WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

«Новые подходы к созданию и экспериментальному изучению препаратов на основе противоопухолевых ферментов Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

На правах рукописи

Покровский Вадим Сергеевич

Новые подходы к созданию и экспериментальному

изучению препаратов на основе противоопухолевых

ферментов

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук



14.01.12. Онкология

03.01.04. Биохимия

Научный консультант:

Проф., д.м.н. Е.М. Трещалина Москва Оглавление Сокращения и условные обозначения

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личный вклад автора

Структура диссертации

Публикации

Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов.

Обзор литературы

1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот

1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.)

1.1.2. L-аргининдеиминаза (КФ 3.5.3.6.)

1.1.3. L-метионин–-лиаза (КФ 4.4.1.11.)

1.1.4. Оксидазы L-аминокислот

1.1.5. L-фенилаланин:аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.5)

1.1.6. Тирозин-фенол-лиаза (КФ 4.1.99.2)

1.2. Рибонуклеазы

1.2.1. Ранпирназа (онконаза)

1.2.2. Амфиназа

1.2.3. Биназа

1.3. Современные подходы к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов

1.3.1. Поиск перспективных субстанций

1.3.2. Разработка методов выделения субстанции в препаративном количестве.................. 33 1.3.3. Оценка физико-химических и кинетических свойств ферментов

1.3.4. Оценка антипролиферативной активности ферментов

1.3.5. Поиск способов оптимизации терапевтических характеристик

1.3.6. Оценка элементов фармакокинетики

1.4. Актуальность разработки новых подходов к поиску и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Изученные ферменты и их источники

2.2. Реактивы

2.3. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов

2.4. Наработка биомассы и очистка L-аспарагиназ

2.5. Определение ферментативной активности

2.6. Определение физико-химических свойств

2.7. Исследования зависимости «структура-функция»

2.8. Оценка цитотоксичности

2.9. Оценка специфической противоопухолевой активности

2.10. Оценка токсичности

2.11. Оценка элементов фармакокинетики

2.12. Оценка иммуногенности

2.13. Статистическая обработка

Глава 3. Экспериментальные подходы к созданию и отбору продуцентов ферментов.

....... 64

3.1. Новый метод отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ

3.2. Создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ

3.2.1. Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis

3.2.2. Создание штамма продуцента L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum

3.2.3. Создание продуцентов мутантных форм L-аспарагиназы R. rubrum

3.3. Выделение и очистка полученных L-аспарагиназ

3.3.1. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы Y. pseudotuberculosis

3.3.2. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы R. rubrum

Глава 4. Физико-химические и кинетические характеристики полученных ферментов.

............. 81

4.1. Оптимальные условия протекания ферментативных реакций

4.1.1. Оптимумы рН и температуры новых L-аспарагиназ

4.2. Чувствительность к химической и температурной денатурации

4.2.1. Стабильность полученных L-аспарагиназ





4.3. Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ

Глава 5. Отдельные биологические характеристики полученных ферментов

5.1. Антигенные свойства и перекрестная иммуногенность новых L-аспарагиназ

5.1.1. IgG-иммунный ответ

5.1.2. IgМ-иммунный ответ

5.1.3. Перекрестная иммуногенность L-аспарагиназ

5.2. Основные фармакокинетические параметры

5.2.1. Элементы фармакокинетики L-лизин--оксидазы у мышей

5.2.2. Прогнозирование фармакокинетических параметров L-лизин--оксидазы у человека

5.2.3. Элементы фармакокинетики L-метионин–-лиаз у мышей

5.2.4. Стабильность L–метионин--лиаз в плазме крови человека

Глава 6. Прескрининг на культурах опухолевых клеток новых ферментов различной природы

6.1. Цитотоксичность новых L-аспарагиназ

6.2. Цитотоксичность L-метионин–-лиаз из новых источников

6.3. Цитотоксичность L-фенилаланин:аммиак-лиазы Rhodosporidium toruloides............... 106

6.4. Цитотоксичность L-лизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai.............. 107

6.5. Цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius

6.1.6. Отбор ферментов на основании данных прескрининга

Глава 7. Противоопухолевая активность новых ферментов различной природы и механизма действия

7.1. Скрининг противоопухолевой активности отобранных ферментов

7.1.1. Скрининг и диапазон терапевтических доз новых L-аспарагиназ

7.1.2. Оценка антипролиферативной активности in vivo L-фенилаланин:аммиак-лиазы... 115 7.1.3. Оптимизация схемы внутривенного введения противоопухолевого фермента Lлизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai

7.1.4. Спектр чувствительных опухолей к L-лизин–альфа-оксидазе Trichoderma cf.

aureoviride Rifai

7.1.5. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius

7.2. Доклиническое изучение новых ферментов на подкожных ксенографтах опухолей человека у иммунодефицитных мышей

7.2.1. Спектр противоопухолевой активности L-лизин–альфа-оксидазы

7.2.2. Противоопухолевая активность иммуноРНКазы 4D5 scFv-дибарназы

7.2.3. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы)........... 130

7.3. Разработка модели для доклинической оценки противоопухолевого эффекта L-метионин–

-лиаз

7.4. Доклиническое изучение in vivo эффективности и переносимости комбинаций с L-лизинальфа-оксидазой

7.4.1. Оценка «острой» токсичности L-лизин-альфа-оксидазы и препаратов для комбинаций

7.4.2. Эффективность и переносимость комбинации иринотекана с L-лизин-альфаоксидазой

7.4.3. Эффективность и переносимость комбинации цисплатин + L-лизин-альфа-оксидаза

7.4.4. Эффективность и переносимость комбинированной терапии этопозид + L-лизинальфа-оксидаза

Глава 8. Новые аспекты изучения механизмов действия и прогнозирования биологической активности ферментов

8.1. Оценка взаимосвязей «структура-функция» с использованием сайт-направленного мутагенеза L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum

8.2. Взаимосвязь между антипролиферативной и ферментативной активностью.............. 155 8.2.1. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта Lаспарагиназ

8.2.2. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта Lметионин–-лиаз

8.3. Прогнозирование иммуногенности и анализ структуры эпитопов L-аспарагиназ....... 165

8.4. Влияние L-метионин–-лиазы на отдельные звенья механизма индукции апоптоза.. 169 Глава 9. Обсуждение полученных данных с оценкой перспектив поиска и экспериментального изучения ферментов с противоопухолевой активностью

9.1. Поиск и создание ферментов с противоопухолевой активностью

9.2. Анализ выбора продуцента фермента

9.3. Прогнозирование антипролиферативной активности на основании кинетических характеристик фермента

9.4. Прогнозирование основных фармакокинетических параметров противоопухолевого фермента у человека на основе данных in vivo

9.5. Оценка очередности использования ферментных препаратов одной группы с учетом перекрестной иммуногенности

9.6. Алгоритм экспериментального изучения антипролиферативной активности потенциальных противоопухолевых ферментов

9.7. Особенности выбора препаратов для комбинированного применения с противоопухолевыми ферментами

9.8. Новые подходы к экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов....... 187 Выводы

Практические рекомендации

Благодарности

Литература

Сокращения и условные обозначения

ADI — L-arginine deiminase, L-аргининдеиминаза ASS1 — argininosuccinate synthetase, аргининосукцинат синтаза DONV — диазо-4-окси-L-норвалин EcA — Escherichia coli L-asparaginase, L-аспарагиназа E. сoli II типа EMA — European Medicines Agency ErA — Erwinia chrysathemi L-asparaginase II типа EwA — Erwinia carotovora L-asparaginase II типа FGF — fibroblast growth factor, фактор роста фибробластов HpA — Helicobacter pylori L-asparaginase II типа IC50 — index of cytotoxicity, концентрация, ингибирующая рост клеток в культуре, на 50% ICH — International Conference on Harmonisation IFNAR — interferon alpha/beta receptor, рецепторы интерферона / Km — константа Михаэлиса LAAO — L-aminoacid oxidase, оксидазa L-аминокислот LD50 — средне-смертельная доза (доза, вызывающая гибель 50% животных) LLC — Lewis lung carcinoma, эпидермоидная карцинома легкого Льюис LO — L-lysine-alpha-oxydase, L-лизин-альфа-оксидаза MGL — L-methionine–gamma-lyase, L-метионин–гамма-лиаза PAL — L-phenylalanine ammonium-lyase, L-фенилаланин:аммиак-лиаза RrA — Rhodospirillum rubrum L-asparaginase, L-аспарагиназа R. rubrum I типа T1/2 — период полувыведения WsA — Wolinella succinogenes L-asparaginase, L-аспарагиназа W. succinogenes II типа WsA-Hep — биомодифицированная L-аспарагиназа W. succinogenes II типа YpA — Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase, L-аспарагиназа Y. pseudotuberculosis II типа БСА — бычий сывороточный альбумин ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ГЛФ — готовая лекарственная форма ГСПГ — гепарансульфатсодержащие протеогликаны ДИ — доверительный интервал ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА — иммуноферментный анализ МЕ — международная единица МСК — мезенхимальные стромальные клетки НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого ОЕ — оптическая единица ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз ОП — оптическая плотность ПЖ — продолжительность жизни ПЛФ — пиридоксальфосфат ПО — программное обеспечение ПЦР — полимеразная цепная реакция ПЭГ — полиэтиленгликоль (PEG) СПЖ — средняя продолжительность жизни РНК — рибонуклеиновая кислота ТРО — торможение роста опухоли УПЖ — увеличение продолжительности жизни ЦНС — центральная нервная система в/бр — внутрибрюшинно в/в — внутривенно в/м — внутримышечно п/к — подкожно Введение Актуальность темы исследования На сегодняшний день эффективность системной лекарственной терапии в клинической онкологии, позволяющей улучшить показатели отдаленной выживаемости больных раком, остается недостаточной [16, 17, 307]. За последние годы не произошло кардинального улучшения отдаленных результатов лечения. Это связано, прежде всего с тем, что лишь немногие из противоопухолевых агентов зарегистрированы в качестве лекарственных средств и вошли в стандартные схемы лечения. Неудачи терапии онкологических заболеваний, как правило, связаны с отсутствием у новых препаратов преимуществ перед существующими, низкой селективностью действия или трудоемкостью их создания. Немаловажную роль играет и традиционное отставание применения научных знаний в клинической практике. Все это происходит на фоне постоянно растущей онкологической заболеваемости. Вышесказанное определило поиск новых мишеней и подходов к созданию инновационных лекарственных средств, особенно для лечения труднокурабельных и диссеминированных опухолей. Таким образом, разработка новых подходов к созданию и экспериментальному изучению ферментов, проявляющих противоопухолевую активность, с оригинальным механизмом действия является, несомненно, актуальным решением важной проблемы фундаментальной и практической науки в области биомедицины, и, в частности, онкологии и биохимии.

Степень разработанности темы исследования В последнее время накопилось много данных о ферментах с потенциальной противоопухолевой активностью, которые требуют обобщения, систематизации и выявления закономерностей противоопухолевого действия для построения перспективной стратегии поиска и изучения новых кандидатов с целью создания на их основе противоопухолевых препаратов. Анализ литературы позволяет считать, что результативная разработка новых противоопухолевых ферментов невозможна без использования достижений различных дисциплин: биохимии и химии, биологии, биотехнологии и микробиологии, генетики и физиологии, фармакологии и онкологии.

Изменение стратегии поиска новых кандидатов, благодаря фундаментальным достижениям молекулярной биологии и экспериментальной онкологии, привело к трансформации эмпирического подхода в направленный скрининг для мишень-ориентированной (таргетной) терапии. Развитие направленного скрининга имеет целью максимально индивидуализировать лечение путем блокирования ключевых ферментов пролиферации и сопряженных с ней процессов метаболизма клетки. Однако первоначальный оптимизм, связанный с появлением таргетных препаратов, сменился чередой разочарований в силу несостоятельности такой монотерапии при быстропрогрессирующих опухолях. Например, такие таргетные препараты, как гефитиниб (селективный ингибитор тирозинкиназы рецепторов эпидермального фактора роста HER-1), типифарниб (ингибитор фарнезилтрансферазы), бортезомиб (ингибитор антиапоптотических сигнальных путей маримастат (ингибитор матриксных bcl-2), металлопротеиназ), темсиролимус (ингибитор m-TOR) оказались неэффективными при мелкоклеточном раке легкого [154, 205, 236, 299]. В настоящее время стало понятно, что таргетные препараты не способны кардинально решить проблему лечения малочувствительных к химиотерапии (мезотелиома плевры, саркома мягких тканей, рак поджелудочной железы) и диссеминированных опухолей различных локализаций.

При таком развитии событий в мире возобновился интерес к группе препаратов с биохимическим механизмом действия — противоопухолевым ферментам, известными представителями которого были нативная и модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) Lаспарагиназы E. coli (EcA) и Erw. carotovora (ErA). Попытки создания новых ферментных препаратов были направлены на расширение спектра противоопухолевого действия и улучшение терапевтических характеристик ферментов. Предполагалось, что поиск новых источников и разработка рекомбинантных и структурно модифицированных ферментов могут быть результативными. Действительно, в последнее время несколько новых препаратов ферментов достигли этапа клинических испытаний. Так, по данным сайта clinicaltrials.gov в 2015 году пегилированная L-аргинин дезиминаза (ADI-PEG 20) проходит клинические исследования по 11 протоколам I–III фазы при разных локализациях, в т.ч. в комбинации с цисплатином и пеметрекседом. Одобрен ряд клинических протоколов с ранпирназой (новой рибонуклеазой) при мезотелиоме плевры [100, 229].

Возобновление интереса к противоопухолевым ферментам позволяет в новом свете взглянуть на преимущества и недостатки, отличающие их как от «классических» цитостатиков, так и от таргетных препаратов. Среди преимуществ очевидными являются:

оригинальный механизм действия и относительно высокая специфичность по отношению к конкретному молекулярному субстрату;

наличие достоверных биологических маркеров, позволяющих прогнозировать клиническую эффективность, например, отсутствие аргининосукцинат синтазы (ASS1) в опухолевых клетках;

отсутствие традиционной для классических цитостатиков лимитирующей токсичности (например, выраженной миелосупрессии), что позволяет включать их в многокомпонентные схемы высокодозной комбинированной химиотерапии.

Среди недостатков следует подчеркнуть специфику биологических свойств действующих веществ, прежде всего, белковую природу. В отличие от иммуноглобулинов для ферментных препаратов не существует простых и однозначных культуральных тестов in vitro для моделирования взаимодействия с субстратом (по примеру взаимодействия «антигенантитело»), что особенно справедливо для рибонуклеаз. В результате возникает проблема поиска релевантной модели для демонстрации антипролиферативного эффекта и механизма действия, основанных на метаболической неполноценности потенциальных клеток-мишеней.

Необходимо также выделить ряд факторов, требующих обособлять ферменты от других групп противоопухолевых препаратов и создавать оригинальные протоколы изучения их антипролиферативного действия. Экзогенные ферменты являются чужеродными для человека белками и проявляют выраженные антигенные свойства, что предопределяет гуморальный ответ, обусловливает аллергенность, возможность развития анафилактических реакций и быструю наработку иммунологической резистентности. Даже при сохранении первичной структуры изменение пространственной конформации фермента может привести к потере специфической активности. Еще одна трудность заключается в том, что на активность ферментов существенно влияют наличие протеаз и различные изменения факторов внешней среды (pH, температура, состав плазмы крови). В связи с этим поиск и внедрение новых противоопухолевых ферментов в клиническую практику до сих пор остаются не вполне успешными. Совершенствование технологий получения рекомбинантных белков решило проблему получения целевого белка в препаративных количествах, однако не облегчило последующее изучение специфической противоопухолевой активности, а также других необходимых этапов экспериментального исследования потенциальных кандидатов.

В основе антипролиферативного действия ферментов лежат фундаментальные характеристики лекарственной субстанции, определяющие важнейшие терапевтические свойства будущего лекарства: спектр активности, избирательность антипролиферативного действия, совместимость с препаратами другого механизма действия при комбинированной химиотерапии и др. Уникальные биологические свойства ферментов диктуют необходимость разработки индивидуальной программы их получения и экспериментальной оценки.

Перечисленные факторы важны также для разработки современных подходов к доклиническому изучению новых противоопухолевых ферментов.

Цель и задачи исследования Цель работы — разработка новых методических подходов к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов.

Задачи:

1. Разработка нового метода отбора штаммов-продуцентов нативных и мутантных форм Lаспарагиназ из разных источников.

2. Изучение физико-химических и биологических свойств ферментов различного механизма действия, полученных с использованием новых методов: сайт-направленный мутагенез, конъюгация с биологически активными пептидами и фрагментами антител.

3. Разработка новых методов прогнозирования биологически значимых фармакологических характеристик ферментов, расщепляющих аминокислоты, на основе их физико-химических и кинетических характеристик.

4. Разработка новой модели для изучения in vivo противоопухолевой активности пиридоксальзависимых ферментов на примере L-метионин–-лиаз (MGL).

5. Оценка перспективности доклинического изучения новых кандидатов: Lфенилаланин:аммиак-лиазы (PAL), ряда L-метионин–-лиаз, нативных и химерных рибонуклеаз из различных источников путем скрининга in vitro и in vivo.

6. Разработка оптимальной схемы применения (LO) на основе L-лизин–-оксидазы фармакологических характеристик in vitro и in vivo.

Загрузка...

7. Оценка терапевтического преимущества комбинированной терапии с LO при лечении солидных опухолей.

8. Выявление особенностей противоопухолевого, иммуногенного действия и фармакокинетических характеристик, сравнительная оценка перспективности ферментов различной природы: L-аспарагиназ, L-метионин–-лиаз, L-лизин–-оксидазы.

9. Совершенствование методических основ поиска и экспериментального изучения новых ферментных противоопухолевых препаратов.

Научная новизна

Впервые получен ряд продуцентов новых рекомбинантных L-аспарагиназ из Yersinia pseudotuberculosis, Rhodospirillum rubrum и их мутантных форм.

Впервые охарактеризованы физико-химические и антипролиферативные свойства новых рекомбинантных L-аспарагиназ Yersinia pseudotuberculosis, Rhodospirillum rubrum, Wolinella succinogenes а также их мутантных и химерных форм.

Впервые предложен принципиально новый методический подход для отбора на плотной среде активных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ различного происхождения.

Впервые выявлено наличие антипролиферативного эффекта у внутриклеточной Lаспарагиназы I типа.

Впервые охарактеризованы особенности антипролиферативного эффекта ряда ферментных препаратов различного происхождения in vitro и in vivo: MGL, PAL, рибонуклеаз различного происхождения.

Впервые разработана модель in vivo для изучения противоопухолевой активности ПЛФзависимых ферментов из различных источников.

Впервые разработана терапевтическая схема внутривенного (в/в) введения LO на опухолевых моделях in vivo, охарактеризованы эффективные и переносимые дозы.

Впервые разработаны схемы полихимиотерапии с включением LO на различных опухолевых моделях in vivo, охарактеризованы эффективные переносимые дозы и режимы применения.

Впервые обоснованы и апробированы новые методики изучения биологически значимых характеристик противоопухолевых ферментов из разных источников: исследование перекрестной иммуногенности ферментов с общим механизмом действия; прогнозирование фармакокинетических параметров у человека на основании данных фармакокинетики у животных; прогнозирование противоопухолевого эффекта на основании каталитических свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы Сформулированные положения о технологических, биохимических и биологических особенностях противоопухолевых ферментов различной природы создают основу для прогресса в практике создания и экспериментального изучения новых противоопухолевых ферментов различной природы.

Обобщены и проанализированы данные об известных и применяемых в клинической практике ферментах, а также новых потенциальных кандидатах для создания лекарственных препаратов.

Оптимизированные ферменты из группы L-аспарагиназ могут быть использованы для создания одноименных препаратов с улучшенными терапевтическими свойствами, способных заменить EcA или ErA в 1-й или во 2-й линии терапии при развитии к ним иммунологической резистентности у пациентов с гемобластозами. Схемы комбинированной химиотерапии с включением LO направлены на создание новых комбинаций противоопухолевых препаратов, ориентированных на лечение солидных опухолей, в т.ч. рака толстой кишки. Биохимические и биологические характеристики новых MGL, PAL и рибонуклеаз различного происхождения позволяют оценить клиническую перспективность этих групп ферментов.

Предложенные новые методы отбора продуцентов, создания мутантных белков, изучения перекрестной иммуногенности, фармакокинетики, эффективности и переносимости схем комбинированной терапии с включением ферментных препаратов, подходы и рекомендации расширяют возможности использования ферментов в онкологии.

Результаты настоящего исследования использованы на Федеральном уровне в методических рекомендациях «Разработка технических требований к технологиям разработки инновационных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний» (Министерство промышленности и торговли РФ, «5.

5 Онкотребования 2011»); в деятельности рабочей группы Министерства образования и науки РФ по рассмотрению тематики работ в рамках мероприятий 5 «Доклинические исследования инновационных лекарственных средств» и 22 «Разработка новых образовательных программ и образовательных модулей для профильных высших и средних специальных учебных заведений» ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».

Методология и методы исследования В экспериментальной части работы использованы как стандартные методы молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и экспериментальной онкологии, так и принципиально новые методы, предложенные и апробированные в рамках настоящего исследования.

Стандартные подходы использованы для конструирования новых штаммов-продуцентов ферментов, создания мутантных форм L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum, изучения физикохимических свойств, ферментативной активности, кинетических характеристик, цитотоксической активности, противоопухолевой активности, переносимости ферментов, а также статистической обработки данных. Новые методы и модели применены для отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ, изучения перекрестной иммуногенности L-аспарагиназ, изучения зависимостей «структура-функция» для L-аспарагиназ I типа методом сайтнаправленного мутагенеза, элементов фармакокинетики LO и MGL, антипролиферативного эффекта MGL, прогнозирования антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ на основании кинетических характеристик, изучения эффективности комбинированной терапии c LO.

Положения, выносимые на защиту

1. Созданы рекомбинантные продуценты и выделены в препаративных количествах новые бактериальные L-аспарагиназы из Yersinia pseudotuberculosis II типа и Rhodospirillum rubrum I типа, а также ряд их мутантных форм. Методом сайт-направленного мутагенеза установлены функционально-значимые аминокислотные остатки L-аспарагиназы I типа Rhodospirillum rubrum, ответственные за реализацию ферментативной активности.

2. Разработан новый комплексонометрический метод определения аспарагиназной активности на плотной среде, который позволяет выявлять активные штаммы-продуценты L-аспарагиназ с удельной активностью 0,1 МЕ/мг белка.

3. Новые L-аспарагиназы: из Wolinella succinogenes II типа, нативная и конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом, из Rhodospirillum rubrum I типа и из Yersinia pseudotuberculosis II типа обладают достоверной антипролиферативной активностью на моделях in vitro и in vivo.

В ряду изученных L-аспарагиназ II типа существует достоверная прогностическая значимость L-аспарагиназной активности для проявления антипролиферативной активности. Оптимальной для применения во второй линии терапии после L-аспарагиназы E. coli из изученных является типа, нативная или конъюгированная с L-аспарагиназа Wolinella succinogenes II гепаринсвязывающим пептидом.

4. Модель эпидермоидной карциномы легкого Льюис с дополнительным внутрибрюшинным (в/бр) введением пиридоксина может быть использована для оценки противоопухолевого эффекта L-метионин–-лиаз. Наиболее благоприятным фармакокинетическим профилем и уровнем антипролиферативного эффекта среди изученных L-метионин–-лиаз обладает Lметионин–-лиаза Clostridium sporogenes.

5. Для L-лизин--оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D эмпирически разработана безопасная и эффективная схема многократного в/в введения мышам с нагрузочной и поддерживающими дозами (дискретный режим). Среди изученных схем комбинированной терапии с L-лизин–-оксидазой наиболее эффективно сочетание L-лизин–-оксидазы с иринотеканом.

6. Химерные иммуноРНКазы, состоящие из мини-антител (антиген-связывающих одноцепочечных вариабельных фрагментов антител, scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens — барназы, обладают достоверным противоопухолевым эффектом. Более высокий эффект конъюгата 4D5 scFv-дибарназы по сравнению только с мини-антителами 4D5 scFv свидетельствует о наличии существенного вклада ферментативной активности в реализацию противоопухолевого эффекта.

7. Установлено, что использование модифицированного иммуноферментного метода и прямого определения активности для расчета основных фармакокинетических параметров L-лизин–оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D при в/в введении дает сопоставимые результаты.

8. Установлена значимая антипролиферативная активность in vitro L-фенилаланин:аммиаклиазы Rhodosporidium toruloides, in vivo рибонуклеазы Bacillus intermedius.

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях:

1. V молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 26–27 октября 2009 г.

2. X Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 22–23 марта 2011 г.

3. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г.

4. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва, 14–17 ноября 2011 г.

5. Заседание Ученого совета НИИ ЭДИТО ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН 24 января 2012 г.

6. 23th International Congress of Anti-Cancer Treatment, Paris, 31 January–2 February 2012.

7. XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 23–27 апреля 20 г.

8. 22nd Biennial Congress of the EACR, Barcelona, 7–10 July 2012.

9. Заседание Объединенного Ученого совета ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН 15 апреля 2013 г.

10. 38th FEBS Congress, St. Petersburg, 6–11 July 2013.

Личный вклад автора Автором определено научное направление, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения, в том числе методические подходы к оптимизации получения активных субстанций, обобщены и интерпретированы полученные результаты. Лично автором проведены эксперименты по оценке физико-химических и противоопухолевых свойств всех изученных ферментов. В соавторстве проведены эксперименты по созданию рекомбинантных штаммов-продуцентов и биоинформатическая часть работы.

Структура диссертации Диссертационная работа изложена на 221 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 6 глав c описанием результатов исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 375 источников, из них 40 отечественных и 335 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 40 рисунками и 62 таблицами.

Публикации По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, из них 7 за рубежом, 21 научная статья в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, получено 3 патента РФ.

Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов.

Обзор литературы Благодаря успехам биохимии и биотехнологии все более широкое применение в клинической медицине находят белковые препараты с ферментативной активностью, отличающиеся по механизму и разнообразию действия от традиционных препаратов, используемых в онкологии.

Уже более 50 лет они используются для заместительной терапии при недостаточности поджелудочной железы, для ускорения заживления ран, в качестве тромболитиков, а также для лечения злокачественных новообразований.

Первым бактериальным ферментом со специфическим действием на опухолевые клетки, нашедшим применение в клинической онкогематологии, стала L-аспарагиназа. В настоящее время для лечения больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) успешно применяются препараты нативной и иммобилизованной L-аспарагиназы из различных бактериальных источников (EcA и ErA, пегилированная EcA). Помимо этого, получены доказательства противоопухолевой активности и ряда других ферментов различного происхождения:

пегилированной аргининдезиминазы (ADI), ранпирназы, MGL и др. Таким образом, для онкологии остается актуальной задача создания противоопухолевых препаратов на основе ферментов из различных источников с исследованием их биохимических свойств и молекулярных механизмов действия.

1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот Применение противоопухолевых ферментных препаратов, участвующих в метаболизме определенных аминокислот, основано на традиционном представлении об отсутствии или низкой активности определенных синтетаз аминокислот в опухолевых клетках. Среди представителей этой группы L-аспарагиназы, L-лизин-альфа-оксидазы (LO), MGL, ADI и др.

1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.) История обнаружения противоопухолевых свойств L-аспарагиназы связана с именем J. Kidd, который в 1953 г. впервые показал, что сыворотка крови морских свинок способна тормозить рост лимфосаркомы Гарднера у мышей С3Н [188]. В 1961 г. J. Broome выделил из сыворотки морских свинок сам фермент и установил, что именно с ним связано ее противоопухолевое действие [83]. Впоследствии был предположен основной механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ, который заключается в торможении синтеза белка вследствие гидролиза аспарагина в плазме крови с образованием аспарагиновой кислоты и аммиака (1).

Наиболее чувствительными к аспарагиназе оказались лимфобластные клетки, лишенные аспарагинсинтетазы и, соответственно, неспособные, в отличие от здоровых клеток, к самостоятельному синтезу L-аспарагина.

(1) Однако существуют доказательства того, что противоопухолевое действие L-аспарагиназ не ограничивается только лишь снижением уровня свободного L-аспарагина [53], но имеются также и более специфические механизмы прямого воздействия на опухолевые клетки, заключающиеся в гидролизе связанного L-аспарагина в составе гликопротеиновых клеточных рецепторов. Известно, что на поверхности многих клеток гемобластозов присутствует увеличенное количество мембранных рецепторов, таких как CD19, CD40, IGF-R, значительно повышающих их чувствительность к действию митогенов различной природы. Данные рецепторы, связываясь со своими лигандами, обусловливают усиление роста и пролиферации опухолевых клеток [53; 216]. Между тем, многие из этих рецепторов представляют собой гликопротеиновые комплексы, в которых белковая часть объединена с N-гликозидной через пептидный спейсер (подобен пептидному мостику N-ацетилмурамовой кислоты), обогащённый амидными группами L-аспарагина [53; 133]. Полученные данные позволяют предполагать, что L-аспарагиназа не только разрушает свободный L-аспарагин в окружении опухолевых клеток, но также, возможно, способна расщеплять аспарагин в составе пептидных спейсеров гликопротеиновых рецепторов опухолевых клеток [133]. Рецепторы с отщеплённой подобным образом гликозидной частью не способны связываться с соответствующими лигандамимитогенами и стимулировать пролиферацию, что может объяснять еще один вероятный специфический механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ.

Исследования in silico показали высокий уровень гомологии (до 49%) нуклеотидных последовательностей генов L-аспарагиназ и интерферонов из различных биологических источников. Эти данные позволяют предположить, что L-аспарагиназы, наряду с ферментативным действием, могут обладать также механизмом специфического цитокинового действия. Данный механизм можно охарактеризовать как интерфероноподобный эффект, который, по всей видимости, может выражаться в способности взаимодействовать с рецепторами к интерферонам (interferon alpha/beta receptor (IFNAR)), приводя к индукции внутриклеточных ингибиторов целого ряда циклинзависимых киназ (Cdk) и их активных комплексов. Взаимодействие с IFNAR приводит к усилению экспрессии p38 MAP-киназы, активно фосфорилирующей белок р57 (Kip2) по остатку Thr143. В результате такого фосфорилирования в значительной степени возрастает блокирующее сродство р57 к комплексу Cyclin A/Cdk2, что влечёт за собой остановку деления клеток в фазе G1 жизненного цикла [153]. Совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролиферативного действия L-аспарагиназ, ведущая роль в котором все же принадлежит расщеплению L-аспарагина. Реальный вклад каждого механизма в реализацию противоопухолевого эффекта пока остается недостаточно выясненным, в опубликованных работах также нет доказательства прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью L-аспарагиназ.

В экспериментальных исследованиях 1970-х годов была выявлена наиболее чувствительная опухоль мышей — лимфаденоз Фишера L5178Y. Эта модель стала сигнальной для первичной оценки противоопухолевого действия новых препаратов L-аспарагиназы in vivо [38]. Начиная с 70-х годов прошлого века и по настоящее время EcA используется в составе схем комбинированной индукционной химиотерапии при ОЛЛ. В последние годы появились сообщения об ее эффективности в комбинированной терапии NK/T-клеточной и кожной Тклеточной лимфом [172, 254, 363].

Исследования последних лет направлены на минимизацию выявленных в ходе клинического применения недостатков существующих препаратов иммуногенности,

L-аспарагиназ:

отдельных побочных эффектов, а также предупреждение формирования лекарственной резистентности при повторных курсах. С этой целью исследуются L-аспарагиназы из новых источников, а также модифицированные (конъюгированные с другими макромолекулами или мутантные) формы известных ферментов.

Минимизация L-глутаминазной активности L-аспарагиназ. Помимо расщепления L-аспарагина большинство бактериального происхождения также способны к L-аспарагиназ дезаминированию L-глутамина. При этом многие авторы полагают, что именно с Lглутаминазной активностью связаны гепатотоксичность, нарушения свертываемости крови и угнетение центральной нервной системы (ЦНС) [256, 278, 340, 345]. Это обусловлено тем, что в основном пути биосинтеза L-аспарагина в клетках млекопитающих (из аспарагиновой кислоты при участии аспарагинсинтетазы) донором амидной группы является L-глутамин [349]. Таким образом, снижение концентрации L-глутамина лишает нормальные клетки возможности избежать токсического действия фермента путем внутриклеточного синтеза L-аспарагина.

На культуре гепатоцитов крысы показано, что EcA вызывает угнетение синтеза белка, которое сопровождается пропорциональным снижением внутриклеточной концентрации L-глутамина [340]. В клинических исследованиях было установлено, что через 1 ч после в/в введения EcA больным ОЛЛ концентрация L-глутамина плазмы крови уменьшалась до 5% от исходного значения. Это позволило ряду авторов предположить, что угнетение синтетической функции печени коррелирует с L-глутаминазной активностью [256]. Этой гипотезе отвечают результаты доклинического изучения L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WsA), лишенной Lглутаминазной активности, продемонстрировавшей, в отличие от отсутствие EcA, гепатотоксичности или иммуносупрессивного эффекта in vivo [69, 112]. Позднее было установлено, что угнетение синтеза белка в печени и селезенке после применения EcA коррелирует с содержанием фосфорилированного трансляционного фактора eIF2 [278].

Существуют предположения, что нейротоксичность препаратов L-аспарагиназ так же, как и гепатотоксичность, связана с образованием кислоты, повышенная L-глутаминовой концентрация которой может оказывать угнетающее воздействие на ЦНС [316]. Показано, что через 24 ч после введения EcA мышам концентрация глутаминовой кислоты в плазме крови может возрастать в 6 раз [280]. Эти предположения подтверждаются результатами I фазы клинического изучения фермента из Acinetobacter, обладающего высокой L-глутаминазной активностью: нейротоксичность аспарагиназы-глутаминазы проявляется Acinetobacter выраженным угнетением ЦНС вплоть до комы и летального исхода и является дозолимитирующей [345].

В качестве альтернативной причины нейротоксичности Lаспарагиназ рассматривается повышение концентрации аммиака в плазме крови [313, 316]. Так, концентрация аммиака увеличивается в течение первых суток после введения EcA до уровня, в 7 раз превышающего исходный, после чего в течение 2 сут полностью нормализуется, что соответствует длительности циркуляции EcA [313, 346].

Попытки снизить L-глутаминазную активность препаратов L-аспарагиназ традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает поиск аспарагиназ с низкой Lглутаминазной активностью из других источников и детальное изучение их биохимических и биологических свойств. Например, практически отсутствует L-глутаминазная активность у WsA и L-аспарагиназы Helicobacter pylori (HpA) [7, 89, 112].

Второй подход — модификация уже изученных ферментов; замена аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность. В частности, к избирательному снижению Lглутаминазной активности EcA приводит замена Asp248 [109]. Путем направленного мутагенеза были получены гены, кодирующие EcA с различными заменами Asp248, которые в составе вектора pT7-7 использовались при трансформации штамма E. coli CU1783. Из полученных рекомбинантных ферментов наиболее перспективным оказался белок с заменой Asp248Ala: константа скорости ферментативной реакции kcat гидролиза L-глутамина по сравнению с природным ферментом снижалась с 3,310–1 до 2,910–3, снижение kcat гидролиза L-аспарагина было значительно менее выраженным [109].

Однако помимо увеличения токсичности, активность вносит L-глутаминазная EcA существенный вклад и в реализацию ее противоопухолевого действия. Так, существуют данные о том, что дезамидирование L-глутамина дополнительно снижает концентрацию L-аспарагина в плазме крови и отчасти предопределяет эффективность лечения, поскольку L-глутамин используется клеточной аспарагинсинтетазой для синтеза L-аспарагина [61, 62, 262]. Это предположение подкрепляется исследованиями in vitro, показавшими, что целенаправленное угнетение активности глутаминсинтетазы повышает цитотоксический эффект EcA [281, 332].

Снижение иммуногенности L-аспарагиназ. Наиболее хорошо изученные способы: химическая модификация молекулы белка, иммобилизация на водорастворимых полимерах или создание липосомальной лекарственной формы. «Закрытие» поверхности белка затрудняет процесс распознавания антигена и презентации макрофагами его фрагментов Т-хелперам, что определяет снижение иммуногенности. В настоящее время существует ряд различных методов модификации белковых препаратов, одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ). Пегилирование EcA существенно увеличивает продолжительность её циркуляции в кровотоке — Т1/2 увеличивается от 1,24±0,17 до 5,73±3,24 сут [42, 59]. Однако при развитии аллергической реакции на нативную EcA Т1/2 как нативной, так и пегилированной L-аспарагиназы существенно сокращается, что объясняется их идентичными антигенными свойствами [187].

Пегилирование позволяет частично решить только две проблемы, связанные с применением Lаспарагиназы — уменьшить интенсивность иммунного ответа, а также несколько увеличить стабильность препарата в крови. При этом на частоту развития и выраженность других побочных эффектов пегилирование не влияет [61]. Так, сравнительное исследование нативной и пегилированной EcA у детей с ОЛЛ показало, что при применении последней панкреатит развивается у 18% больных, что достоверно выше, чем после введения нативной EcA [48].

Помимо EcA, с использованием метоксиполиэтиленгликоль-n-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой ПЭГ 5000 получена также пегилированная ErA [21]. Наряду с пониженной иммуногенностью она более стабильна при протеолизе трипсином и трипсиноподобными протеазами плазмы крови, а также при воздействии повышенной температуры по сравнению с нативным ферментом. Кроме того, на культурах клеток лейкозов Molt-4 и Raji для модифицированной L-аспарагиназы показана более высокая цитостатическая активность, что может объясняться более медленным разрушением [21].

Помимо пегилирования, к снижению иммуногенности приводит инкапсулирование Lаспарагиназы в липосомы диаметром 158–180 нм [135], иммобилизация на гидрогеле ПЭГальбумина [175], инкапсулирование фермента в наночастицы сополимера лактид-гликолида [136], химическая модификация L-аспарагиназы NO2-карбоксиметил-хитoзаном в присутствии L-аспарагиновой кислоты [276].

Т1/2 из плазмы крови макак-резус поли-DL-аланил-модифицированной ErA более чем в 100 раз больше, чем для нативного фермента [338]. Инкапсулирование в липосомы пальмитоил-Lаспарагиназы увеличивает ее Т1/2 более чем в 8 раз [179]. Для уменьшения иммуногенности Lаспарагиназ и увеличения времени их циркуляции в крови путем «закрытия» поверхности белка от иммунокомпетентных клеток и протеолитических ферментов возможно также использование других рекомбинантных белков, обладающих низкой токсичностью и иммуногенностью, например, различных белков шелка [207, 311, 373]. Среди изучаемых перспективных способов снижения иммуногенности можно указать также инкапсуляцию фермента в эритроциты in vitro [204].

Другим возможным подходом к снижению иммуногенности является эпитопное картирование антигенных детерминант L-аспарагиназ и получение мутантных ферментов со сниженной иммуногенностью. Так, показано, что для ErA основным антигенным эпитопом является участок GIVPPDEELP, а замена Pro285 на Thr285 снижает иммуногенность в 8 раз [235].

Третьим возможным способом решения этой проблемы может быть последовательное применение L-аспарагиназ с различными антигенными свойствами. В частности, показано, что антитела к EсА не вызывают разрушение ErA, и это позволяет ее с эффектом применять у больных с исчерпанными возможностями [142, 341, 369]. Применение L-аспарагиназ, не инактивирующихся антителами к EcA и ErA, может оказаться эффективным при выработке иммунологической резистентности к EcA и ErA после многократных курсов химиотерапии.

Экспериментально доказано, что отличными от EcA иммуногенными свойствами обладают WsA и HpA [7, 113].

Четвертым возможным подходом к снижению иммуногенности является поиск и использование белков с меньшей молекулярной массой, что может позволить, помимо снижения иммуногенности, снизить также белковую нагрузку.

Изучение L-аспарагиназ из других источников. Существование широкого ряда природных Lаспарагиназ с различной первичной структурой а, следовательно, физико-химическими свойствами и антипролиферативным эффектом, открывает новые возможности для поиска новых противоопухолевых ферментов. Все бактериальные L-аспарагиназы в настоящее время принято разделять на два основных типа. К главным критериям их отличия относятся локализация (вне- или внутриклеточная), сродство к субстрату и четвертичная структура [227].

Принято считать, что L-аспарагиназы I типа представляют собой конститутивно экспрессирующиеся ферменты, локализованные в цитоплазме и характеризующиеся высоким значением Km (10-3 М) для L-аспарагина. К L-аспарагиназам I типа относятся внутриклеточные L-аспарагиназы E. coli, Bacillus subtilis, Methanococcus jannaschii, Pyrococcus horikoshii и др. [74, 362]. Их Km составляет около 3,5 мМ, и считается, что противоопухолевой активностью они не обладают [68, 88]. Бактериальные L-аспарагиназы II типа относятся к периплазматическим ферментам, имеют низкое значение Km (10-5 М) для L-аспарагина и широкую субстратную специфичность [255]. L-аспарагиназы II типа включают применяемые в клинической онкологии EcA и ErA, а также практически все изученные L-аспарагиназы с доказанной антипролиферативной активностью.

Эффективность в отношении лейкозных клеток in vitro или in vivo была обнаружена у ряда бактериальных L-аспарагиназ II типа (периплазматических): WsA, HpA, a также L-аспарагиназ Thermus thermophilus, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Erwinia aroidea, Aspergillus terreus, Mycobacterium tuberculosis [1, 7, 89, 90, 268, 274, 277, 282]. Успешно прошла клинические испытания ErA, которая, в отличие от EcA, не снижает уровень антитробмина, 2-антиплазмина и плазминогена в плазме крови и, следовательно, не повышает риск тромбообразования [54, 118]. Аналогичные данные получены in vivo для EwA [117]. На III фазе сравнительного изучения EcA и ErA у детей, больных ОЛЛ (n=702), показано, что при одинаковых дозах (10 000 МЕ/м2 2 раза в неделю в течение 4 нед) нарушения свертываемости крови наблюдались значительно чаще при применении EcA (30,2 и 11,8%, соответственно, p 0,0001), выраженность и частота развития других побочных эффектов существенно не отличались [118]. При этом как непосредственная эффективность лечения (частота ремиссий), так и отдаленные результаты (риск рецидива, бессобытийная и общая выживаемость) при применении ErA были достоверно хуже [118]. По данным другого масштабного (n=758), но не рандомизированного исследования, применение ErA также реже осложняется панкреатитами и нейротоксичностью [121].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |
Похожие работы:

«                      ШИЛЯЕВА ЮЛИЯ ИГОРЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФАЗОВЫХ ПЕРЕХОДОВ I РОДА В НИТЕВИДНЫХ НАНОКРИСТАЛЛАХ (In, Sn, Zn) В ПОРАХ АНОДНОГО Al2O3 Специальность 02.00.04 – физическая химия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: доктор...»

«Шелаева Татьяна Борисовна Механохимическая активация стекольной шихты Специальность 05.17.11 – Технология силикатных и тугоплавких неметаллических материалов Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель кандидат технических наук, профессор Н. Ю. Михайленко Научный консультант доктор технических наук, профессор В. Ф. Солинов Москва – 2015 год Содержание Введение...»

«Пашкевич Елена Борисовна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ И БИОПРЕПАРАТОВ ПРИ ОПТИМИЗАЦИИ ПИТАНИЯ РОЗ В УСЛОВИЯХ ЗАЩИЩЕННОГО ГРУНТА Специальность 06.01.04 – агрохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Надежда Владимировна Верховцева Москва – 2014 Содержание: Cтр. Введение.....»

«Губанов Александр Алексеевич РАЗРАБОТКА ПРОЦЕССА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ УГЛЕРОДНОГО ВОЛОКНА С ЦЕЛЬЮ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОЧНОСТИ УГЛЕПЛАСТИКОВ 05.17.03 – Технология электрохимических процессов и защита от коррозии 05.17.06 – Технология и переработка полимеров и композитов ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«САЛЕНКО ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ПРОГРАММИРОВАНИЕ УРОЖАЙНОСТИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗОНЕ УМЕРЕННОГО УВЛАЖНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ОПТИМИЗАЦИИ ПРИМЕНЕНИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ 06.01.04 агрохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учной степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Есаулко...»

«Якушин Роман Владимирович ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ЭЛЕКТРОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ 02.00.04 – физическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель д.т.н., профессор Колесников Владимир Александрович Москва2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Физика низкотемпературной плазмы...»

«КОНДРАТЬЕВА ТАТЬЯНА ДМИТРИЕВНА ЭКОЛОГО-БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ BACILLUS SUBTILIS, НА СИСТЕМУ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Замана С.П. Москва...»

«АФОНАСЕНКО КИРИЛЛ ВАЛЕНТИНОВИЧ ТЕХНОЛОГИЯ ХЛОПЬЕВ БЫСТРОГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОАКТИВИРОВАННОГО ЗЕРНА РЖИ Специальность: 05.18.01 Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства Диссертация на соискание ученой степени...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.