WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

«РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.) ...»

На правах рукописи

ГАЙДУКОВА Софья Евгеньевна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.)

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук



МОСКВА - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Центр «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель: Кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна

Научный консультант: Доктор биологических наук Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Соловьев Александр Александрович Кандидат биологических наук Фадеев Виталий Сергеевич Институт Цитологии и генетики СО РАН

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится “___” ___________ 2011 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан «____» _____________2011 года, и размещен на сайте Университета www.timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одним из наиболее ярких и убедительных достижений современной биотехнологии стало создание и бурное развитие новой области мировой экономики — биофармацевтической промышленности и промышленности биоматериалов, направленной на производство принципиально нового класса лекарств — рекомбинантных белков медицинского назначения и уникальных материалов Различные интерфероны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела, вакцинные белки, промышленные ферменты, доступные ранее лишь в аналитических количествах, входят теперь в перечень жизненно-важных медицинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год, и прочно вошли в повседневную практику современной медицины, пищевой и фармацевтической промышленности (Higo K. et al., 1993; Zhu Z. et al., 1994;

Matsumoto S. et al., 1995).

Одним из перспективных направлений биотехнологии в настоящее время является создание растений – биореакторов, способных продуцировать рекомбинантные белки. Системы, производящие подобные белки, на основе растений могут быть безопасной и экономически конкурентоспособной альтернативой традиционным системам экспрессии, - культурам клеток микроорганизмов и животных. Так в отличие от бактериальных систем, в растениях возможно осуществление посттрансляционных модификаций, которые в ряде случаев являются необходимым этапом получения функционального белка (Terashima M. et al., 1999). Кроме того, получение рекомбинантных белков в системах на основе растительных клеток являются более безопасными в виду отсутствия рисков переноса инфекционных заболеваний, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов (Scheller J. et al., 2004). Это является значительным преимуществом перед системами экспрессии на основе культур клеток млекопитающих.

Lemna minor (ряска малая) – однодольное покрытосеменное растение семейства Рясковые. Благодаря своей способности к быстрому, причем вегетативному размножению, позволяющему увеличивать биомассу вдвое за 36 часов и высокой доли белка в биомассе, ряска представляет интерес как потенциальная биофабрика для производства рекомбинантных белков, таких как вакцинные белки, сывороточный альбумин, гемоглобин и коллаген и др (Stomp A.M., 2005).

Растения Lemna можно выращивать в асептически закрытых емкостях с контролируемыми условиями культивирования. Для роста растениям необходимы лишь вода, неорганические питательные вещества и CO2.

(Edelman M. et al., 1998).

Таким образом, искусственная и полностью закрытая среда культивирования в сочетании с быстрым ростом, высоким содержанием белка в биомассе и преимущественно вегетативным способом размножением делают такую систему уникальной и легко контролируемой. Следовательно, система экспрессии, созданная на основе Lemna, обладает огромным потенциалом и преимуществами перед существующими системами экспрессии в связи с тем, что представляет собой новый тип эукариотической растительной высокопродуктивной системы для получения рекомбинантных белков.





Создание такой системы экспрессии возможно только с использованием методов генетической инженерии, которые для Lemna minor до сих пор остаются малоэффективными и трудоёмкими.

Все сказанное выше показывает актуальность разработки системы генетической трансформации растений ряски малой с целью создания растений-продуцентов рекомбинантных белков.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение регенерационной и трансформационной способности растений ряски малой (Lemna minor) и разработка эффективной системы генетической трансформации. Применение данной системы позволит создать трансгенные растения ряски, экспрессирующие рекомбинантные белки медицинского назначения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить оптимальную комбинацию регуляторов роста растений и тип экспланта с целью получения регенерации с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.

2. Подобрать условия эффективного селективного отбора трансформированной ткани.

3. Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации растений ряски малой.

4. Получить трансгенные растения ряски малой, несущие ген bar.

5. Провести молекулярный анализ полученных растений.

Научная новизна. Подобраны условия для культивирования, индукции каллусообразования и регенерации растений из каллуса для популяции Lemna minor, распространенной в водоемах Московской области. Показано, что наиболее эффективный эксплант для каллусообразования — целый интактный листец.

На основе подобранных условий была разработана система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens.

Получены трансгенные растения ряски со стабильной экспрессией гетерологичного гена bar.

Практическая значимость полученных результатов. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений Lemna minor с генами, кодирующими терапевтически ценные белки.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 10-ой и 11-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2006, Пущино, 2007); на Российско-польском симпозиуме (Москва, 2008); на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008); на молодежном симпозиуме Vго Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, в том числе одна статья в ведущем рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация включает: введение; обзор литературы; описание материалов и методов исследования; результаты и их обсуждение; выводы; список литературы.

Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 14 рисунков. Список использованной литературы содержит 201 источник, в том числе 191 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для работы служили растения Lemna minor, собранные в водоемах Московской области. Растительный материал культивировали на питательных средах: Мурасиге и Скуг, Хоагланд, Шенк и Хилдебрандт, Гамборг (Murashige T. et al., 1962; Hoagland D.R. et al., 1938; Schenk R.U. et al., 1972; Gamborg O.L. et al., 1968).

Для трансформации растений ряски использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (Helens R. et al., 2000), содержащий бинарный вектор pBar UBI. Этот вектор содержит в пределах Т-ДНК области под контролем промотора pUbi1 (Christensen A. et al.,1996) кукурузы ген bar (Падегимас Л. и др., 1993), обуславливающий устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина (Рисунок 1).

–  –  –

Рисунок 1 — Структура т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски В опытах по транзиетной экспрессии использовали супервирулентный штамм EHA105 (Hood E., 1993), содержащий векторную конструкцию pGFP (Фолимонов А.С.). Данная конструкция содержит маркерный ген gfp, находящийся под контролем 35S промотора и NOS-терминатора В качестве эксплантов для трансформации использовали фрагменты морфогенного каллуса. Экспланты инкубировали с разведенной культурой A. tumefaciens в течение 10, 20 или 30 минут, затем переносили на стерильную фильтровальную бумагу и далее — на чашки Петри со средой Хогланд с ацетосирингоном (200 µM) для со-культивации. Инокуляцию эксплантов с полученной агробактериальной культурой проводили в жидкой питательной среде AB, разбавленной средой MS в соотношении 1:4 с добавлением целлита (для увеличения количества поранений на единицу площади экспланта) при постоянном помешивании 160 об/мин, в течение 10, 20, 30 мин. Затем экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и перекладывали на твердую среду. Со-культивацию проводили на агаризованной среде Хоагланд в течение 3 суток в темноте.

Интеграцию гетерологичных последовательностей в геном ряски малой определяли методом ПЦР. Наличие экспрессии гена bar (фосфинотрицинацетил-трансфераза – ФАТ) определяли с помощью Trait LL Lateral Flow Test Kit (Strategic Diagnostics Inc.). Для проведения Саузерн блот-гибридизации (Southern, 1975) использовали одноцепочечный меченый [а-32P] ATP зонд.

Статистическую обработку данных проводили с использованием методики подсчета стандартного отклонения и доверительного интервала (ДИ) с заданным значением достоверности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Получение асептического материала. Наличие асептического растительного материала является необходимым условием для проведения экспериментов in vitro. Уже на первых этапах нашей работы мы столкнулись с трудностью обеззараживания растительного материала, так как используемые нами растения ряски, взятые из природных условий Московской области, были сильно загрязнены. При помещении таких растений на стерильную питательную среду наблюдали стремительный рост бактериальной и грибной

–  –  –

Таким образом, вариант стерилизации растений ряски в 4%-ном гипохлорите натрия (4 мин) и в 70%-ном спирте (30 с) оказался наиболее эффективным, так как при этом наблюдали более высокий выход обеззараженных и жизнеспособных растений, чем при использовании других композиций. Полученные обеззараженные растения были введены в культуру in vitro и использованы в экспериментах по оптимизации параметров регенерации и трансформации.

Подбор состава питательной среды для культивирования.

Эффективность проведения экспериментов in vitro зависит от подобранных условий, в том числе от используемого типа питательной среды. Были протестированы питательные среды – Мурасиге и Скуг, Гамборг, Шенк и Хилдебрандт, Хоагланд для выявления наиболее оптимального типа среды, позволяющего получать наибольший коэффициент размножения растений, который можно будет использовать в трансформационном процессе.

Количественный учет вновь образующихся растений был крайне затруднён изза высокой скорости их размножения, поэтому критерием для выбора оптимальной среды служила кратность увеличения массы растений. Через 2 недели культивирования наблюдали увеличение биомассы растений в среднем в 3 раза на средах Мурасиге и Скуг (МС), Шенк и Хилдебрандт, Гамборг и в 5 раз на среде Хоагланд (Таблица 3).

Таблица 3 - Результаты опыта по подбору оптимальной питательной среды для культивирования листецов ряски Тип среды Исходный вес Вес растительного Коэффициент размножения* растительного материала через 2 материала, мг недели, мг Гамборг 75 247,5±18,0 3,30±0,24 Mурасиге и 75 253,5±12,8 3,38±0,17 Cкуг Шенк и 75 211,5±13,5 2,82±0,18 Хилдебрандт Хоагланд 75 381,0±17,3 5,08±0,23 * - отношение массы растительного материала через 14 дней культивирования к исходной массе материала.

Таким образом, наибольший коэффициент размножения растений ряски был отмечен на среде Хоагланд, состав которой отличался самым низким содержанием микро- и макроэлементов из всех тестируемых типов сред.

Полученные результаты, вероятно, связаны с тем, что ряске как водному растению, привыкшему к минимальному содержанию питательных веществ в водной среде обитания, наиболее подходит среда с невысокими концентрациями солей. В дальнейшей работе все эксперименты проводили с использованием среды Хоагланд.

Определение оптимальных концентраций селективных агентов.

Известно, что эффективность генетической трансформации растений зависит от возможности осуществления конечного этапа — получения из клеток и тканей полноценных растений. Однако сам процесс трансформации и последующее продолжительное культивирование трансгенных многоклеточных тканей в условиях клеточной селекции значительно снижает морфогенную способность клеток. Поиск оптимальной концентрации селективного агента, которая позволит избежать появления химерных растений и в то же время не будет отрицательной влиять на последующий морфогенез, является важнейшим этапом получения трансгенных растений.

Чтобы в дальнейшем иметь возможность расширить спектр использования генетических конструкций, мы использовали различные селективные агенты и определяли их рабочие концентрации.

В качестве эксплантов в опытах использовали целые интактные растения (листецы), так как в случае использования для этой цели фрагментов каллуса, статистический анализ результатов был бы затруднен.

Рисунок 2- Листецы ряски малой на среде содержащей 8 мг/л фосцинотрицина (слева) и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования Рисунок 3 - Листецы ряски малой на среде содержащей 100 мг/л канамицина (слева) и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования Рисунок 4 – Транзиентная экспрессия гена gfp на 3 сутки при использовании в качестве экспланта целого (слева) и половины листеца (справа)

–  –  –

которого легко детектировать в трансформированных тканях.

Автофлюоресценция клеток ряски нами не была выявлена, что делало возможным использование данного гена для оптимизации параметров трансформации.

Для трансформации использовали штамм A. tumefaciens EHA105 и экспланты двух типов — листецы с поранением в меристематической зоне и половинки листецов, так как предполагалось получить регенеранты за счет прямого соматического эмбриогенеза миную каллусную культуру. Оценку наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена проводили через 3 суток после окончания со-культивации. При этом наблюдали единичные точки свечения обоих типов эксплантов (Рисунок 4), что подтверждает возможность агробактериальной трансформации ряски, однако ее эффективность была крайне низкой. К тому же, регенерация происходила не из светящихся клеток.

Компетентность к трансформации культуры in vitro растений Lemna minor была подтверждена детекцией транзиентной экспрессии гена gfp (Рисунок 4).

В первой серии опытов по трансформации конструкцией pBar UBI в качестве эксплантов использовали также как и в опытах с маркерным геном gfp листецы или их половинки. Однако трансгенных растений получить не удалось, несмотря на происходящую регенерацию, что, по всей видимости, связано с низкой частотой переноса Т-ДНК из агробактерии в клетки меристемы. В связи с чем, в дальнейшем было решено использовать в качестве экспланта для трансформации каллус.

Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и регуляторов роста растений на процесс каллусообразования. Индукция каллусообразования и регенерация растений является генотип-зависимым процессом, но также зависит и от взаимодействия различных факторов, в том числе от состава питательной среды, типа экспланта и различных типов и концентраций регуляторов роста растений. Имеются сведения о влиянии условий культивирования на эффективность каллусообразования. Стефаниак и коллеги пришли к выводу, что повышенная температура (25°С) и темнота стимулируют процесс каллусообразования (Stefaniak B. et al., 2002). Однако Фрик с соавторами получал каллус у L. minor при непрерывном освещении (Frick H. et al., 1994). По мнению Мун и Стомп свет – необходимый фактор формирования каллуса у L. gibba, несмотря на то, что в экспериментах лишь 10% эксплантов формировали каллус (Moon H.K. et al., 1997). Преимущество повышенных температур (25-28°С) для индукции каллуса у L. gibba также продемонстрировали Чанг и Чиу (Chang W.C. et al., 1976). В своих экспериментах по индукции каллусообразования мы тестировали интервал температур от 18°С до 27°С и различные условия освещения. В наших опытах при отсутствии освещения наблюдалась гибель всех эксплантов.

Оптимальными условиями были определены 22-25°С и фотопериод 16 ч день/8 ч ночь.

Так как ряска – одно из редуцированных покрытосеменных растений, выбор экспланта для получения каллуса довольно ограничен. По мнению Стефаниака нанесение поранения листецам необходимо для индукции каллуса у L. minor и приводит к высокому уровню формирования каллуса до 89,11% (Stefaniak B. et al., 2002).

Для определения типа экспланта, наиболее компетентного к каллусообразованию, использовали: целое интактное растение, половинки листецов и разрезанные вдоль либо поперек центральной жилки (вдоль или поперек не имеет значения, так как важным фактором является повреждение меристематической зоны) листецы с поранением в меристематической зоне.

Для каждого типа экспланта определяли оптимальную комбинацию ростовых регуляторов с целью получения наибольшей частоты каллусообразования.

На основе анализа литературных данных (Edelman M. et al., 2003; Li J. et al., 2004; Moon H.K. et al., 1997) была разработана схема эксперимента, содержащая девять комбинаций наиболее эффективных для индукции образования каллуса регуляторов роста — 2,4-D и BAP (Таблица 5). Во всех вариантах была использована среда Хоагланд и три типа эксплантов.

Во всех вариантах через четыре недели культивирования вегетативное размножение прекращалось и начиналось формирование каллуса. При этом наблюдалось видоизменение листецов, которое проявлялось в увеличении их размера, изменении формы и цвета. Гиалиновая нить, связывающая дочерние растения с материнским, заметно увеличивалась в размерах через 2-3 недели, что являлось одним из визуальных критериев начала формирования каллусной ткани (Рисунок 5), собственно образование каллуса наблюдалось через 11недель от начала культивирования.

При использовании всех типов эксплантов наблюдали образование каллуса (Рисунок 6) с частотой от 12% до 83% (Таблица 5). В основном образовывалась смесь каллусных культур, состоящая из образований белого неморфогенного и зеленого морфогенного каллусов (Рисунок 7).

Каллусообразование морфогенного каллуса с наибольшей частотой (83%) происходило в варианте №5, при добавлении в питательную среду 2 мг/л БАП и 20 мг/л 2,4-Д и при использовании в качестве экспланта целого интактного растения.

–  –  –

Растения ряски, полученные нами через непрямой органогенез, не отличались по морфологическим характеристикам (цвет и размер) от контрольных растений.

Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации фрагментов каллуса на основе транзиентной экспрессии маркерных генов. Во время проведения экспериментов по трансформации фрагментов каллуса были протестированы следующие параметры агробактериальной трансформации: 1) влияние продолжительности прекультивации (промежуток времени от момента поранения экспланта до инокуляции с агробактерией); 2) продолжительность инокуляции; 3) время сокультивации с агробактерией.

Загрузка...

–  –  –

Поскольку в данном эксперименте мы использовали маркерный ген, было предложено эффективность трансформации условно прировнять к частоте транзиентной экпрессии.

В результате экспериментов были определены оптимальные параметры для трансформации эксплантов ряски (Таблица 6). Было показано, что нет необходимости в проведении стадии пре-культивации, так как нет существенных различий в эффективности трансформации независимо от длительности инокуляции.

Была определена оптимальная продолжительность инокуляции, которая составила 20 мин (эффективность трансформации 24,7-56,4%), в то время как, при продолжительности 10 мин. эффективность варьировала от 3,2 до 31,3%, а при 30 минутах наблюдалась гибель эксплантов от агробактериального заражения. Наибольшая эффективность трансформации 51,7 % и 56,4% достигается при продолжительности со-культивации эксплантов с агробактерией в течении 3 суток и 2 суток соответственно (Рисунок 9). Однако во втором случае предшествует стадия пре-культивации длящаяся сутки, что нивелирует различия в продолжительности протокола трансформации. Таким образом, разработанный протокол трансформации включает в себя собственно инокуляцию 20 минут и со-культивацию 3 суток.

Получение трансгенных растений с геном bar. Далее по разработанному протоколу были проведены эксперименты по трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar. В результате проведения опытов по трансформации, из первоначально взятых в каллусообразование 100 листецов, было получено 27 фосфинотрицин-устойчивых растений.

Устойчивые растения анализировали методом ПЦР на присутствие/отсутствие гена bar (Рисунок 10). В результате анализа было показано наличие искомого гена в геноме 13 растений ряски.

350 п.н.

Рисунок 10 - Электрофоретический анализ результатов ПЦР в 1%-м агарозном геле. 1 маркер молекулярной массы (GeneRulerTM DNA Ladder Mix, Fermentas); 2 – ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 3 – в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из не трансформированного растения; 4-17 – ДНК регенерантов ряски; 18 – ДНК плазмиды pBar UBI.

Полученный результат можно объяснить химерностью полученных растений, т.е. часть нетрансгенных клеток и тканей выживала за счет трансгенных, что можно объяснить диффузией фермента ФАТ.

контрольная полоса тестовая полоса Рисунок 11 - Анализ экспрессии гена bar фермента фосфинотрицин-N-ацетил трансферазы (pat) с помощью TRAIT LL Lateral Flow Test kit. 1 - контрольное (нетрансформированное) растение; 2-4 - трансформированные растения (наличие 1-ой контрольной полосы свидетельствует о корректном прохождении анализа, наличие 2 – ой тестовой полосы свидетельствует об экспрессии гена bar).

Экспрессия гетерологичного гена была подтверждена при помощи экспресс-системы Lateral Flow Test (Рисунок 11) в 12 из 13 ПЦРположительных растений. Мониторинг наличия и экспрессии гена bar в поколениях при вегетативном размножении полученных трансгенных растений показал стабильное наследование целевого гена.

Рисунок 12. Схема Т-ДНК вектора и результаты Саузерн блот анализа. А - Структура Т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски. LB и RB

- левая и правая границы Т-ДНК, соответственно; Pubi – промотор Ubi1 гена кукурузы;

BAR – ген фосфинотрицинацетилтрансферазы из Streptomyces hygroscopicus; Tnos – терминатор гена нопалинсинтазы; Intron - интрон Ubi1 гена кукурузы; PstI, BamHI – места узнавания эндонуклеаз рестрикции. Положение фрагмента, использованного для синтеза зонда, указано черным прямоугольником. B - Результаты Саузерн блот анализа.1– маркер молекулярного веса GeneRuler DNA Laders (Fermentas); 2 – ДНК контрольного растения, обработанная BamHI, 3 – ДНК трансгенного растения, обработанная BamHI, 4 – ДНК контрольного растения, обработанная PstI, 5 – ДНК трансгенного растения, обработанная PstI.

Одно из полученных растений (№ 3) было проанализировано с помощью Саузерн-блоттинга. Полученные результаты (Рисунок12В) подтверждают факт интеграции целевого гена bar в геном L. minor, в проанализированном растении имеется две копии трансгенной вставки.

ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные условия получения каллуса — питательная среда Хоагланд, комбинация регуляторов роста: 2,4-Д в концентрации 20 мг/л и БАП в концентрации 2 мг/л.

2. Определены рабочие концентрации четырех селективных агентов для отбора трансформированной ткани растений Lemna minor: фосфинотрицин

– 8 мг/л, глифосат – 16 мг/л, канамицин – 100 мг/л, гигромицин 2 мг/л;

продолжительность селективного отбора не менее 6 недель.

3. Показано, что оптимальным типом экспланта для проведения агробактериальной трансформации Lemna minor является каллус.

4. Показано, что наибольшая частота транзиентной эспрессии гена gfp (46,0±10,4%) достигается при продолжительности инокуляции эксплантов с агробактерией в течение 20 минут. Эффективность трансформации на уровне 43,0 ±8,7% была отмечена при продолжительности со-культивации фрагментов каллуса с агробактерией в течение 3 суток.

5. Используя разработанный протокол трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar, было получено 13 трансгенных растений. В ходе молекулярного анализа (ПЦР) был подтвержден трансгенный статус данных растений и экспрессия гетерологичного гена в 12 из них.

6. Определено количество копий гена bar в геноме трансгенного растения Lemna minor №3. Показано встраивание двух копий гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Гайдукова С.Е., Ракитин А.Л., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Камионская А.М. Разработка системы генетической трансформации ряски малой Lemna minor. Экологическая генетика, 2008, том VI, выпуск 4, с. 20-28.

2. Гайдукова С.Е., Белоусова М.Б., Камионская А.М., Скрябин К.Г.

Изучение регенеративной способности водных однодольных растений на примере Lemna minor. Материалы Третьего Московского международного конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2005.

С. 240-241.

3. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. Изучение регенеративной способности ряски малой Lemna minor. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 362-363.

4. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. Разработка системы генетической трансформации ряски, Lemna minor. Материалы четвертого съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006.

С. 51.

5. Гайдукова С.Е. Агробактериальная трансформация ряски малой, Lemna minor. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2007. С. 189.

6. Гайдукова С.Е., А.М. Камионская, К.Г. Скрябин. Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. Четвертый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы».

Москва, 2007. С. 226.

7. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. (2007) Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. VII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2007. С. 15-16.

8. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой Lemna minor. Пятый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы».

Москва, 2009. С. 312-313.

9. Гайдукова С.Е. Трансгенные растения ряски малой — биофабрики для производства лекарств. Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 2008. С. 88-89.

10. Гайдукова С.Е. Оптимизация протокола генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. Международная конференция «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Звенигород, 2008. С. 14.

11. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 2009. Часть II. С. 368.



Похожие работы:

«РАЗУВАЕВА ЯНИНА ГЕННАДЬЕВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ИХ ФАРМАКОТЕРАПИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Благовещенск – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского...»

«Кравцова Татьяна Робертовна ОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ГИДРОИДОМ DYNAMENA PUMILA Специальность 03. 02. 10. – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2013 Работа выполнена на кафедрах биоинженерии и гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет...»

«КОЦЮК ДЕНИС ВЛАДИМИРОВИЧ ФОРМИРОВАНИЕ ИХТИОФАУНЫ ЗЕЙСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА: РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 03.00.10 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Владивосток – 2009 Работа выполнена в лаборатории биоресурсов реки Амур Хабаровского филиала Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ХфТИНРО), г. Хабаровск Научный руководитель:...»

«Шемякина Ирина Игоревна Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния Специальность03.01.03молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2015 год Работа выполнена в лаборатории геномики адаптивного иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии...»

«Коцарь Александр Геннадьевич Математическое моделирование и алгоритмизация прогнозирования, диагностики, профилактики и лечения мочекаменной болезни специальность 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика (медицинские науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Курск 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Юго-Западный государственный университет» доктор медицинских наук Научный консультант: Серегин Станислав Петрович Официальные...»

«Ондар Елена Эрес-ооловна ГУМУС ПОЧВ ТУВЫ Специальность 03.00.27. – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 200 Работа выполнена в Институте почвоведения и агрохимии СО РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.И. Дергачева Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.Н. Феденева кандидат биологических наук Е.В. Каллас Ведущая организация: Уральский государственный университет им. А.М....»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Балашовском институте (филиале) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г....»

«ЦАПЛИНА Ольга Анатольевна РОЛЬ ПРОТЕАЛИЗИНА В БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНВАЗИИ 03.03.04. Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель: доктор биологических наук Хайтлина София Юрьевна Институт цитологии РАН Официальные оппоненты: доктор биологических наук Гамалей Ирина...»

«КУЯРОВ Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сургутский...»

«Монтеро Катчан Диана ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ КОСТА-РИКИ специальность 03.02.08 — экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва — 2013 Работа выполнена на кафедре экологического мониторинга и прогнозирования экологического факультета ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, Зволинский Валентин Петрович заведующий лабораторией молекулярной...»

«Шалыгин Сергей Сергеевич ГРУППИРОВКИ ЭПИЛИТНЫХ И ЭПИФИТНЫХ ЦИАНОПРОКАРИОТ ЛАПЛАНДСКОГО ЗАПОВЕДНИКА 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2012 Работа выполнена в лаборатории флоры и растительных ресурсов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Полярно-альпийский ботанический садинститут им. Н. А. Аврорина Кольского научного центра РАН (ПАБСИ КНЦ РАН). Научный руководитель: доктор биологических...»

«Степанов Алексей Вячеславович ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ-КИЛЛЕРОВ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ В-КЛЕТОК Специальность 03.01.03 – «молекулярная биология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН). Научные руководители:...»

«ПАНЧЕНКО Данила Владимирович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ОТРЯДА ПАРНОКОПЫТНЫЕ (ARTIODACTYLA) КАРЕЛИИ И КОЛЬСКОГО ПОЛУОСТРОВА (место в экосистемах, биология, ресурсы, управление популяциями) 03.02.04 – зоология 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск – Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН Научный руководитель доктор биологических наук, профессор...»

«КРЮЧКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ К ИЗУЧЕНИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА РАБОТАЮЩЕГО НАСЕЛЕНИЯ 14.02.01 Гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2012 Работа выполнена в ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Юдина...»

«Звягина Мария Владимировна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА И АБСОРБЦИИ ХОЛЕСТЕРИНА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА С ИЗОЛИРОВАННОЙ И СОЧЕТАННОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ 14.01.05 – КАРДИОЛОГИЯ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук КУРСК – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет»...»

«ЕЛАНСКИЙ Сергей Николаевич ВИДОВОЙ СОСТАВ И СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФИТОФТОРОЗА И АЛЬТЕРНАРИОЗА КАРТОФЕЛЯ И ТОМАТА Специальность 03.02.12 – «Микология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова Научный...»

«Егорова Ирина Николаевна СОДЕРЖАНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДОВ В СЫРЬЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ КЕМЕРОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена на кафедре фармакогнозии и ботаники ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» доктор медицинских наук, профессор Научный руководитель: Громов Константин Георгиевич доктор биологических наук, профессор...»

«Красная Юлия Владимировна ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОСТИ ЕNTEROCOCCUS FAECALIS В УСЛОВИЯХ ДИСБАЛАНСА РЕДОКС-СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск – 2015 Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии и на кафедре инфекционных и кожно-венерических заболеваний Федерального...»

«Калякин Евгений Александрович ПОЗДНЕМЕЛОВЫЕ МОРСКИЕ ЕЖИ СРЕДНЕГО И НИЖНЕГО ПОВОЛЖЬЯ: ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, СТРАТИГРАФИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Специальность: 25.00.02 – палеонтология и стратиграфия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Саратов – 2015     Работа выполнена на кафедре исторической геологии и палеонтологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Евгений Михайлович Первушов,...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.