WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 |

«Чувствительное и специфическое определение редких молекул РНК ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

ФАЛАЛЕЕВА МАРИНА ВИТАЛЬЕВНА

Чувствительное и специфическое

определение редких молекул РНК

03.00.03 – Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:



член-корреспондент РАН, доктор биологических наук

Четверин Александр Борисович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Разин Сергей Владимирович кандидат биологических наук Алкалаева Елена Зиновьевна

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится «__»__________2009 года в_____часов на заседании совета Д. 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при

Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «__»__________2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выявление редких молекул РНК необходимо как для молекулярной диагностики, так и для решения многих научных задач. Редкими молекулами в данном случае называются РНК, находящиеся в образце в малом количестве среди огромного избытка посторонних (отличных от искомых) нуклеиновых кислот. В связи с этим возникают две главные проблемы при определении редких молекул: одна из них связана с чувствительностью, а другая со специфичностью детекции. Об ограниченной чувствительности говорят тогда, когда изучаемый образец содержит искомую РНК (мишень), но е невозможно обнаружить по ряду причин, из-за чего исследователь получает ложноотрицательный результат. Во-первых, мишени могут деградировать при хранении образца, во-вторых, могут быть потеряны в ходе выделения. Кроме этого, вместе с изучаемой мишенью могут выделяться примеси, являющиеся ингибиторами последующих реакций, служащих для размножения и детекции мишени. В настоящее время для того, чтобы надежно обнаружить малые количества ДНК, изучаемую мишень размножают при помощи ПЦР. РНК также можно размножить в ПЦР, если е предварительно перевести в кДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ). Теоретически, с помощью ПЦР можно размножить и обнаружить единственную молекулу мишени. Однако в том случае, когда нужно определить малое число молекул мишени на фоне огромного избытка посторонних нуклеиновых кислот, которые часто присутствуют в анализируемом образце, чувствительность и специфичность ПЦР может значительно снижаться из-за ограниченной специфичности праймеров. Проблема ограниченной чувствительности ПЦР была решена в нашей лаборатории (биохимии вирусных РНК Института белка РАН). Был создан способ размножения нуклеиновых кислот в геле, названный методом молекулярных колоний или наноколоний. При проведении ПЦР в геле образуются колонии ДНК, росту которых не мешает даже большое число неспецифических колоний благодаря пространственному разделению ампликонов. Данный метод не требует использования внутренних контролей, а простой подсчет мишеньспецифичных колоний позволяет прямо определять титр мишени в анализируемом образце.

Вопрос сохранности нуклеиновых кислот при хранении анализируемого препарата был решен в нашей лаборатории ранее. Однако открытыми оставались вопросы, связанные со способами выделения изучаемых мишеней, а также с проблемой низкого выхода стадии обратной транскрипции.

Другой проблемой является низкая специфичность выявления редких РНКмишеней, вследствие того, что в ходе анализа образуются ложные мишени, которых не было в анализируемом образце. Это приводит к получению ложноположительного результата. Ложные мишени могут образовываться, например, в результате ложной рекомбинации РНК на стадии обратной транскрипции. В отличие от истинной рекомбинации, в которой рекомбинантная РНК образуется из других молекул РНК, в ходе ложной рекомбинации из РНК-предшественников образуется рекомбинантная кДНК.





Происходит это из-за природного свойства РНК-зависимых ДНК-полимераз ретровирусов, используемых для обратной транскрипции in vitro, осуществлять рекомбинацию по типу смены матриц. Эта рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении такого редкого события, как рекомбинация между молекулами РНК, а также при диагностике. Данная проблема часто остатся недооцененной многими исследователями.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилась разработка количественной высокочувствительной и высокоспецифичной молекулярной диагностики, а также определение продуктов рекомбинации РНК с помощью ОТ-ПЦР в отсутствии ложной рекомбинации. В связи с этим были поставлены следующие задачи: усовершенствовать или заново разработать методы выделения из крови РНК, как свободной от ДНК (для диагностики рака), так и наряду с ДНК (для диагностики вирусных инфекций), при использовании которых не происходило бы потери нуклеиновых кислот, а анализируемый препарат был бы свободен от примесей, ингибирующих обратную транскрипцию и ПЦР; повысить выход обратной транскрипции; определить частоту ложной рекомбинации на стадии обратной транскрипции и разработать способы ее понижения. И наконец, было необходимо убедиться, что все разработанные подходы действительно работают на практике и их применение позволяет повысить чувствительность и специфичность обнаружения искомых молекул РНК.

Научная новизна и практическая значимость. С целью устранения ложноотрицательных результатов разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и освобождение образца от ингибиторов ОТ-ПЦР, оптимизирована стадия обратной транскрипции и применен метод молекулярных колоний для выявления специфических молекул кДНК.

Для устранения ложноположительных результатов предложены следующие способы понижения частоты ложной рекомбинации, происходящей при синтезе кДНК из-за смены матриц обратной транскриптазой: селективная деградация РНК полинуклеотидфосфорилазой проведение обратной Thermus thermophilus, транскрипции в геле, а также уменьшение концентрации обратной транскриптазы в реакционной смеси. При этом показано, что, вопреки распространенному мнению, частота ложной рекомбинации не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

Продемонстрирована эффективность разработанных подходов для решения фундаментальных и прикладных задач; в частности, для изучения рекомбинации РНК, катализируемой Q-репликазой, и для молекулярной диагностики. Показано, что разработанные способы понижения частоты ложной рекомбинации позволяют обнаруживать и исследовать в отсутствие селекции (с помощью ОТ-ПЦР) продукты истинной рекомбинации РНК. Также показано, что разработанные способы устранения ложноотрицательных и ложноположительных результатов позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять в крови человека химерные РНК, ассоциированные с лейкозами, а также вирусные РНК-мишени.

Апробация работы и научные публикации. Работа прошла апробацию на открытом семинаре лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН.

Результаты работы изложены в 4 статьях, опубликованных в отечественных и международных научных журналах, в 2 заявках на патент, а также доложены на 10 научных конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного описанию способов выявления и количественной оценки РНК, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ___ страницах машинописного текста и содержит __ рисунков. Библиография включает ___ названий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ложноотрицательные результаты и их устранение Разработка метода одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови. Чаще всего для диагностики используют кровь. Кровь, с точки зрения выделения из нее нуклеиновых кислот, является трудным объектом, поскольку содержит большое количество белков (около 10% по массе), в том числе нуклеаз, РНК

- и ДНК-связывающих белков, которые могут разрушать нуклеиновые кислоты и/или уводить их из водной фазы при фенольной депротеинизации. Кровь также содержит много различных ингибиторов ОТ-ПЦР. В настоящее время существуют коммерчески доступные наборы для выделения РНК и/или ДНК из крови. Действие этих наборов основано на том, что в присутствии солей гуанидина РНК и/или ДНК задерживается на Рис. 1 Характеристика метода, разработанного для одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови.

(А) Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот, выделенных согласно разработанному методу (1). В лизаты крови перед выделением была добавлена [32P]меченная РНК - Q РНК длиной 4200 нт (2) и фрагмент HIV-1 РНК длиной 880 нт (3).

Дорожки 2 и 3 также содержат по 0,5 мкг соответствующих немеченых РНК. Верху - гель окрашен бромистым этидием, внизу – радиоавтограф того же геля.

(Б) Нуклеиновые кислоты, выделенные по разработанной методике из 100 мкл крови здорового донора, к которой в момент лизиса не добавляли (нижний ряд) или добавили 150 молекул HIV-1 РНК и 50 молекул HBV ДНК (верхний ряд), подвергали обратной транскрипции, а затем выращивали колонии ДНК. Колонии выявляли посредством последовательной гибридизации мембраны с [32P]-меченным РНК-зондом (HIV-1, а затем HBV).

колонке из стекловолокна или силикагеля, а сопутствующие компоненты не задерживаются, либо сорбируются слабее, чем нуклеиновые кислоты. Далее нуклеиновые кислоты элюируют с колонки и используют для анализа. Мы попробовали выделить суммарные нуклеиновые кислоты, используя набор реактивов и протокол фирмы Roche. При использовании данного метода происходили потери как ДНК, так и РНК. Кроме того, препарат ингибировал последующие стадии анализа (ОТПЦР). Поскольку приемлемого метода для одновременного выделения РНК и ДНК из цельной крови не нашлось, надо было разработать такой метод.

Кровь лизировали раствором, описанным Чиргвином и др. для выделения РНК из источников, богатых рибонуклеазами (Chirgwin et al. 1979. Biochemistry 18, 5294Оказалось, что если лизат сразу экстрагировать фенолом, то большая часть ДНК уходит в фенол. Однако потерю ДНК можно предотвратить, если предварительно провести двукратное осаждение нуклеиновых кислот изопропанолом, которое удаляет большую часть белков, остатки которых удаляются в ходе последующей экстракции фенолом. Выход меченых РНК, добавленных в лизат (рис. 1А), составляет около 100%. Для того, чтобы определить выход ДНК, а также убедиться, что препарат нуклеиновых кислот не содержит ингибиторов ОТ-ПЦР, был проведн эксперимент, в котором к 100 мкл лизата крови добавляли 150 молекул фрагмента HIV-1 РНК и 50 молекул фрагмента HBV ДНК, а затем выделяли нуклеиновые кислоты, используя разработанную процедуру. Выделенные нуклеиновые кислоты подвергали обратной транскрипции и ПЦР в геле. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с радиоактивно-меченными РНК-зондами – сначала с HIV-специфичным, а затем с HBV-специфичным. Из рисунка 1Б видно, что выросло 53 HBV-специфичных и примерно 70 HIV-специфичных колоний. В семи независимых экспериментах было выявлено 78±18 и 53±11 HBV-специфичных колоний, что HIV-специфичных приблизительно соответствует 50% добавленной РНК-мишени и 100% ДНК-мишени.

Таким образом, разработанный метод позволяет выделять из лизата цельной крови одновременно РНК и ДНК с выходом около 100%, при этом нуклеиновые кислоты не содержат ингибиторов ни обратной транскрипции, ни ПЦР.

Более низкий процент выявления РНК-мишени обусловлен выходом обратной транскрипции.

Усовершенствование метода выделения РНК. Иногда присутствие ДНК может мешать определению РНК, например, в случае детекции молекул мРНК, имеющих псевдогены.

Для выделения только РНК (без ДНК) из животных тканей часто используют метод, разработанный Хомчинским и др. (Chomczynski & Sacchi. 1987. Anal. Biochem., 162, 156-159). Мы попробовали применить этот метод для выделения РНК из цельной Рис. 2. Анализ препаратов РНК, выделенных из цельной крови.

(А) Результат электрофореза РНК. В лизаты крови (3) была добавлена [32P]-меченная РНК

- Q РНК длиной 4200 нт (2) и фрагмент HIV-1 РНК длиной 880 нт (1). Дорожки 1 и 2 также содержат по 0,5 мкг соответствующих немеченых РНК. РНК выделяли из крови (3,5) или из костного мозга (4) по оригинальному методу Хомчинского и др. (3) и по усовершенствованному методу (4,5). Верхняя панель: гель окрашен бромистым этидием, нижняя панель: радиоавтограф этого же геля.

(Б) Колонии ДНК, выросшие из продуктов ОТ, полученных при использовании 100 молекул мРНК AML1-ETO и 2 ед обратной транскриптазы SuperScript® II в отсутствие (1) и в присутствии РНК из 90 мкл цельной крови здорового донора, выделенной по оригинальному (2) или усовершенствованному (3) методу Хомчинского и др. Колонии выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

крови. Следует отметить, что ядерные клетки составляют лишь около 1% цельной крови, поэтому исходное содержание РНК в крови примерно в 100 раз меньше, чем в обычной ткани. Выход РНК, определенный по выходу добавленной в момент лизиса крови радиоактивно меченных РНК (рис. 2А), составил 85-90%. Для проверки присутствия ингибиторов в конечном препарате, к выделенной из 100 мкл крови РНК добавляли 100 молекул фрагмента мРНК AML1-ETO (маркер острого миелоидного лейкоза, сопровождающегося хромосомной транслокацией t(8;21)). Далее проводили обратную транскрипцию в пробирке и ПЦР в геле с AML1-ETO-специфичными праймерами. Выяснилось, что полученный препарат содержит примеси, ингибирующие ОТ-ПЦР (рис. 2Б, гель 2). От ингибиторов удалось избавиться с помощью фенольной экстракции образца в отсутствие тиоцианата гуанидина и гельфильтрации через Sephadex G-25 (рис. 2Б, гель 3). В препаратах РНК, выделенных из крови и костного мозга (который по составу близок к крови, но содержит на порядок больше ядерных клеток), частично сохраняется даже рибосомная 28S РНК длиной Рис. 3. Влияние неспецифических нуклеиновых кислот на обратнотранскриптазную активность Tth ДНК-полимеразы.

Влияние указанных концентраций плазмидной ДНК («ДНК»), рРНК E. coli («РНК»), смеси (10:1) плазмидной ДНК и рРНК («ДНК+РНК»), нуклеиновых кислот крови («НКК») на ОТПЦР 104 молекул плазмидной ДНК pQ7 (A) или 105 молекул Q РНК (Б) с помощью Tth ДНК-полимеразы в буферной системе бицин/Mn2+, или на размножение 105 молекул Q РНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript® II (ОТ) и Tth ДНК-полимеразы (ПЦР) (В). Стрелка показывает положение специфического продукта.

4800 нт, что гарантирует сохранность значительно более коротких участков РНК (80нт), которые обычно служат диагностическими мишенями (рис. 2А, дорожки 4 и 5).

Выбор обратной транскриптазы. При использовании обратных транскриптаз ретровирусов, стадии обратной транскрипции и ПЦР обычно разделяют из-за несовместимости буферных систем. ОТ-ПЦР можно осуществлять в одной реакционной смеси, используя ДНК-полимеразу Thermus thermophilus, которая в присутствии ионов Mn2+ является как ДНК-, так и РНК-зависимой ДНК-полимеразой.

Однако мы обнаружили, что относительно большая концентрация нуклеиновых кислот, как РНК, так и ДНК (4,5 нг/мкл), неспецифически ингибирует обратнотранскриптазную (РНК-зависимую) активность Tth ДНК-полимеразы (рис. 3Б), хотя не влияет на ее ДНК-зависимую активность (рис. 3А). Таким образом, использование Tth ДНК-полимеразы в качестве обратной транскриптазы может приводить к ложноотрицательным результатам при анализе клинических образцов, содержащих большое количество отличных от мишени нуклеиновых кислот. В этом случае предпочтительно использовать обратную транскриптазу ретровируса MMLV SuperScript® II, которая не чувствительна к присутствию большого количества неспецифических нуклеиновых кислот (рис. 3В).

Снижение неспецифического синтеза кДНК при уменьшении количества обратной транскриптазы. При ОТ-ПЦР образцов РНК крови с использованием рекомендованного фирмой-производителем количества обратной транскриптазы Рис. 4. Зависимость роста колоний ДНК от количества обратной транскриптазы.

А – Колонии, выросшие из 50 молекул плазмиды pTZ19-AML1-ETO в отсутствие (К1) или в присутствии РНК из 90 мкл крови здорового донора, не проходившей (К2) или проходившей ОТ, осуществленной с использованием указанных количеств обратной транскриптазы SuperScript® II. Б – Колонии, выросшие из продуктов ОТ, полученных при использовании 100 молекул мРНК AML1-ETO и указанных количеств обратной транскриптазы в отсутствие РНК крови. Колонии выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

SuperScript® II мы наблюдали ингибирование роста колоний, причем даже если в качестве матрицы использовали ДНК (плазмиду, несущую кДНК AML1-ETO), которую добавляли после ОТ. Ингибирования не наблюдали в отсутствие препарата суммарной РНК крови или если препарат РНК добавляли к образцу после ОТ (рис. 4).

Вероятно, причиной подавления роста колоний служит конкуренция со стороны неспецифических кДНК, которые синтезируются на РНК крови в результате ошибочной гибридизации праймера. Оказалось, что ингибирование можно полностью убрать, если в 100 раз понизить количество обратной транскриптазы (рис. 4А). Важно, что при этом также увеличивается выход ОТ чистой РНК-мишени, судя по числу колоний ДНК (рис. 4Б).

2. Ложноположительные результаты и их устранение

Возникновение рекомбинантной кДНК на стадии обратной транскрипции.

Известно, что обратные транскриптазы ретровирусов, обычно используемые для синтеза кДНК in vitro, могут осуществлять гомологичную рекомбинацию по типу смены матриц с образованием рекомбинантной кДНК, которой не соответствует ни одна из содержащихся в образце мРНК. Такая рекомбинация может приводить к ложноположительным результатам при изучении рекомбинации между молекулами РНК или при диагностике. Чтобы оценить масштаб проблемы, мы исследовали частоту возникновения ложных рекомбинантов при обратной транскрипции смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК (сателлитной РНК фага Q), ранее использованных для исследования рекомбинации РНК в бесклеточной системе репликации фага Q.

Данные фрагменты снабжены гомологичными довесками длиной 23 нт и получены транскрипцией плазмид, несущих соответствующие кДНК.

Рис. 5. Частота возникновения рекомбинантных кДНК в результате смены матриц обратной транскриптазой.

Результаты электрофореза продуктов ОТ-ПЦР указанного числа молекул либо смешанных 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК (А), либо полноразмерной RQCT1n1 РНК (Б). Обратную транскрипцию проводили в присутствии 3 1010 молекул каждого РНКфрагмента, 200 ед обратной транскриптазы M-MLV, обладающей (РНКаза H+) и не обладающей (РНКаза H) активностью РНКазы Н, и праймера А (комплементарного 3'концу 3'-фрагмента). Продукты обратной транскрипции осаждали спиртом, осадок растворяли, и разведения, соответствующие указанному стартовому количеству РНК, размножали в ПЦР с использованием праймеров А и Б (идентичного 5'-концу 5'фрагмента). Гель окрашивали бромистым этидием. Стрелка указывает на специфический продукт ОТ-ПЦР.

Смесь 5'- и 3'- фрагментов РНК отжигали с RQ135-1(-) олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-фрагменту, проводили ОТ и полученную кДНК обнаруживали с помощью жидкостной ПЦР, используя праймеры, соответствующие началу 5'-фрагмента и концу 3'-фрагмента; поэтому специфический продукт ОТ-ПЦР мог образоваться, только если эти фрагменты оказались объединенными в одной молекуле кДНК. Частоту ложной рекомбинации фрагментов оценивали, сравнивая выход рекомбинантной кДНК с выходом обратной транскрипции истинного РНК-рекомбинанта (RQСТ1n1 РНК), который был ранее выделен из продуктов спонтанной рекомбинации между этими фрагментами.

Загрузка...
Сравнивая количества РНК, при которых наблюдается образование примерно одинаковых количеств специфического продукта ОТ-ПЦР (указан стрелкой) в вариантах, где в качестве матрицы служил готовый полноразмерный рекомбинант, с вариантами, где в качестве матрицы служила смесь 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК, можно сказать, что частота ложной рекомбинации составляет примерно 10-3 (рис. 5). Это значительно выше частоты рекомбинации между теми же фрагментами, катализируемой QРис. 6. Уменьшение частоты ложной рекомбинации РНК при понижении концентрации обратной транскриптазы.

Результат электрофореза продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров А и Б (см.

подпись к рис. 5) смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК (А) либо ранее выделенной рекомбинантной РНК RQ187 (Б). ОТ проводили в 20 мкл среды, содержащей указанные количества обратной транскриптазы M-MLV, не обладающей активностью РНКазы Н.

Продукты обратной транскрипции обессоливали с помощью гель-фильтрации и соответствующие разведения добавляли в ПЦР. Гель окрашивали бромистым этидием.

репликазой (10-5), и тем более выше частоты их спонтанной рекомбинации (10-9).

Учитывая длину гомологичных довесков фрагментов, можно сделать вывод, что частота ложной рекомбинации больше, чем 10-5 на 1 нуклеотид.

Зависимость частоты ложной рекомбинации РНК от наличия активности РНКазы Н. В литературе отмечалось, что частота смены матриц существенно снижается, если обратная транскриптаза не имеет активности РНКазы Н (Luo and Taylor 1990. J. Virol. 64, 4321-4328; Negroni et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6971-6975).

Поэтому мы надеялись снизить уровень ложной рекомбинации, используя обратную транскриптазу, не обладающей активностью РНКазы Н. Однако из рисунка 5 следует, что обратная транскриптаза M-MLV, лишенная активности РНКазы Н (SuperScript® II) осуществляет смену матриц не менее эффективно, чем обратная транскриптаза M-MLV дикого типа, обладающая активностью РНКазы Н.

Влияние концентрации обратной транскриптазы на частоту ложной рекомбинации РНК. В литературе описано, что увеличение концентрации обратной транскриптазы повышает частоту смены матриц (Negroni et al. 1995. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 92, 6971-6975). Мы проверили, можно ли понизить ложную рекомбинацию РНК-фрагментов путем уменьшения количества обратной транскриптазы M-MLV в реакционной смеси по сравнению со стандартной, рекомендуемой фирмамипроизводителями (200 ед на 20 мкл среды). Для этого 5'- и 3'- фрагменты RQ135-1(-) РНК (рис. 6Б) либо ранее выделенный РНК-рекомбинант RQ187 (рис. 6А) отжигали с Рис. 7. Уменьшение частоты ложной рекомбинации в ходе обратной транскрипции при проведении реакции в геле.

Выход рекомбинантов определяли путем подсчета колоний ДНК, полученных в результате проведения и ОТ, и ПЦР в геле (верхний ряд), либо ОТ в жидкости, а ПЦР в геле (нижний ряд) с использованием праймеров А и Б (см. подпись к рис. 5). В качестве матрицы использовали либо смесь 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК, либо рекомбинантную РНК RQ187. Обратную транскрипцию проводили в присутствии 200 ед обратной транскриптазы M-MLV (USB). Колонии выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентно меченным олигодезоксинуклеотидом.

олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-фрагменту, а затем проводили ОТ с использованием 200 или 2 ед обратной транскриптазы. Оказалось, что 100-кратное понижение концентрации обратной транскриптазы снижает частоту ложной рекомбинации приблизительно в 100 раз (рис. 6Б), но при этом не существенно влияет на эффективность обратной транскрипции рекомбинантной РНК (рис. 6А).

Таким образом, уменьшая концентрацию обратной транскриптазы, можно понижать частоту ложной рекомбинации.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК при проведении обратной транскрипции в геле. Мы предположили, что проведение обратной транскрипции в геле поможет снизить частоту ложной рекомбинации из-за пространственного разделения участников рекомбинации.

Оказалось, что это действительно так. Частота ложной рекомбинации при обратной транскрипции фрагментов RQ135-1(-) РНК в геле составила примерно 10-5, а в жидкости 10-3 (рис. 7, ср. число колоний, образованных смесью РНК-фрагментов и продуктом их рекомбинации). Таким образом, проведение обратной транскрипции в геле позволяет снизить частоту ложной рекомбинации примерно в 100 раз.

Рис. 8. Зависимость фосфоролиза РНК Tth-ПНФазой от концентрации ионов Mg2+.

Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле 0,5 пмоль 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, отожженного в присутствии либо в отсутствие 2,5 пмоль олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу РНК, после инкубации с 2 пмоль Tth-ПНФазы и 1 мМ Naфосфатом при указанных концентрациях MgCl2 при 65°С. Каждая проба содержала 0,056 мМ ЭДТА. Гель окрашивали серебром.

3. Избирательное уничтожение РНК с помощью полинуклеотидфосфорилазы Проблемы обратной транскрипции, являющиеся источником как ложноотрицательных результатов (неспецифический синтез кДНК), так и ложноположительных результатов (ложная рекомбинация), можно было бы решить, уничтожив перед обратной транскрипцией посторонние РНК, но сохранив искомые.

Например, можно было бы избирательно уничтожить посторонние РНК с помощью 3'5'-экзорибонуклеазы, тем или иным способом защитив 3'-конец целевой РНК.

Ранее было показано, что 3'5' экзорибонуклеаза полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза) из клеток Escherichia coli разрушает поли(А)-последовательность на 3'-конце эукариотических мРНК, но не разрушает остальную часть мРНК, если реакцию проводят в условиях, когда вся РНК, за исключением поли(А)-последовательности, сохраняет вторичную структуру (Soreq et al. 1974. J. Mol. Biol. 88, 233-245). Однако данная экзорибонуклеаза не может быть использована для уничтожения любой РНК, так как она не активна в условиях, разрушающих вторичную структуру РНК. Мы предположили, что с этой целью можно использовать ПНФазы из термофильных организмов, так как они остаются активными при высокой температуре, дестабилизирующей вторичную структуру РНК. Однако способность ПНФаз из термофильных организмов осуществлять фосфоролиз РНК не была исследована.

Свойства полинуклеотидфосфорилазы Thermus thermophilus. В 1977 году был выделен препарат ПНФазы из T. thermophilus (Tth-ПНФазы), однако оказалось, Рис. 9. Уменьшение частоты ложной рекомбинации фрагментов РНК в результате избирательной деградации одного из фрагментов перед обратной транскрипцией.

(А) Результат электрофореза в 8% полиакриламидном геле отожженной смеси 5'- и 3'фрагментов RQ135-1(-)РНК и олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу 3'фрагмента, после инкубации в отсутствие (-) или в присутствии Tth-ПНФазы (+) при 65°С в течение 15 мин. Гель окрашивали серебром.

(Б) Продукты ОТ-ПЦР отожженной смеси 5'-, 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК и олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-фрагменту РНК, либо RQ135-1(-) предынкубированных, либо не предынкубированных с Tth-ПНФазой при 65°С в течение 15 мин перед ОТ-ПЦР. Гель окрашивали бромистым этидием. Стрелка указывает положение продукта рекомбинации фрагментов по механизму смены матриц.

что он полностью лишен фосфорилазной активности – вероятно, в результате его протеолитической деградации в процессе выделения (Hishinuma et al. 1977. Eur. J.

Biochem. 77, 575-583). Мы показали, что этот же фермент, очищенный из клеток E.

coli, содержащих плазмиду, несущую ген Tth-ПНФазы, обладает фосфорилазной активностью и позволяет полностью уничтожить при 65°С 3'-фрагмент RQ135-1(-) РНК, который обладает очень стабильной вторичной структурой. В то же время Tth-ПНФаза не разрушает РНК, 3'-конец которой гибридизован с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом (рис. 8). Из этого следует, что исследуемый препарат действительно обладает 3'5'-экзонуклеазной активностью, а также то, что РНК можно специфически защитить олигонуклеотидом, комплементарным ее 3'-концу.

Mg2+ и некоторые другие двухвалентные катионы являются кофакторами TthПНФазы, однако при высокой температуре, необходимой для разрушения вторичной структуры, они могут также вызывать неэнзиматическую деградацию РНК. Мы выяснили, что полный фосфоролиз незащищенной РНК наблюдается при эквимолярных концентрациях Mg2+ и ЭДТА (рис. 8). Это позволяет проводить энзиматическую деградацию РНК при очень низкой концентрации свободных ионов Mg2+, когда неэнзиматическая деградация минимальна. В последующих 2+ экспериментах концентрацию ионов Mg поддерживали на уровне 40 – 100 мкМ.

Рис. 10. Влияние модификаций 3'-конца на деградацию РНК Tth-ПНФазой.

(А) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину, смеси 5'-фрагмента (нижняя полоса) и 3'-фрагмента (верхняя полоса) RQ135-1(-) РНК, в которой 5'-фрагмент окислен периодатом (3'oxi), а 3'-фрагмент не модифицирован (3'ОН).

Смесь не обрабатывали (Н/О) или обрабатывали Tth-ПНФазой (ее количества указаны в пмоль), либо не подвергая предварительным обработкам («исходная смесь»), либо предварительно обрабатывая анилином («после анилина»), в результате чего на 3'-конце 5'фрагмента оказывался фосфат (3'P), либо обрабатывая анилином, а затем фосфатазой («после фосфатазы»), снимающей фосфатную модификацию (3'ОН).

(Б) Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, либо модифицированного биотином на 3'-конце (3'БИО), либо без модификаций (3'OH), который был либо не обработан (–), либо обработан 2 пмоль Tth-ПНФазы (+), либо смешан со стрептавидином перед электрофорезом (Стр). Гели окрашивали серебром.

Снижение частоты ложной рекомбинации РНК путем уничтожения одного из субстратов Tth-ПНФазой. Рис. 9А демонстрирует, что если Tth-ПНФазой обработать отожженную смесь и 3'-фрагментов RQ135-1(-)РНК, а также 5'олигодезоксинуклеотида, комплементарного 3'-концу 3'-фрагмента, то защищенный олигонуклеотидом остается целым, а полностью 3'-фрагмент 5'-фрагмент уничтожается. Таким образом, Tth-ПНФаза позволяет осуществлять селективную деградацию РНК.

Рис. 9Б демонстрирует, что такая обработка на 2-3 порядка снижает частоту ложной рекомбинации 5'- и 3'-фрагментов при обратной транскрипции.

Защита РНК модификацией 3'-конца. В данном эксперименте смесь немодифицированного 3'-фрагмента и 5'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, окисленного периодатом натрия с образованием диальдегидной группы на 3'-конце, инкубировали с Tth-ПНФазой либо сразу, либо после обработки анилином (в результате чего на 3'конце 5'-фрагмента оказывалась фосфатная группа), либо после дополнительной обработки фосфатазой (что восстанавливало 3'-гидроксил на 5'-фрагменте). Рис. 10А демонстрирует, что для защиты от деградации ПНФазой можно использовать не только олигонуклеотид, но и модификацию 3'-конца РНК, причем высокая устойчивость 3'-фосфорилированной РНК к Tth-ПНФазе не связана с химической модификацией полирибонуклеотидного остова в процессе обработки периодатом или Рис. 11. Защита от ПНФазы трех «вложенных» РНК, различающихся длиной 3'концевой части, олигонуклеотидом, комплементарным 3'-концу наименьшей из РНК.

Результат электрофореза в 6% полиакриламидном геле: (А) РНК, обработанных (+) или не обработанных (-) Tth-ПНФазой в отсутствие или в присутствии олигодезоксинуклеотида Rкомплементарного каждой из РНК в позиции 72-109; (Б) наиболее длинной (PvuII) РНК, не обработанной или обработанной (+) Tth-ПНФазой в присутствии (-) олигодезоксинуклеотида R-38, либо не модифицированного (б/м), либо содержащего 6 LNA-модифицированных звеньев, сгруппированных вблизи 5'-конца (LNA1), или распределенных по его длине (LNA2). Стрелками показано положение продуктов, устойчивых к деградации. Гели окрашивали серебром. (В) - Радиоавтограф 6% секвенирующего полиакриламидного геля после электрофореза в денатурирующих условиях [-32P]РНК (SmaI, EcoRI, PvuII). 1 - полноразмерная SmaI-РНК, 5 – EcoRI-РНК, частично деградированная слабой щелочью с целью получения 1-нуклеотидной «лесенки». 2–4 - продукты деградации SmaI-, EcoRI- и PvuII-РНК, соответственно, гибридизованных с олигодезоксинуклеотидом R-38.

анилином, так как РНК становится вновь подверженной фосфоролизу после удаления 3'-фосфата фосфатазой.

Если окисленную РНК обработать гидразидом биотина, что приводит к добавлению биотиновой группы на 3'-конец РНК, то РНК также становится устойчивой к действию ПНФазы (рис. 10Б). Наличие биотиновой группы на 3'-конце РНК подтверждается изменением подвижности РНК при электрофорезе в полиакриламидном геле при образовании ее комплекса со стрептавидином.

Защита РНК от действия Tth-ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным внутреннему участку РНК. Не всегда олигонуклеотид, комплементарный 3'-концу, может обеспечить избирательную защиту РНК. Например, большинство эукариотических мРНК имеют на 3'-конце поли(А)-последовательность.

В этом случае, избирательную защиту мог бы обеспечить олигонуклеотид, комплементарный внутреннему участку РНК. Чтобы проверить такую возможность, мы использовали точный 3'-фрагмент RQ135-1(-) РНК (SmaI) и его удлиненные на 28 нт (EcoRI) и 194 нт (PvuII) варианты, полученные путм транскрипции плазмиды, несущей кДНК 3'-фрагмента и линеаризованной, соответственно, по сайту рестрикции SmaI и нижележащим сайтам EcoRI и PvuII. Полученные РНК гибридизовали с олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-концевой последовательности наиболее короткой РНК (SmaI) и внутренним последовательностям более длинных РНК (EcoRI и PvuII), а затем инкубировали с Tth-ПНФазой. Видно, что олигонуклеотид защищает всю SmaI-РНК, но лишь часть EcoRI- и PvuII-РНК (рис. 11А), то есть TthПНФаза удаляет одноцепочечный участок, выступающий на 3'-конце. В результате образуется устойчивый продукт, который оказывается примерно на 8 нт длиннее, чем SmaI-РНК, что было показано с использованием электрофореза высокого разрешения (рис. 11В). Из рисунка 11А также следует, что, выход укороченных EcoRI- и PvuII-РНК существенно ниже 100%. Следовательно, олигонуклеотид, гибридизованный с внутренним участком, не может полностью остановить ПНФазу, начавшую деградацию РНК. Это, по-видимому, вызвано тем, что в ходе инкубации гибрид «дышит»: как только олигонуклеотид частично диссоциирует от РНК, он вытесняется связанной с РНК ПНФазой.

Мы предположили, что стабилизация гибрида может повысить защитный эффект олигонуклеотида. С этой целью использовали олигонуклеотиды, часть звеньев которых содержат рибозные кольца, фиксированные в 3'-эндо-конфигурации путем введения 2'-O,4'-C-метиленового мостика (LNA-модификация, от «locked nucleic acid»). Оказалось (рис. 11Б), что введение LNA-аналогов нуклеотидов в состав олигодезоксинуклеотида, комплементарного внутреннему участку РНК, действительно улучшает защиту РНК от действия ПНФазы. После деградации наблюдается примерно одинаковое количество укороченной РНК независимо от того, как распределены LNA-модифицированные звенья (сгруппированы у 5'-конца или распределены по длине олигонуклеотида). Полученные результаты демонстрируют, что РНК можно эффективно защитить от ПНФазы олигонуклеотидом, комплементарным внутреннему участку РНК. Помимо борьбы с артефактами обратной транскрипции, это можно использовать для выделения РНК определенного вида из сложных природных смесей, а также для получения РНК, укороченных с 3'конца на заданную величину.

4. Применение разработанных подходов для изучения истинной рекомбинации РНК, осуществляемой Q-репликазой Поскольку рекомбинация РНК – редкое событие, то для того, чтобы обнаружить продукты рекомбинации, их необходимо размножить. В нашей лаборатории была создана система для размножения рекомбинантных РНК, использующая QРис. 12. Применение селективной деградации РНК для наблюдения рекомбинации РНК, осуществляемой Q-репликазой in vitro.

(А) Колонии ДНК, выросшие из продуктов ОТ, осуществленной с использованием 20 ед обратной транскриптазы M-MLV, смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК, предынкубированной в отсутствие (нижний ряд) или в присутствии (верхний ряд) Qрепликазы в течение 45 с, а затем с Tth-ПНФазой в условиях, обеспечивающих избирательную деградацию 5'-фрагмента.

(Б) Электрофоретический анализ в 8% полиакриламидном геле содержимого колоний (элюат). М - продукт ложной рекомбинации смеси 5'- и 3'-фрагментов RQ135-1(-) РНК (157 п.о.).

репликазу, которая в изотермических условиях экспоненциально размножает полноразмерные реплицирующиеся РНК, но не может размножать их фрагменты (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Такой подход позволил впервые наблюдать и изучать рекомбинацию РНК in vitro, но у него есть ряд ограничений. Во-первых, из-за узкой матричной специфичности Q-репликазы, определнные виды рекомбинантов обладают преимуществом при размножении; иными словами, продукты рекомбинации подвергаются селекции, что искажает результаты. Во-вторых, в этой системе нельзя изучать рекомбинацию молекул РНК, не являющихся матрицами для Q-репликазы.

Избежать указанных ограничений помог бы праймер-зависимый способ размножения, такой как ОТ-ПЦР, позволяющий приблизительно с равной эффективностью размножать практически любые последовательности, заключенные между заданными праймер-специфичными участками. Однако до настоящего времени применению ОТ-ПЦР с этой целью препятствовала ложная рекомбинация РНК при обратной транскрипции, частота которой превышает частоту истинной рекомбинации.

Разработанные способы подавления ложной рекомбинации мы использовали для размножения с помощью ОТ-ПЦР продуктов рекомбинации между 5'- и 3'фрагментами RQ135-1(-) РНК, катализируемой Q-репликазой (Chetverin et al. 1997.

Cell 88, 503-513). Были выбраны два прима: 1) избирательная деградация 5'фрагмента перед ОТ с помощью Tth-ПНФазы и 2) осуществление ОТ при пониженной концентрации обратной транскриптазы. Фрагменты РНК - субстраты рекомбинации Рис. 13. Содержание разных типов рекомбинантных РНК при использовании различных способов их размножения.

Относительная частота (в %) встречаемости рекомбинантов двух типов, размноженных с помощью (А) ОТ-ПЦР в данной работе и (Б) Q-репликазы (Chetverin et al. 1997. Cell 88, 503-513). Фрагменты RQ135-1(-)РНК показаны частично. Последовательности гомологичных чужеродных довесков выделены жирным шрифтом. Стрелки соединяют нуклеотиды, между которыми произошла рекомбинация.

инкубировали с репликазой и нуклеозидтрифосфатами в течение короткого промежутка времени (45 с), чтобы исключить экспоненциальное размножение продуктов рекомбинации. После фенольной экстракции, РНК отжигали с олигодезоксинуклеотидом, комплементарным 3'-концу 3'-фрагмента RQ135-1(-) РНК, а значит и рекомбинантной РНК того же знака, и подвергали фосфоролизу TthПНФазой. Tth-ПНФазу убирали фенольной депротеинизацией и проводили ОТ, используя 20 ед обратной транскриптазы M-MLV. ПЦР проводили в геле, а выросшие колонии ДНК выявляли посредством гибридизации на мембране с флуоресцентномеченным олигонуклеотидом, гомологичным чужеродным довескам фрагментов (рис. 12А). О том, что эти колонии образованы продуктами истинной рекомбинации РНК, говорит тот факт, что колоний нет в вариантах, где репликазу не добавляли.

Электрофоретическая подвижность материала колоний, элюированного из геля (рис. 12Б, дорожка отличается от подвижности ложного рекомбинанта, 1), образованного из тех же фрагментов РНК обратной транскриптазой (рис. 12Б, дорожка М).

Клонирование и секвенирование содержимого колоний показало, что они не содержат рекомбинантов гомологичного типа, которые могли бы образоваться при рекомбинации по механизму смены матриц. Все обнаруженные рекомбинанты являются негомологичными (рис. 13А), как и рекомбинанты, размноженные Qрепликазой (рис. 13Б). В каждом случае можно выделить два типа рекомбинантов.

Первый тип представлен молекулами, включающими оба субстрата рекомбинации целиком, а второй тип – молекулами, включающими целый 5'-фрагмент, но укороченный с 5'-конца 3'-фрагмент. Однако относительное содержание этих типов в продуктах рекомбинации является диаметрально противоположным. Так, первый тип составляет более 80% продуктов рекомбинации, размноженных с помощью ОТ-ПЦР, но лишь чуть более 10% продуктов рекомбинации, размноженных Q-репликазой.

Таким образом, при использовании разных способов размножения частота встречаемости различных типов рекомбинантов существенно отличается. Повидимому, это отражает преимущественное размножение Q-репликазой рекомбинантов второго типа. Размножение же с помощью ОТ-ПЦР, особенно в формате молекулярных колоний, где отсутствует конкуренция между ампликонами, происходит практически в отсутствие селекции. Поэтому следует сделать вывод, что именно первый тип рекомбинантов, включающих оба субстрата рекомбинации целиком, является основным продуктом рекомбинации, катализируемой Qрепликазой.

5. Применение разработанных подходов для высокочувствительной и специфичной диагностики Определение вирусных РНК и ДНК в крови. Определение одиночных молекул вирусных РНК и ДНК в крови позволяет выявлять зараженную донорскую кровь на станциях переливания крови и таким образом препятствовать распространению опасных инфекций, а также отслеживать стадию заболевания и эффективность лечения инфицированных пациентов. На рис. 1Б показан результат одного из модельных экспериментов, в котором в лизат 100 мкл крови здорового донора добавили 150 молекул фрагмента РНК вируса СПИД (HIV-1) и 50 молекул фрагмента ДНК вируса гепатита B (HBV), затем суммарные нуклеиновые кислоты выделили с помощью разработанного нами метода и, после ОТ в жидкости, кДНК HIVи HBV обнаружили в виде молекулярных колоний. Результаты демонстрируют, что разработанные нами подходы позволяют специфически обнаруживать в клинических образцах 50% вирусной РНК-мишени и 100% ДНК-мишени. Это соответствует чувствительности, равной 2 молекулам РНК и 1 молекуле ДНК на фоне 50-100 мкг нуклеиновых кислот человека, содержащихся в 100 мкл крови, что более чем в триллион раз превышает массу искомой мишени.

Обнаружение маркера острого миелоидного лейкоза мРНК AML1-ETO в образцах пациентов. Разработанные подходы, включающие усовершенствованный метод выделения РНК, оптимизированную стадию обратной транскрипции и ПЦР в Рис. 14. Отсутствие мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 1.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из 90 мкл костного мозга (А) или цельной крови (Б), взятых в указанные даты, подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента SuperScript® и ПЦР в геле, либо без добавления (верхний ряд), либо с добавлением 135 молекул мРНК AML1-ETO (нижний ряд). Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами.

гелях, мы применили для ретроспективного анализа минимальной остаточной болезни у прошедших химиотерапию больных острым миелоидным лейкозом, ассоциированным с хромосомной транслокацией t(8;21). Молекулярным маркером этого вида лейкоза является мРНК синтезирующаяся в AML1-ETO, трансформированных лейкоцитах при транскрипции химерного гена, образованного в результате указанной транслокации. Были исследованы образцы крови и костного мозга двух пациентов, взятые через определенные промежутки времени.

Оказалось, что у пациента 1 маркерная РНК не выявляется в пробах крови и костного мозга, взятых с интервалом в шесть месяцев (рис. 14, верхний ряд). Когда к тем же образцам добавили по 135 молекул фрагмента мРНК AML1-ETO, то наблюдали рост специфических колоний кДНК, число которых составляло примерно 50% от числа добавленных молекул (рис. 14, нижний ряд). Отсюда следует, что чувствительность выявления маркера лейкоза – 2 молекулы РНК, такая же, как и чувствительность выявления вирусной РНК. Кроме того, этот контроль демонстрирует, что отрицательный результат был получен потому, что маркерная РНК отсутствует в образцах крови и костного мозга данного пациента, а не потому, что она не была выявлена, например, из-за подавления ОТ-ПЦР примесями или неспецифическим синтезом. Первые пробы костного мозга и крови пациента 2 также дали отрицательный результат (рис. 15).

Рис. 15. Изменение количества мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге пациента 2.

РНК, выделенную с помощью усовершенствованного метода из образцов костного мозга (А) или цельной крови (Б), подвергли обратной транскрипции с 2 ед фермента SuperScript® II и ПЦР в геле. Колонии ДНК выявляли посредством гибридизации в геле с FRET-зондами. Указаны даты отбора и объемы анализируемых образцов.

Однако, в пробе, взятой через три месяца, было обнаружено небольшое количество мРНК AML1-ETO, а спустя еще четыре месяца титр этой РНК вырос более чем на порядок, что сопровождалось проявлением признаков заболевания.

Повторный курс химиотерапии снизил содержание маркерной РНК до нуля. Таким образом, маркерную РНК удалось обнаружить в образцах, взятых у пациента за четыре месяца до клинического рецидива. Если бы это было сделано вовремя, то наступление рецидива можно было бы предотвратить.

Чувствительность диагностики принято выражать в минимальной детектируемой доле лейкемических клеток от общего числа ядерных клеток. Чтобы сопоставить чувствительность нашей процедуры с чувствительностью диагностических процедур, используемых в настоящее время, мы перевели полученное нами абсолютное значение в общепринятую форму, допустив, что в одной лейкемической клетке содержится около 100 молекул мРНК AML1-ETO. При чувствительности 2 молекулы маркерной РНК в 90 мкл препарата можно обнаружить одну лейкемическую клетку в 4,5 мл клинического образца, если весь образец подвергнуть лизису и для анализа взять РНК, выделенную из 1/50 части лизата. Это соответствует чувствительности диагностики 10-7 – 10-8 (одна лейкемическая клетка на фоне 107 – 108 здоровых лейкоцитов в крови и костном мозге соответственно).

Исследования по программе «Европа против рака» показали, что чувствительность детекции лейкемических клеток типа t(8;21) на основе ОТ-ПЦР в реальном времени составляет 10-4. Таким образом, чувствительность разработанной процедуры на несколько порядков выше чувствительности существующих методов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, обеспечивающие близкий к 100% выход РНК и ее освобождение от ингибиторов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

2. Оптимизирована реакция обратной транскрипции (ОТ) в присутствии большого количества посторонних нуклеиновых кислот. Выход кДНК при использовании специфического праймера увеличен до 50% от количества РНК-матрицы.

–  –  –

4. Установлено, что частота ложной рекомбинации РНК при ОТ in vitro превышает 105 на 1 нуклеотид и не зависит от того, обладает ли обратная транскриптаза активностью РНКазы Н.

5. Показано, что ложную рекомбинацию РНК при ОТ можно понизить в 100 или более раз с помощью каждого из следующих способов:

- избирательной деградации одного из субстратов рекомбинации Tth-ПНФазой;

- проведения обратной транскрипции в геле;

- понижения концентрации обратной транскриптазы.

–  –  –

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах

Статьи в научных журналах:

1. Фалалеева М.В., Четверина Е.В., Кравченко А.В., Четверин А.Б. 2009.

Применение наноколоний для выявления минимальной остаточной болезни при лейкозе t(8;21). Молекуляр. Биология. 43, 180-189.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.I., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2008.

Factors influencing RNA degradation by Thermus thermophilus polynucleotide phosphorylase. FEBS J. 275, 2214-2226.

3. Четверина Е.В., Кравченко А.В., Фалалеева М.В., Четверин А.Б. 2007. Экспрессгибридизация молекулярных колоний с флуоресцентными зондами. Биоорган.

химия. 33, 456-463.

4. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Chetverin A.B. 2004. Simultaneous assay of DNA and RNA targets in the whole blood using novel isolation procedure and molecular colony amplification. Anal. Biochem. 334, 376-381.

Тезисы конференций:

1. Четверина Е.В., Фалалеева М.В., Саматов Т.Р., Четверин А.Б. 2008.

Количественная диагностика с помощью наноколоний. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 12мая 2008 г. С. 303.

2. Falaleeva M.V., Chetverina H.V., Ugarov V.I., Uzlova E.A., Chetverin A.B. 2007.

Polynucleotide phosphorylase from Thermus thermophilus as a tool for studies on RNA recombination. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function". Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 31.

3. Chetverina H.V., Falaleeva M.V., Samatov T.R., Kravchenko A.V., Zabolotneva Y.A., Chetverin A.B. 2007. Diagnostic potential of the molecular colony technique. Abstracts of the International Conference "Protein Biosynthesis, Structure and Function".

Pushchino, Russia, June 9-13, 2007. P. 29.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«ИСАКОВ Павел Владимирович СИГОВЫЕ РЫБЫ В ОБСКОЙ ГУБЕ: ПОЛОВЫЕ ЦИКЛЫ, СОСТОЯНИЕ ЖИЗНЕННО-ВАЖНЫХ ОРГАНОВ 03.00.16 экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Борок 2009 Работа выполнена в отделе эколого-сырьевых исследований ФГУП «Госрыбцентр» и в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем Тюменского государственного университета. кандидат биологических наук, доцент Научный руководитель: Селюков Александр Германович...»

«ВЕРДИЕВ БАХТИЯР ИСРАИЛ ОГЛЫ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОГЕНЕЗА НЕОКОРТЕКСА И СЕТЧАТКИ ЧЕЛОВЕКА IN VIVO И IN VITRO 03.03.05 биология развития, эмбриология 03.02.07 генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории экспериментальной нейробиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Научные руководители: доктор...»

«ЕВДОКИМОВА Елена Анатольевна МИКОЗЫ ВИНОГРАДНОЙ ЛОЗЫ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ 06.01.11. – защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный НИИ садоводства и виноградарства Россельхозакадемии Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук Талаш Анна Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор...»

«УДК 333.93+577.4 Сорокин Алексей Николаевич ЭКОЛОГИЯ И СИНТАКСОНОМИЯ ПРИМОРСКИХ СООБЩЕСТВ КЛАССОВ CAKILETEA MARITIMAE И HONCKENYO-ELYMETEA ARENARII ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ Специальность: 03.00.16 – «Экология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тольятти – 2007 Диссертация выполнена в группе фитоценологии Института экологии Волжского бассейна Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Голуб...»

«ФЕДИН АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИНОСИНУСИТОВ 14.03.09. – аллергология и иммунология 14.01.03. – болезни уха, горла и носа АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Пенза – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения...»

«ЛАШИНА Нина Михайловна СОЗДАНИЕ ДИГАПЛОИДОВ ЯЧМЕНЯ КАК ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ СОРТОВ С ГРУППОВОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К БОЛЕЗНЯМ Шифр и наименование специальности 06.01.07 – Защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт – Петербург Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (ФГБНУ ВИЗР) Научный...»

«Бельский Евгений Анатольевич ЭКОЛОГИЯ ПТИЦ ИМПАКТНЫХ РЕГИОНОВ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Безель Виктор Сергеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рябицев Вадим Константинович доктор...»

«ХАМИНИЧ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ХОЗЯЙСТВЕННО – БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ СИММЕНТАЛЬСКОГО СКОТА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕНОФОНДА ГОЛШТИНСКОЙ ПОРОДЫ 06.02.07 – разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Ульяновск 2014 Работа выполнена на кафедре разведения, генетики и животноводства федерального государственного бюджетного образовательного...»

«Олейникова Елена Михайловна СТЕРЖНЕКОРНЕВЫЕ ТРАВЫ ЮГО-ВОСТОКА СРЕДНЕЙ РОССИИ Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Воронеж – 2015 Работа выполнена на кафедре биологии и защиты растений ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I» Османова Гюльнара Орудж кзы, доктор биоОфициальные оппоненты: логических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Марийский государственный...»

«ВЕДЕНИНА Варвара Юрьевна РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ АКУСТИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ В МИКРОЭВОЛЮЦИИ САРАНЧОВЫХ (INSECTA, ACRIDIDAE, GOMPHOCERINAE) 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2014 Работа выполнена в лаборатории обработки сенсорной информации федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук Официальные оппоненты:...»

«ЗАКС Михаил Михайлович ЭКОЛОГИЯ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (Rana esculenta complex) ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный университет на кафедре...»

«РОДИОНОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОГО НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОСТАТИТА И ЕГО ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ 14.00.10 – Инфекционные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в ФГУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНОИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ» Федеральной службы по защите прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель: доктор медицинских...»

«СИМОНОВИЧ ЕЛЕНА ИЛЬИНИЧНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВИЗАТОРОВ ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ростов-на-Дону 2011 Работа выполнена на кафедре зоологии и в НИИ Биологии Южного Федерального университета доктор биологических наук, профессор Научный консультант: Казадаев Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:...»

«ХИЖНЯК ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА БАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОБИЛИЗАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДОВ Специальность 03.02.03 микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 20 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН) Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, Кондратьева Тамара Федоровна, зав....»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»

«Калякин Евгений Александрович ПОЗДНЕМЕЛОВЫЕ МОРСКИЕ ЕЖИ СРЕДНЕГО И НИЖНЕГО ПОВОЛЖЬЯ: ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, СТРАТИГРАФИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Специальность: 25.00.02 – палеонтология и стратиграфия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Саратов – 2015     Работа выполнена на кафедре исторической геологии и палеонтологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Евгений Михайлович Первушов,...»

«Гапон Дмитрий Александрович ТАКСОНОМИЧЕСКИЙ ОБЗОР МИРОВОЙ ФАУНЫ КЛОПОВ-ЩИТНИКОВ (HETEROPTERA: PENTATOMIDAE) ПОДСЕМЕЙСТВ ASOPINAE И PODOPINAE 03.00.09 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в лаборатории систематики насекомых Зоологического института РАН. Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Кержнер Изяслав Моисеевич. Официальные оппоненты доктор биологических наук,...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Казань 2015 Работа выполнена в отделе биологической безопасности Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и...»

«МАНТАТОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЖЕЛУДКА ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ ПРИ В1-ГИПОВИТАМИНОЗЕ И ПУТИ ЕГО КОРРЕКЦИИ 06.02.01 диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Улан-Удэ 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р.Филиппова» на кафедре терапии и клинической диагностики Научный консультант:...»

«УЛАНОВА Светлана Андреевна НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ МУНИЦИПАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ШКОЛ В СФЕРЕ ЗДОРОВЬЕСБЕРЕЖЕНИЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ В УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА 14.02.01 – гигиена АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Сыктывкарский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации и НИИ гигиены и охраны здоровья детей и подростков ФГБНУ «Научный центр здоровья детей» Научный...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.