток (А1, В, С, D, Е и F), но не в культурах с хитозанами А2 и А3.

ВЫВОДЫ

Получена панель из 8 производных хитозана с молекулярными массами 1.

217, 50, 20 и 10 килодальтон, степенью дезацетилирования 90, 50 и 40%, положительным и отрицательным зарядами, а также гидрофобизованные производные, модифицированные остатками додеценовой кислоты. Получены флуоресцентные аналоги всех производных.

Показано связывание всех производных с мембранами клеток с 2.

выходом на плато в течение 4 часов. Связывание с клетками падало в ряду А1EА2=А3=В=С=D=F (p0.05).

Производные хитозана с низкой степенью дезацетилирования 3.

практически не проходят внутрь эпителиальных клеток, но фагоцитируются макрофагами.

С помощью фотоактивируемого красителя ТМР-NN-813 и трекеров 4.

органелл клетки показали, что отрицательно заряженные производные хитозана транспортируются клеткой в лизосомы, а положительно заряженные – в митохондрии, что связано с нейтрализацией заряда хитозана.

При длительной инкубации (48-72 ч) с положительно заряженными 5.

производными хитозана наблюдается гипополяризация митохондрий (митоптоз), а при инкубации с отрицательно заряженным производным – гиперполяризация митохондрий. Во всех случаях поглощение клетками заряженных производных хитозана приводило к экзоцитозу митохондоий и лизосом.

С помощью коммерческих трекеров органелл клетки было установлено, 6.

что транспорт ТМР-NN-813 зависит от времени инкубации. ТМР-NN-813 пассивно попадает в митохондрии уже через 5 минут, где накапливается в течении 10-30 мин, а затем распределяется по цитоплазме и мембранам клетки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для разработки систем доставки лекарств при патологиях, связанных с 1.

дисфункцией митохондрий, рекомендуется использовать положительно заряженный хитозан с высокой СД и ММ.

Для разработки систем доставки лекарств в цитоплазму клеток, 2.

например в опухоли, рекомендуется использовать отрицательно заряженные производные хитозана или наночастицы на их основе.

Рекомендуется использовать отрицательно заряженные производные 3.

хитозана для разработки систем для доставки вакцин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Новые флуоресцентные красители для окрашивания клеток животных / 1.

М.Н. Шапошников, Е.В. Свирщевская, А.А. Генералов, и др. // Современная ветеринарная медицина.- 2011.- № 1.- С. 24-25.

Фотоактивируемый флуоресцентный краситель для лазерной конфокальной 2.

микроскопии / М.Н. Шапошников, Е.В. Свиршевская, А.А. Генералов и др. // Конференция «XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии»: тезисы докладов.- Волгоград: ИУНЛ ВолгГТУ, 2011.- С. 436.

3. Study of intracellular chitosan traffic using caged thodamine derivative / A.

Generalov, M. Shaposhnikov, S. Zaitsev et al. // 10-th international conference of the European chitin society: theses.- St.P.: EUCHIS`11, 2011.- P. 106 Зависимость флуоресценции нового фотоактивируемого флуоресцентного 4.

красителя от параметров среды / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов и др.

// Фундаментальные исследования.- 2012.- № 9.- С. 322-327.

Определение локализации нового фотоактивируемого флуоресцентного 5.

красителя в культуре клеток А431 с помощью селективных флуоресцентных зондов / М.Н. Шапошников, С.Ю. Зайцев, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов и др. // Ученые записки казанской государственной академии ветеринарной медецины им. Н.Э. Баумана.- 2013.С. 483-488.

Генералов, А. А. Определение целевых органелл при внутриклеточном 6.

транспорте фотоактивируемого флуоресцентного красителя ТМР-NN-813 / А.А.

Генералов, С.Ю. Зайцев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии: сборник научных трудов ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.- 2014.- С. 329-330.

Генералов, А. А. Определение целевых органелл при внутриклеточном 7.

транспорте фотоактивируемого флуоресцентного красителя ТМР-NN-813 / А.А.

Генералов, С.Ю. Зайцев, Е.В. Свирщевская // Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию института биоорганической химии им. Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина Российской академии наук и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова: мат. науч.практ. конференции.- М.: ActaNaturae, 2014.- С. 20-21.

Анализ апоптоза с помощью фотоактивируемого красителя ТМР-NN-813 / 8.

А.А. Генералов, С.Ю. Зайцев, Г.В. Луценко и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2014.- № 3(49).- С. 16-17.





Похожие работы:

«Малышева Наталья Геннадьевна МИНИМАЛЬНЫЙ СТОК РЕК СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО РЕГИОНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 25.00.27 – гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата...»

«КРАЙНЕВА Олеся Владимировна СОСТАВ И СВОЙСТВА НЕФТИ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ФАКТОР ЗАГРЯЗНЕНИЯ ГЕОЛОГИЧЕСКОЙ СРЕДЫ И МЕТОДЫ ЕГО ОЦЕНКИ (на примере прибрежной зоны севера Тимано-Печорской провинции) Специальность 25.00.36 – Геоэкология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук г. Архангельск – 2014 год Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северный...»

«Селезнев Андриан Анатольевич Эколого-геохимическая оценка состояния урбанизированной среды на основе исследования отложений пониженных участков микрорельефа (на примере г. Екатеринбурга) Специальность 25.00.36 – «Геоэкология» (науки о Земле) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Екатеринбург – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт промышленной экологии Уральского отделения...»

«СЕМЕНЮК Павел Игоревич РАСТВОРЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АГРЕГАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 20 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» Научный...»

«Хорохорин Александр Евгеньевич Стратегия развития современных нефтехимических комплексов, мировой опыт и возможности для России. Специальность: 08.00.14. – Мировая экономика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Российском государственном университете нефти и газа им. И.М. Губкина доктор экономических наук, профессор Научный руководитель: член-корреспондент РАН Телегина Елена Александровна Официальные...»

«ЯКУШЕВ ВАДИМ АЛЕКСАНДРОВИЧ Биофармацевтическое исследование препаратов метопролола сукцината 14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология 14.04.02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Волгоград – 2015 Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Российский университет дружбы народов» («РУДН») Министерства образования и науки РФ,...»

«Сибиркина Альфира Равильевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В СОСНОВЫХ БОРАХ СЕМИПАЛАТИНСКОГО ПРИИРТЫШЬЯ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор М.С. Панин Омск, 2014 Работа выполнена на кафедре общей экологии Челябинского государственного университета Барановская Наталья Владимировна, Официальные доктор биологических наук, профессор...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 – Гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Волгоград – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» Федерального медико-биологического агентства (г. Волгоград) Научный консультант:...»

«ГЕТМАНСКИЙ ИЛЬЯ ВЛАДИМИРОВИЧ ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОИОНОВ НА ГИПЕРВАЛЕНТНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ ЭЛЕМЕНТОВ ВТОРОГО И ТРЕТЬЕГО ПЕРИОДОВ ТАБЛИЦЫ Д. И. МЕНДЕЛЕЕВА Специальность 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата...»

«ЕМЕЛЬЯНОВ АРТЁМ ИВАНОВИЧ ПОЛИМЕРНЫЕ МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИЕ НАНОКОМПОЗИТЫ НА ОСНОВЕ 1-ВИНИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛА Высокомолекулярные соединения 02.00.06 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского Отделения Российской Академии Наук Научный руководитель: Прозорова Галина Фирсовна доктор химических наук ФГБУН...»

«Арапиди Георгий Павлович ПОИСК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ БИОМАРКЕРОВ РАКА ЯИЧНИКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) кандидат химических наук Научный руководитель: Зиганшин Рустам...»

«Шахгильдян Георгий Юрьевич Фосфатные стекла, активированные наночастицами металлов и ионами редкоземельных элементов Специальность 05.17.11 – Технология силикатных и тугоплавких неметаллических материалов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2015 год Работа выполнена на кафедре химической технологии стекла и ситаллов Российского химико-технологического университета имени Д. И. Менделеева Научный руководитель: доктор химических...»

«КОРОЛЬКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА КОЛЛОИДНО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНТМОРИЛЛОНИТ-ИЛЛИТОВЫХ ГЛИН, АКТИВИРОВАННЫХ СОЛЕВЫМИ РАСТВОРАМИ Специальность 02.00.11. – Коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Белгород – 2012 www.sp-department.ru Работа выполнена в Федеральном государственном автономном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» доктор...»

«Херрера-Альварадо Луис Андрес РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ НЕФТЕШЛАМОВ НА ТЕРРИТОРИИ МЕСТОРОЖДЕНИЯ AUCA – EP PETROECUADOR В ЭКВАДОРЕ 03.02.08 – Экология (в химии и нефтехимии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Эквадорской государственной нефтяной компании EP – PETROECUADOR и в ФГБОУ ВПО «Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина» на кафедре...»

«ТОРРЕС МИНЬО КАРЛОС ХАВЬЕР ОЦЕНКА СОРТОВ АМАРАНТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ ЛИСТОВОЙ БИОМАССЫ Специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений 06.01.09 овощеводство Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук МОСКВА 2015 Диссертационная работа выполнена в отделе физиологии и биохимии растений Федерального Государственного...»

«Бусько Александр Евгеньевич ДУГОВОЙ СЦИНТИЛЛЯЦИОННЫЙ АТОМНО-ЭМИССИОННЫЙ АНАЛИЗ С МНОГОКАНАЛЬНЫМ АНАЛИЗАТОРОМ ЭМИССИОННЫХ СПЕКТРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗОЛОТА, СЕРЕБРА, ПЛАТИНЫ И ПАЛЛАДИЯ В ГЕОХИМИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ Специальность 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иркутск – 2015 -2Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт геохимии им. А.П. Виноградова Сибирского отделения...»

«Толстунов Михаил Игоревич КРИСТАЛЛОХИМИЧЕСКИЕ, РАЗМЕРНЫЕ И ПОЛЕВЫЕ ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ ФАЗ В КЕРАМИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ЦИРКОНАТА СВИНЦА Специальность 02.00.01 – неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Краснодар – 2015 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет» Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Лупейко Тимофей Григорьевич Официальные...»

«ЛЮБИМЕНКО ВАЛЕНТИНА АЛЕКСАНДРОВНА МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И КВАНТОВОХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЁТЫ В ИЗУЧЕНИИ ПРОЦЕССОВ НЕФТЕПЕРЕРАБОТКИ И НЕФТЕХИМИИ 05.17.07 – Химия и технология топлива и высокоэнергетических веществ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина» Научный консультант: доктор химических наук, профессор Винокуров Владимир...»

«КАЩЕЕВА Полина Борисовна СОЗДАНИЕ НОВЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНЫХ СРЕД ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 03.02.08 – Экология (химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва 201 Работа выполнена на кафедре общей и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина» Научный руководитель: Дедов Алексей Георгиевич член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор...»

«Буряк Илья Алексеевич Спектроскопические проявления слабых межмолекулярных взаимодействий в атмосферных газах 02.00.04 – «физическая химия» 02.00.17 – «математическая и квантовая химия» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва — 2013 Работа выполнена на Химическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова и в Институте физики атмосферы имени А.М. Обухова РАН Научные руководители: доктор физико-математических наук, ведущий...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.