WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Сургутский государственный университет

Ханты-Мансийского автономного округа – Югры»

На правах рукописи

Куяров Артём Александрович

РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА

В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ

АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА



03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Миронов Андрей Юрьевич доктор биологических наук Алёшкин Андрей Владимирович Москва – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение Глава 1. Роль нормальной микрофлоры и лизоцима в выборе пробиотических штаммов для профилактики аллергических заболеваний у студенческой молодежи (обзор литературы)

1.1. Значение микробиоценоза и лизоцима в механизмах врождённого иммунитета

1.2. Биологическое значение лактобацилл 33

1.3. Микробный фактор образования свободного гистамина 38

1.4. Подбор пробиотических штаммов лактобацилл 46 Глава 2. Диагностическая информативность факторов врождённого иммунитета у бактерионосителей Staphylococcus spp. 55

2.1. Оценка содержания лизоцима и гистамина в слюне бактерионосителей Staphylococcus spp.

2.2. Биоценоз слизистой оболочки носа и зева, содержание лизоцима и гистамина в группах риска аллергического ринита и атопического дерматита

2.3. Диагностическая информативность факторов колонизации микрофлоры слизистой носа и зева Глава 3. Идентификация и лизоцимная активность лактобацилл при дисбактериозе кишечника в группах риска по аллергическим заболеваниям 73

3.1. Микробное сообщество и видовой состав лактобацилл при дисбактериозе кишечника

3.2. Лизоцимная активность бактерий рода Lactobacillus, выделенных из кишечника исследуемых лиц группы риска по аллергическим заболеваниям Глава 4. Оптимизация выбора пробиотических штаммов лактобацилл для студенческой молодежи в условиях Cевера 79

4.1. Кислотообразующая и сахаролитическая активность проби

–  –  –

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Среди базовых защитных систем, определяющих устойчивость человека к неблагоприятным физическим, химическим, биологическим факторам среды обитания или их комплексу, в последнее время наибольшее внимание уделяют его иммунной системе и симбиотической микробиоте, постоянно обитающей на коже и слизистых.[3, 8, 53, 61] Эти две системы находятся между собой во взаимовыгодных взаимоотношениях. Нарушение их согласованной работы обязательно влечет за собой не только модификацию функций и реакций каждой из них, но и негативно отражается на общей эффективности защиты организма.[40, 60, 70] Микроорганизмы, попадающие в организм извне, и представители индигенной (симбиотической) микробиоты, контактируя с образраспознающими рецепторами эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, в частности, с Tollподобными рецепторами, индуцируют в клетках продукцию широкого спектра различных медиаторов, включая провоспалительные и противовоспалительные цитокины.[16, 70] Их количество и соотношение, в конечном счёте, ответственны за развитие инфекционно-воспалительных заболеваний или за элиминацию возбудителя из очага внедрения.[58, 72] Длительное проживание в неблагоприятных условиях урбанизированного Севера ведёт к глубоким нарушениям микробной экологии и иммунитета человека. Это способствует возникновению у некоренных жителей Севера хронического воспаления, одного из ведущих факторов риска инфекционных, аллергических, хронических аутоиммунных и метаболических заболеваний.[51, 57] По данным ряда исследований, частота аллергического ринита, [77] атопического дерматита[13], бронхиальной астмы[79] среди пришлого населения Севера намного выше, чем у лиц, проживающих в центральных областях Российской Федерации.[135] Особенно актуальна эта проблема для здоровья в юношеском возрасте, в период онтогенетического развития между подростковым возрастом и взрослостью. [74, 88, 134] При оценке микроэкологических последствий неблагоприятных факторов урбанизированного Севера на здоровье студенческой молодежи считаем целесообразным определять уровень стафилококкового бактерионосительства в популяции жителей Севера, поскольку изменения количества этих микроорганизмов или их биологических и патогенных свойств могут рассматриваться как показатели, позволяющие тестировать интенсивность внешнего воздействия на гомеостатическое состояние человека.




[19, 34, 80] Имеются данные о способности микрофлоры не только изменить пул гистамина в организме человека[23], но и продуцировать ферменты инактивирующие лизоцим.[19]. Важным, с нашей точки зрения, является также оценка содержания гистамина, как медиатора воспалительных и аллергических реакций[31, 109], и лизоцима, как фактора врождённого иммунитета у студентов, страдающих аллергическими заболеваниями, так и не имеющих их.

Вопросы профилактики и коррекции нарушений микрофлоры организма человека в настоящее время приобретают повсеместный характер.[63, 75, 81, 92, 144] При этом важное значение всё более придают пробиотикам, способным восстанавливать нарушенный микроэкологический статус человека и повышать степень иммунной защиты. [2, 5, 27, 145] Необходимость изучения влияния потенциала патогенности микрофлоры слизистой оболочки носоглотки и кишечника на взаимосвязь факторов врождённого иммунитета, одним из которых является лизоцим, с медиатором воспалительных и аллергических реакций гистамином для оптимизации выбора пробиотических штаммов и препаратов определяет актуальность избранной темы.

Степень разработанности темы исследования

Пробиотики находят всё более широкое применение в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры организма человека. [3, 5, 27, 145, 158] В работах отечественных и зарубежных исследователей показано, что общий геном бактерий, обнаруженных в ЖКТ, получивший обозначение как «микробиом», насчитывает 400 тыс. генов, что в 12 раз превышает размер генома человека, насчитывающего 35 тыс. генов. Выполнение программам международного консорциума «Микробиом человека» свидетельствует, что стабильность микробиома человека тесным образом связана с состоянием его здоровья. Возможность стабилизации микробиома, т.е. микробиоты человека, определяет в настоящее время эру метабиомики в гастроэнтерологии. [14, 16] Полагают, что механизм действия пробиотиков тесным образом связан с биологическими характеристиками вводимых в организм человека, в данном случае в его желудочно-кишечный тракт, бактерий-симбионтов и, в частности, с их антагонистической и иммуностимулирующей активностью.[50, 86] Приводятся сведения о лектинах пробиотиков, как о новом классе сигнальных молекул чувства кворума у бактерий.[71] Убедительно показано лиганд-рецепторноое взаимодействие микроорганизмов с Toll-подобными рецепторами с последующей активацией клеточного и гуморального звеньев врождённого иммунитета.

[58, 68, 72] Среди антибиотических веществ определённое внимание исследователей уделено лизоциму, как регулятору микробного биоценоза.[19, 56, 139] Лизоцимная активность нормальной микрофлоры, возможно, совместно с лизоцимом секрета слизистой оболочки, способствует стабилизации индигенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Изучение лизоцимной активности лактобактерий, как представителей нормальной микрофлоры, показало, что лактобактерии образуют своего рода защитный биослой на слизистых оболочках.[73] Проведены исследования микробной экологии и гистаминобразующей активности микроорганизмов задней стенки глотки детей, больных бронхиальной астмой[5] и разработаны композиции, понижающие уровень гистамина, на основе новых штаммов Lactobacillus acidophilus и их консорциума.[110] Наряду с проведёнными исследованиями роли бактерий в механизмах врождённого иммунитета организма, ряд теоретических и практических вопросов данной проблемы остаются неизученными. К их числу следует отнести оценку влияние бактерионосительства на взаимосвязь содержания лизоцима и гистамина в слюне и оценку этой взаимосвязи в группах по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту. Важно также и определение особенностей видового состава и лизоцимной активности лактобацилл микрофлоры кишечника в этих группах риска.

Обоснованная позиция диктует необходимость и важность изучения иммуномодулирующей активности пробиотических бактерий, значительно зависящей от используемого на практике вида и штамма пробиотика.

Цель и задачи Цель исследования. Оптимизировать выбор пробиотических штаммов для профилактики аллергических заболеваний у студенческой молодёжи Севера на основании оценки состояния их нормальной микрофлоры и содержания лизоцима и гистамина в слюне.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние бактерионосительства на взаимосвязь содержания лизоцима и гистамина в слюне, изучив микрофлору слизистой оболочки носа и зева у студенческой молодежи.

2. Дать оценку ферментам патогенности изолятов рода Staphylococcus со слизистой оболочки верхних дыхательных путей, содержания лизоцима и гистамина в слюне у лиц группы риска по аллергическим заболеваниям верхних дыхательных путей и кожи.

3. Определить видовой состав и лизоцимную активность лактобактерий микрофлоры кишечника в группах риска по аллергическим заболеваниям, разработать критерии для коррекции нарушений микрофлоры.

4. Изучить диаминооксидазную, лизоцимную, антагонистическую активность лактобацилл, используемых в качестве пробиотических штаммов и оценить их эффективность.

Научная новизна Впервые доказано, что бактерионосительство Staphylococcus аureus и Staphylococcus еpidermidis с гемолитической активностью сопровождается снижением содержания лизоцима и значительным увеличением содержания гистамина в ротовой жидкости. Соотношение лизоцима и гистамина в этой среде находятся в обратной сильной корреляционной зависимости.

Установлено, что показатели диагностических коэффициентов ферментов колонизационной активности Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, выделенных со слизистой носа и зева, позволяют диагностировать и прогнозировать потенциал патогенности микроорганизмов в развитии воспаления слизистой оболочки и аллергических реакций.

В группах риска по аллергическим заболеваниям наблюдается значительное снижение (в 1,8-1,9 раза) содержания лизоцима, по сравнению с группой сравнения, при достоверном увеличении (в 1,6-1,7 раза) содержания гистамина в слюне.

Впервые установлено, что состояние дисбактериоза кишечника у жителей Севера характеризуется уменьшением видового разнообразия бактерий рода Lactobacillus и низкой их лизоцимной активностью. Относительно часто идентифицируются представители Lactobacillus delbrueskii, Lactobacillus сasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus, реже Lactobacillus fermentum, Lactobacillus corynoformis. В единичных случаях идентифицируются представители видов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus plantarum.

Установлено, что оценка состояния факторов врождённого иммунитета может составить методическую основу для оптимизации диагностики, прогнозирования и коррекции их нарушений пробиотическими штаммами с определённой лизоцимной, декарбоксилирующей, диаминооксидазной и антагонистической активностью.

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретически обоснованы и разработаны диагностические критерии нарушений состояния нормальной микрофлоры и соотношения лизоцима и гистамина в слюне, которые являются биомаркерами в коррекции нарушений микрофлоры слизистой оболочки верхних дыхательных путей и кишечника.

Включение в комплекс методов оценки иммуномодулирующей активности пробиотических штаммов лактобацилл определение их диаминооксидазной, лизоцимной и антагонистической активности может определить выбор оптимального варианта для персонализированной коррекции нарушений микрофлоры студенческой молодежи групп риска по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту, проживающих в условиях урбанизированного Севера.

Разработанные и апробированные диагностические коэффициенты ферментов патогенности микрофлоры слизистой оболочки верхних дыхательных путей, содержания лизоцима и гистамина рекомендуются для прогнозирования риска возникновения круглогодичного аллергического ринита и атопического дерматита.

Оптимизация выбора пробиотических штаммов лактобацилл, потенциально способных уменьшать риск по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту у студенческой молодежи Севера, подтверждается результатами клинико-лабораторных исследований и актами внедрения в лечебнопрофилактический процесс ряда учреждений здравоохранения города Сургута:

МУЗ «КГБ №1»; МУЗ «Городской врачебно-физкультурный диспансер» (акты внедрения от 12.11.2012 г. и 21.04.2013 г).

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах физиологии, детских болезней, в научно-исследовательской лаборатории «Клиническая и экспериментальная патология» ГБОУ ВПО СурГУ ХМАО – Югры (акт внедрения от 11.02.2013 г.).

Методология и методы исследования Методология данной работы спланирована согласно поставленной цели исследования и включает современные методы научного познания для определения характеристик компонентов, необходимых для решения поставленных задач.

Теоретической основой исследования являются данные научной литературы по проблеме факторов врождённого иммунитета и оптимизации выбора пробиотических штаммов лактобацилл.

Предметом исследования явилась взаимосвязь содержания лизоцима и гистамина в слюне у бактерионосителей и студенческой молодежи групп риска по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту, проживающих в условиях урбанизированного Севера.

Объектом исследования послужила микрофлора слизистой оболочки носоглотки и кишечника, а также ротовая жидкость от практически здоровых лиц и лиц группы риска по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту. В работе применялся комплекс бактериологических, биохимических, статистических методов исследования.

Описание исследуемых групп Для оценки состояния факторов врождённого иммунитета и оптимизации выбора пробиотических препаратов на примере студенческой молодежи в условиях Севера проведено клинико-лабораторное исследование лиц, проживших в условиях Севера не менее 10 лет. Исследования проводились на базе лаборатории «Клиническая и экспериментальная патология» ГБОУ ВПО «СурГУ ХМАО

– Югры» (зав. лабораторией доктор медицинских наук, профессор А.В. Куяров) и бактериологической лаборатории БУ ХМАО – Югры «Сургутская окружная клиническая больница» (зав. лабораторией О.Е. Хорева).

Этап 1 Анализ 384 разработочных карт по выявлению аллергических заболеваний среди студенческой молодежи Этап 2 Бактериологическое исследование микрофлоры слизистой оболочки носа и зева, определение лизоцима и гистамина в слюне, n=192 человека Этап 3 Бактериологическое исследование микрофлоры слизистой оболочки носа и зева с определением ферментов патогенности, n=94 ГС, n=31 человек АР, n=31 человек АтД, n=32 человек Этап 4 Исследование лиц группы риска на дисбактериоз кишечника, выделение и идентификация лактобацилл с определением их лизоцимной активности, n=63 Этап 5 Бактериологическая оценка пробиотических штаммов (n=6), рекомендуемых для коррекции и оценка эффективности коррекции по показателям микрофлоры слизистой оболочки носа и зева, концентрации лизоцима и гистамина

Рисунок 1 – Объём и профиль этапов выполнения исследований

Комплекс исследований включал бактериологические, биохимические, анкетные, статистические методы. Объём и дизайн этапов выполнения исследований представлен на рисунке 1.

На первом этапе проведено изучение распространённости симптомов аллергических заболеваний среди студенческой молодежи в возрасте от 18 до 23 лет, проживших в условиях Севера не менее 10 лет. В соответствии со статьями 30-34, 61 Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан от 22.07.1993 г.

№ 5487-1, ст. 18, 20-22, 28, 41 Конституции Российской Федерации все исследуемые лица давали информационное добровольное согласие на выполнение диагностических исследований и лечебных мероприятий, а в соответствии с требованиями статьи 9 Федерального закона от 27.07.2006 «О персональных данных»

№ 152-ФЗ – на обработку персональных данных.

Использованы результаты анкетирования 384 студентов СурГУ по специально разработанному опроснику с включением в анкету наиболее распространённых симптомов аллергического ринита, атопического дерматита, заболеваний желудочно-кишечного тракта, признаков атопии в семейном анамнезе в соответствии с методом популяционных исследований, разработанного в НИИ педиатрии РАМН и опросника анкеты программ «ISAAC» и «SCORAD», адаптированной к российским условиям («Стандартизованные эпидемиологические исследования аллергических заболеваний у детей», 1998).[77, 85] На втором этапе исследований проведено бактериологическое исследование микрофлоры слизистой оболочки носа и зева, определение лизоцима и гистамина в слюне у 192 студентов методом сплошной выборки.

На следующем этапе (№3) по результатам анкетирования определены группы риска по круглогодичному аллергическому риниту (АР, n=31; врач-консультант кандидатом медицинских наук Ю.С. Гацко) и атопическому дерматиту (АтД, n=32; врач-консультант Д.С. Тышкевич). Критерии включения студентов в исследование: наличие АР или АтД с верифицированным диагнозом в соответствии с Российскими национальными рекомендациями по диагностике и лечению АР и АтД (2008-2012 гг.), активный трудоспособный возраст (18-23 года), длительность проживания на Севере не менее 10 лет.

В структуре жалоб группы АР преобладали зуд, чихание, заложенность носа, ринорея, отделяемое из носа.[108] В группе риска с атопическим дерматитом (АтД) критерием диагностики послужило наличия зуда даже при минимальных проявлениях на коже, типичная морфология и локализация, индивидуальная или семейная история атопического заболевания, хроническое рецидивирующее течение.[85] На этом этапе проведено углублённое бактериологическое исследование микрофлоры слизистой оболочки носа и зева с определением ферментов патогенности в группах риска и в группе сравнения (ГС, n=31). Группу сравнения составили студенты, которые не являлись постоянными бактерионосителями S.

aureus и S. epidermidis, hem+ и болевшие ОРЗ не более 1-2 раз в год.

Исследования на этапе №4 включали оценку степени дисбактериоза, выделение и идентификация лактобацилл у лиц групп риска (n=62).

На этапе №5 проведена бактериологическая оценка пробиотических штаммам (n=6 штамма), используемым в практике[73] и пробиотическим штаммам согласно Патентов РФ [96, 97]. Для коррекции нарушений микрофлоры назначались кисломолочные смеси с использованием заквасок лактобацилл как биологически активные добавки.

На заключительном этапе дана оценка эффективности применения пробиотических штаммов показателям микрофлоры слизистой оболочки носа и зева, а также по концентрации лизоцима и гистамина в ротовой жидкости.

Бактериологические методы Выделение и идентификацию микрофлоры слизистых оболочек носа и зева проводили в соответствии с «Методическими указаниями по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях (МУ №535-МЗ, 1985)». [4, 9] При обследовании на стафилококковое носительство исследуемый материал забирали стерильным тампоном со слизистой оболочки носа и зева и засевали на чашки с желточно-солевым агаром и кровяным агаром. После инкубации в термостате (t=37° C) в течение 24 ч проводили количественную и качественную оценку выросших колоний, расчёт микробной обсеменённости.

Загрузка...
При наличии роста 103 и более микробных клеток на тампон, результат оценивался как высокой обсеменённости, свидетельствующий о бактерионосительстве с выделением возбудителя во внешнюю среду.[4, 9] Отдельно растущие колонии разных типов пересевали на скошенный агар и изучали их морфологию при окраске по Граму. При проведении видовой идентификации тестировали активность плазмокоагулазы, лицитиназы, гемолизина, лизоцима, уреазы, протеолитической активности. [9, 62, 65] Активность плазмокоагулазы определяли в соответствии с методическими рекомендациями (МУК 4.2.2602-10) с использованием сухой цитратной кроличьей плазмы. Результаты учитывали через 1, 2, 4, 18 и 24 часа по наличию на дне пробирки студнеобразного сгустка.[9, 62] Оценка гемолитической активности выполнялась путём посева испытуемых штаммов на 1,5%-ный МПА с добавлением 5% дефибринированной крови.

Результаты оценивали через 24-48 часов по наличию зоны гемолиза вокруг выросших колоний.[9, 62] Наличие лецитиназы устанавливали на желточно-солевой среде Г.Н. Чистовича. Оценку активности осуществляли по появлению радужного венчика вокруг зоны роста после 24 час инкубации в термостате.[9, 62] Пробу на уреазу ставили путём посева на бульон с мочевиной. Чистую культуру микроорганизмов засевали в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 3 мл и помещали в термостат, результат учитывали через 24 часа после инкубации при 37°C по изменению цвета индикатора. Одновременно, в отдельную пробирку, засевали контрольный штамм Escherichia coli 25922.[9, 62] Проведено исследование микрофлоры кишечника на дисбактериоз у 63 лиц группы риска АР и АтД. Идентификация микроорганизмов проводилась методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI ToF MS) с помощью анализатора микроорганизмов BioMerieux VITEK MS MALD1-ToF. Экстракция белков осуществлялась на одноразовом слайде с использованием готового матрикса для VITEK MS. Интерпретация результатов проводилась с использованием базы данных VITEK MS, состоящей из клинически значимых видов и расширенного классификатора спектров.

Изучение видового состава кишечной микрофлоры проведено с использованием дифференциально-диагностических питательных сред и критериев оценки степени дисбиотических нарушений кишечника в соответствии с ОСТ МЗ РФ «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (2003).

Материалом для идентификации лактобацилл являлась чистая культура лактобацилл, выделенная из кишечника человека при анализе на дисбактериоз (63 штамма лактобацилл). Идентификация лактобацилл проведена на базе научноисследовательской лаборатории «Клиническая и экспериментальная патология»

ГБОУ ВПО «СурГУ ХМАО – Югры». Для культивирования микроорганизмов применялись среды MRS (HiMedia, Индия) для лактобацилл, полужидкий (0,75%).

Лактобактерии первично идентифицировали по морфологии клеток и отсутствию каталазной активности. При видовой биохимической идентификации в качестве основы использовали MRS-бульон без добавления глюкозы. В приготовленную среду добавляли соответствующие растворы сахаров (до концентрации 1,0%) и индикатор бромкрезоловый пурпурный (0,016% спиртовой раствор).

Учёт положительных реакций проводили по изменению цвета среды от фиолетового до лимонно-жёлтого.[65, 73, 83] Видовую идентификацию лактобацилл проводили по культуральным и сахаролитическим свойствам, а именно сбраживание углеводов: глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, сахароза, рамноза, арабиноза, сорбит, трегалоза, салицин, раффиноза, фруктоза, целлобиоза.[67, 73, 83] Антагонистическую активность определяли с помощью метода отсроченного антагонизма в агаре.[42, 139] Определение антагонистической активности проводили по отношению к грамотрицательным и грамположительным условно-патогенным микроорганизмам E. coli и S. aureu, выделенным у лиц исследуемых групп.

На чашки с плотной питательной средой MRS-агар петлей в 2 мм наносили полоской культуру лактобацилл. Посевы инкубировали при 37° C в течение 72 ч.

Для выявления антагонистической активности микроорганизмов к выросшей культуре подсевали тест-культуры, предварительно выращенные в течение 18 ч.

Посев тест-штаммов производили петлей диаметром 1 мм в направлении от зоны роста штамма молочнокислых бактерий, не касаясь её, и перпендикулярно ей.[44, 104, 139] Учёт результатов проводили через 24-48 ч с инкубированием при t=37°C по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Контролем роста тест-культуры служил их параллельный посев на чашки с той же средой без испытуемой культуры. Зоны угнетения роста бактерий измеряли в мм.[104] Активность кислотообразования лактобацилл определяли титрометрическим методом.[73] Предварительно суточные культуры лактобацилл центрифугировали и по оптическому стандарту мутности готовили 1 млрд. взвеси в физиологическом растворе. По 1 мл такой взвеси вносили в пробирки с 9 мл среды MRS и культивировали при 37°C в анаэробных условиях. Через 12-24-36-48-60-72 ч от начала культивирования вынимали по 2 пробирки, из которых отбирали по 5 мл культуральной жидкости и титровали её 0,1 н NaOH. Количество щёлочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Из полученных значений вычисляли среднюю величину.[104]

Окончательный результат выражали в градусах Тернера:

T0=АК20, (1), где: T0 – величина, выражающая количество 0,1 н щёлочи, пошедший на титрование 100 мл исследуемого образца; А – количество 0,1 н щёлочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости; К – поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н раствора щёлочи 0,1 н янтарной кислотой.[104] Декарбосилирующую активность (субстрат гистидин) микроорганизмов исследовали количественным методом по методике с диазотированным n-нитроанилином.[67, 109] Диаминооксидазную активность лактобацилл определяли по разности содержания гистамина в жидкой питательной среде до и после инкубации в течение 24 час со стандартной навеской гистамина (44 мкг).[56, 68, 109] Видовую идентификацию бактерий рода Lactobacillus spp. проводили по сбраживанию 13 углеводов: глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, сахароза, рамноза, арабиноза, сорбит, трегалоза, салицин, раффиноза, фруктоза, целлобиоза (Sigma, Германия). Суточную культуру засевали на представленные сахара. Посевы инкубировали при 37°С, от 2-7 сут. Результаты учитывали по изменению окраски среды с помощью таблицы «Сбраживание углеводов видами рода Lactobacillus» согласно определителю Берджи.[42, 67] Биохимические методы Проведено определение антагонистической активности лактобацилл и слюны к Micrococcus luteus (штамм 2665) в единицах лизоцимной активности фотометрическим методом.[19] Готовили разведения живой суспензии Micrococcus luteus и лактобацилл на фосфатном буфере и стандартизировали их на фотоколориметре КФК-3-01 до оптической плотности (0,66). Смесь бактерий инкубировали в термостате 30 мин при 37°С с последующим определением оптической плотности и расчётом единиц лизоцимной активности по калибровочной кривой в мкг/мл.[56, 67] Определение лизоцимной активности лактобацилл и слюны проводили фотометрическим методом.[19] Готовили разведения живой суспензии Micrococcus luteus (штамм 2665) и лактобацилл на фосфатном буфере и стандартизировали их на фотоколориметре КФК-3-01 до оптической плотности (0,66). Смесь бактерий инкубировали в термостате 30 мин при 37°С с последующим определением оптической плотности и расчётом содержания лизоцима в мкг/мл.[56, 67] Определение концентрации гистамина в ротовой жидкости проводили количественным иммуноферментным методом (ИФА) с использованием тест-наборов фирмы «LDN» (Labor Diagnostika Nord, GmbH) в единицах измерения нг/мл.

При проведении коррекции дисбактериоза в группе риска рекомендовались лактосодержащие препараты «Лактобактерин» и кисломолочные смеси в качестве биологически активных добавок на основе заквасок лактобацилл в соответствии Патентами РФ на изобретение.[96, 97] Статистические методы Проведена оценка сходства сообществ микроорганизмов на различных этапах формирования дисбактериоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей и кишечника с использованием показателей коэффициента общности и процентного сходства. [23, 56, 67] Согласно методическому подходу коэффициент общности (КО) учитывает флористическое сходство по наличию или отсутствию видов в исследуемых сообществах и определяется по формуле:

KO=2 Sab/(Sa+Sb), (2.2), где: Sa – число видов в описании А; Sb – число видов в описании В; Sab – число видов в обоих описаниях.

Процентное сходство (ПС) выражает количественное участие видов в сообществе, согласно формуле:

ПС=Еmin(рА или рВ), (2.3), где: рА – выраженная в десятых долях значимость данного вида в описании А;

рВ – выраженная в десятых долях значимость того же вида в описании В.

При статистической обработке термины «частота» и «вероятность» использовались в соответствии со спецификой. Вероятность (р) вычислялась делением количества событий на число изученных случаев и выражалась в процентах согласно выражению[23, 30, 56]:

P=(P/n) 100%, (2.4) В случаях, когда изучаемое событие наблюдалось как 0 или 100%, оценка частоты вычислялась по формуле Ван-дер-Вардена [25, 56]:

P=(P+1)/(n+2), (2.5)

Для решения задач по реализации статистических возможностей в дифференциальной диагностике и прогнозировании использован метод последовательной диагностической процедуры, разработанный А. Вальдом.[30] Согласно методу, диагностический коэффициент градации i признака хi равен:

ДК=10 lgP (xi/A)/P(xi/B), (2.6) Показатель информативности признака и величину пороговой суммы диагностических коэффициентов определяли с использованием таблиц.[30] Определение средней ошибки выборки для доли проводили по формуле[30, 56]:

( p q ) / т, (2.7), m= где: p – соответствующая доля (в %); q=100-p.

Результаты проведённых исследований статистически обрабатывались с использованием программ MS Excel и «Statisticа 6.1» с применением параметрических и непараметрических методов. Тип распределения для выборки определяли по показателям коэффициентов вариации, симметрии, эксцесса. Для описания количественных данных, имеющих нормальное распределение, вычисляли среднее арифметическое (х), ошибку средней арифметической (m). Достоверность различия изучаемых параметров анализировали с применением критериев Стьюдента (РS) и метода 2 (Р 2). Рассчитывались коэффициент линейной корреляции (Пирсон-r) и коэффициент вариации (V), который характеризует относительную меру отклонения измеренных значений от среднеарифметического. В оценке коэффициента вариации учитывали критерии по которым показатель до 10,0% можно отнести к категории слабоизменчивым, при V от 10,0 до 20,0% – среднеизменчивым, при показателе V более 20,0% – сильноизменчивым.[30, 56] Индивидуальную оценку содержания лизоцима и гистамина в слюне проводили по методу определения сигмальных отклонений.[30, 56] Личное участие автора в получении результатов Автором составлен план исследования, аналитический обзора литературы, проведены исследования, статистическая обработка полученных данных. Бактериологические исследования микрофлоры на дисбактериоз кишечника и выделение лактобацилл в группе риска по аллергическим заболеваниям среди студентов проведены на базе бактериологической лаборатории БУ ХМАО – Югры «Сургутская окружная клиническая больница» совместно с заведующей лабораторией О.Е. Хоревой. Соискатель провёл систематизацию полученных данных, сформулировал выводы и практические рекомендации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показатели изменения эубиоза и потенциала патогенности микрофлоры верхних дыхательных путей ассоциируют со степенью нарушения соотношения лизоцима и гистамина в слюне.

2. Дисбактериоз кишечника в группах риска по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту у студенческой молодежи Севера характеризуется изменением видового разнообразия бактерий рода Lactobacillus и снижением их лизоцимной активности.

3. Отбор пробиотических штаммов лактобацилл с учётом их диаминооксидазной, лизоцимной и антагонистической активности к микроорганизмам с наибольшим потенциалом патогенности, выделяемых в регионе, является эффективным для коррекции нарушений микрофлоры и нормализации соотношения содержания лизоцима и гистамина в слюне у лиц групп риска по круглогодичному аллергическому риниту и атопическому дерматиту.

Степень достоверности и апробация результатов исследования Достоверность полученных результатов основана на достаточном объёме материала и современных методах сбора и обработки информации (анализ 384 разработанных карт; бактериологическое исследование микрофлоры слизистой оболочки носа и зева, определение лизоцима и гистамина в слюне, n=192 чел; оценка степени дисбактериоза, выделение и идентификация лактобактерий в группе риска, n=63 чел). В работе использовано сертифицированное и поверенное оборудование.

Положения диссертационной работы научно обоснованы данными литературы, результаты подтверждены статистически и документированы таблицами и рисунками. Предложены рекомендации для дальнейшего использования пробиотических штаммов потенциально способных снижать риск аллергических заболеваний.

Диссертационная работа апробирована на расширенного заседания научного проблемного совета №1 по специальностям медико-биологического и профилактического профиля Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сургутский государственный университет ХМАО – Югры» (протокол №4 от 25.12.2013 г.).

Материалы исследования доложены на: Окружной конференции молодых учёных «Наука и инновации Ханты-Мансийского автономного округа» (Сургут, 2004; 2006; 2008); VI, VIII, ХII Всероссийской научно-практической конференций с международным участием «Совершенствование системы физического воспитания, спортивной тренировки и оздоровления различных категорий населения» (Сургут, 2007; 2009; 2013); Открытой научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием (Волгоград, 2009; 2010;

2012); Научно-практической конференции, посвящённой 10-летию кафедры экологии СурГУ (Сургут, 2009); Научно-практической конференции, посвящённой 15-летию медицинского образования в ГБОУ ВПО «Сургутский государственный университет ХМАО – Югры» (Сургут, 2010); II международной студенческой научной конференции с участием молодых учёных РУДН. (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции, посвящённой 15-летию биологического факультета СурГУ (Сургут, 2011).

Публикации По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 6 работ в рецензируемых изданиях, в патенте РФ на изобретение, в монографиях – 2, в других изданиях – 17.

Структура и объём диссертации Диссертационная работа состоит из введения, включающего характеристику объёма, материала и методов исследования, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения и указателя литературы, включающего 243 источника, в том числе 147 отечественных и 96 зарубежных.

Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами и 5 рисунками.

<

–  –  –

В связи со значительными техногенными изменениями среды обитания человека возникла проблема экологической патологии как следствие воздействия физических, химических, биологических факторов. [1, 7, 163] В соответствии с Законом ХМАО «Об охране окружающей природной среды и экологической защите населения автономного округа» разработка объективных методов индикации экопатологии и выработки подходов к профилактике данных расстройств у жителей Севера становится особенно актуальна.[67, 136] В Сургуте формируются поколение населения, проживающие в условиях климатогеографической экстремальности и антрапогенных факторов промышленных городов на Севере. Основными источниками загрязнения окружающей среды в городах ХМАО – Югры являются промышленные и энергетические предприятия, транспорт.[51, 68] Климато-географические и экологические нагрузки наиболее выражено прослеживаются в изменении состояние здоровья детей и подростков. Высокая чувствительность организма, находящегося в процессе развития, не только определяет состояние здоровья в настоящий момент, но и оказывает влияние на их дальнейшее развитие.[10, 118, 222] Особенно актуальна эта проблема для здоровья в юношеском возрасте, в период онтогенетического развития между подростковым возрастом и взрослостью. В этом возрасте завершается физическое, в том числе половое, созревание организма. В психологическом плане главной особенностью данного возраста является вступление в самостоятельную жизнь, когда происходит выбор профессии, резко меняется социальная позиция. Эта группа населения относится к числу наименее социально защищённых, между тем как специфика возраста и учебного труда требует должных социально-экономических условий. [10, 134] Ослабленное чаще всего ещё до поступления в высшее учебное заведение состояние организма и психики, экологические проблемы, нерациональное питание, гиподинамия, невысокий в целом уровень валеологической культуры обусловливает то, что более половины студентов нездоровы, у многих – пограничные состояния различного порядка.[88, 134] Кроме гуманитарного аспекта, выражающегося в самоценности здоровья, проблема имеет и чётко выраженную социально-экономическую сторону, поскольку здоровье – одно из обязательных условий полноценного выполнения человеком своих социальных, в т. ч. профессиональных, функций. Забота о здоровье студентов есть важнейшая задача в деле подготовки специалистов. Как заинтересованная сторона, учебные заведения должны выступать инициатором и организатором целенаправленной и эффективной работы по сохранению, реабилитации и приумножению здоровья студенческого контингента.[57, 134, 147] Большинство исследователей рассматривают экологическую нагрузку как фактор, непосредственно влияющий на общую резистентность организма. В результате этого создаются условия для проявления агрессивности инфекционных агентов.[9, 48, 112, 113] Состояние факторов врождённого иммунитета является одним из ранних и чувствительных показателей вредного воздействия на организм факторов окружающей среды и может служить критерием риска развития заболеваний органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и других органов и систем. Особо следует выделить патологические состояния, проявления которых выражается расстройством иммунной системы, что ведёт к возникновению аллергической патологии, снижению устойчивости к инфекциям.[17, 135, 152, 159, 240] В работе Сенцовой Т.Б. с соавт.[117] показано значение мукозального иммунитета и микрофлоры кишечника в патогенезе атопического дерматита у детей, а в работе Грачёвой Н.М.[27] представлено состояние микробной экологии и слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями.

Другой важной проблемой изучения возможностей биологической индикации является возрастание антропогенного воздействия на окружающую среду, что неизбежно накладывает отпечаток на экологию самых различных биологических объектов, начиная с высших растений и животных и заканчивая представителями микромира. При этом микроорганизмы в силу относительной простоты своей организации и высокой степени интегрированности в процессы кругооборота веществ и энергии первыми реагируют на изменение качества среды обитания. В этих условиях разнообразные химические, физические и иные влияния становятся одними из ведущих антропогенно детерминированных факторов их «искусственной эволюции» в загрязнённых экосистемах[34] и воздействия вредных привычек.[88, 156, 218] Так приведены особенности дисбактериоза кишечника у жителей районов крупного промышленного города с различным уровнем техногенной нагрузки на примере жителей города Волгограда[106] и особенности микробиоценоза толстой кишки при дисбиотических нарушениях у жителей города Оренбурга.

[20] В работе Кафарской Л.И. проведён глубокий анализ значения локального иммунитета кишечника.[53] Накопленные к настоящему времени материалы позволяют иначе оценить существовавшие ранее представления об ингибирующем воздействии факторов внешней среды на жизнеспособность и патогенность микроорганизмов, как, например, микробные ингибиторы лизоцима.[18, 157] Установлено увеличение сроков переживания ряда патогенных и условнопатогенных бактерий в объектах внешней среды в присутствии нефтепродуктов, пестицидов, гербицидов, хлорсодержащих дезинфектантов.[37] На фоне экологических последствий загрязнения окружающей среды нельзя недооценивать потенциал генетических изменений, вызванных воздействием малых и средних доз загрязнителей. Это сопровождается, не только сохранением, но даже усилением некоторых свойств микроорганизмов, значимых для инициации и развития инфекционного процесса, возможности образовывать биоплёнки.[71, 170] Проведение мониторинга региональных особенностей биологических и молекулярно-генетических характеристик микрофлоры может расцениваться как одно из проявлений изменчивости возбудителей инфекционных заболеваний в антропогенно изменённой экосистеме или при особых климатогеографических условиях.[14, 29, 162, 174] В настоящее время большое количество работ посвящено подтверждению гипотезы К. Janeway об исключительной важности системы врождённого иммунитета в защите от патогенов и в реализации начальных стадий реакций адаптивного иммунитета.[24, 72] Иммунокомпетентные клетки распознают консервативные в эволюционном отношении молекулы, присущие одновременно большим систематическим группам микроорганизмов. Среди распознающих рецепторов системы врождённого иммунитета ключевая роль принадлежит То11-подобным рецепторам (TLR). После взаимодействия TLR с лигандом происходит активация сигнальных путей, в результате которой продуцируются эффекторные молекулы, такие, как цитокины, противомикробные пептиды и др. При скоординированном функционировании факторов врождённого иммунитета в большинстве случаев происходит элиминация патогена. Гиперактивация или угнетение механизмов врождённого иммунитета в свою очередь может вести к развитию патологического процесса.[66] Исследования по оценке патологических состояний с точки зрения функционирования молекулярных механизмов врождённого иммунитета фактически начались совсем недавно.[58, 72] Развитие большинства инфекций, с которыми встречается организм, начинается с проникновения патогенов через барьерные ткани, в том числе через слизистые оболочки. Слизистые оболочки, являясь физиологическим барьером, участвуют в развитии защитных реакций врождённого иммунитета в ответ на патогены, в инициации реакций адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов (аллергии, острого и хронического воспаления и др.). Клетки (в том числе эпителиальные) слизистых оболочек рассматриваются в качестве одного из факторов врождённого иммунитета.[24, 72] Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является её участие в механизмах колонизационной резистентности, придающих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения биотопов организма хозяина аллохтонными микроорганизмами.[25, 181] С колонизации микроорганизмов начинаются первые этапы инфекционного процесса и формирования бактерионосительства.[56, 165, 190] Термин «колонизация» не вызывает в научной литературе особых дискуссий. Под этим термином понимают захват микроорганизмами участка среды обитания с последующим размножением, что и обеспечивает существование данного вида. Примером тому, служит показатель, свидетельствующий, что до 80% инфекций человека начинается с колонизации открытых участков организма – кожи и слизистых оболочек полостей, контактирующих с внешней средой.[19, 197] С общебиологической точки зрения колонизация – форма существования любых микроорганизмов, как сапрофитов, так и патогенов, как свободно живущих, так и имеющих определённых хозяев.[19] Основными составными частями интегрального понятия колонизационной резистентности являются экстракорпоральные (различные варианты взаимоотношений «микроб–микроб») и корпоральные механизмы (взаимоотношения «микроб–организм–микроб»), включающие гуморальные и клеточные факторы врождённого и адаптивного иммунитета, имеющие как местные, так и общие проявления.[19, 59, 66] В работе Лебедева К.А. и Понякиной И.Д.[72] подчеркивается, что макрофаги экспрессируют на плазматической мембране широкий спектр рецепторов, которые опосредуют их взаимодействие с повреждёнными собственными компонентами организма и экзогенными агентами, включая различные микроорганизмы. Распознавание влечёт за собой изменения экспрессии поверхностных молекул, усиление фагоцитарной активности, продукции и секреции цитокинов, функции презентации, сигналинга, экспрессии генов. Это отражается на поддержании гомеостаза, на эффективности защиты организма, включая механизмы врождённого и приобретённого иммунитета.

Во взаимодействии микрофлоры и регуляции микробного биоценоза в экологической нише чётко реализуется явление микробного антагонизма. С одной стороны, оно заключается в продукции транзитными штаммами и штаммами резидентной микрофлоры антагонистически активных веществ (антибиотиков, бактериоцинов, образовании лизоцима). С другой стороны, наличием резистентности к этим же факторам микробного антагонизма.[37, 203] В организме человека сложными являются микробные сообщества верхних дыхательных путей. Они характеризуются динамичностью, когда один микробиоценоз сменяется другим. Для каждой области носоглотки (нос, носо- и ротоглотка) характерна своя микрофлора. В работах О.В. Бухарина[19] и Д.Г. Дерябина[34] подчеркивается, что наиболее существенно различаются микробиоценозы носа и зева.

Симбиотическая микрофлора носоглотки и её роль в обеспечении колонизационной резистентности организма к возбудителям инфекции представлена в ряде работ[77, 212, 233]. Особенности формирования бактерионосительства стафилококковой микрофлоры у детей в условиях Севера представлено в работе Клюевой Л.А. с соавт.[55] Микрофлора переднего отдела носа – важное звено колонизационной резистентности верхних дыхательных путей человека. Слизистая оболочка переднего отдела носа и паразитирующая здесь микрофлора служат первым барьером на пути распространения патогена в органы дыхательной системы, придаточные пазухи носа, среднее ухо, другие биотопы.[19, 62, 108] При развитии дисбиоза слизистой оболочки носа формируется стафилококковое бактерионосительство, условно-патогенные виды микроорганизмов вызывают развитие гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации, в том числе и генерализованные формы инфекции.[19, 20, 108] Изучение закономерностей формирования микробного биоценоза на слизистой оболочке переднего отдела носа представляется важным как в теоретическом, так и в прикладном аспекте: диагностика дисбиоза, лечение и профилактика заболеваний путём коррекции микрофлоры носа.[21, 67] При исследовании обсеменённости верхних дыхательных путей у больных Московской области со слизистой оболочки носа из выделенных 6608 культур и идентифицированы микроорганизмы 28 родов и 51 вида[80]. Наиболее часто отмечены S. epidermidis, значительно реже S. aureus, эпизодически S. haemolyticus, E. coli, грибы Candida albicans, S. pyogenes, Streptococcus группы viridans, Enterobacter cloaceae, Corynebacterium pseudodiphthericum. Доля грамположительных кокков составляла 79,7% от всего количества изолятов с выраженным преобладанием стафилококков (71,8%). Авторы заключают, что в колонизации слизистой оболочки передних отделов полости носа преобладают представители грамположительных кокков - S. epidermidis и S. aureus.[80] В этих же исследованиях со слизистой оболочки зева выделены 17402 культуры, отнесённые к 28 родам и 63 видам. С наибольшей частотой отмечено выделение S. epidermidis, S. aureus, Streptococcus группы viridans, S. pyogenes, C. albicans, E. coli, Neisseria sicca, Neisseria mucosa, S. pneumoniae, E. cloacae, K. pneumoniae, S. saprophyticus. Доля грамположительных кокков составила 67% от общего количества выделенных культур, из них на стафилококки – 30%, стрептококки – 29,4%.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.