WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Федеральный центр охраны здоровья животных»

На правах рукописи

Доронин Максим Игоревич

ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО

НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

03.02.02 «Вирусология»

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук



Научный руководитель:

доктор биологических наук,

Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика возбудителя инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых

2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по ИНГТ лососевых в России и в мире

2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при ИНГТ

2.4 Лабораторная диагностика ИНГТ

2.4.1 Выделение вируса в культуре клеток

2.4.2 Реакция иммунофлуоресценции

2.4.3 Иммуноферментный анализ

2.4.4 Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

2.5 Реакция агглютинации латекса как метод диагностики вирусных болезней... 28

2.6 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы и методы

3.2 Результаты собственных исследований

3.2.1 Поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ

3.2.2 Получение и характеристика моноклональных антител к антигенам вируса ИНГТ

3.2.3 Разработка реакции агглютинации латекса для выявления вируса ИНГТ..... 65

–  –  –

3.3 Обсуждение результатов

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7 СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

8 ПРИЛОЖЕНИЯ

1 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) – высококонтагиозное вирусное заболевание лососевых рыб, которое встречается как в пресноводной, так и в морской аквакультуре. Болезнь протекает по типу эпизоотии, характеризуется развитием септического процесса с тяжелым поражением органов гемопоэза и приводит к массовой гибели рыбы (смертность молоди приближается к 100%) [40, 49]. Распространение вируса наносит значительный экономический ущерб, который складывается из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всей рыбы на территории очага болезни и ограничений в торговле [49, 125]. В связи с большим количеством рыбопосадочного материала, поставляемого из стран, неблагополучных по вирусным болезням рыб (США, Канада, страны Скандинавского п-ва и Ю-В Азии), возрастает актуальность проведения экспрессных диагностических исследований в рамках мониторинга по вирусным заболеваниям аквакультуры, в частности по ИНГТ [125].

принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству Возбудитель Rhabdoviridae, роду Novirhabdovirus. Геном представлен несегментированной одноцепочечной негативной РНК длиной около 11000 нуклеотидов и кодирует N-, P-, M-, G-, NV- и L-белки [88, 125, 157].

Впервые заболевание было зарегистрировано в 1953 г. на рыбозаводах США, а затем в Канаде и на Аляске. В семидесятые годы болезнь появилась в Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Японии. В Российской Федерации вспышки ИНГТ регистрируют с 2000 г. [40, 49, 125]. По данным Всемирной Организации здоравоохранения животных (OIE), в течение последних 15 лет в различных странах мира было зарегистрировано около 100 вспышек ИНГТ [4, 125, 143]. Данная инфекция входит в список заболеваний, обязательно декларируемых в OIE [125]. В настоящее время Приказом Минсельхоза РФ № 476 от 19.12.2011 г. ИНГТ отнесен к перечню заразных и особо опасных болезней, по которым устанавливается карантин, что предусматривает проведение масштабного эпизоотологического мониторинга данного заболевания [39].

По руководству OIE, лабораторная диагностика ИНГТ предусматривает выделение вируса в чувствительных клеточных линиях, серологическую идентификацию вируса с помощью ИФА и РИФ, а также выявление РНК вируса ИНГТ в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ [125]. Применение этих методов предполагает высокие требования к лабораторному персоналу, закупку зарубежных коммерческих наборов и оборудования, что существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественное рыбоводство зависимым от импортных поставок.





В связи с этим разработка экспресс-методов для дополнения существующей схемы диагностики ИНГТ на основе высокочувствительных и специфичных тест-систем, позволяющих упрощать проведение анализа, является актуальной задачей. К одним из таких методов относится реакция агглютинации латекса (РАЛ), используемая в медицине и ветеринарной практике для диагностики инфекционных заболеваний. Метод является бесприборным, экспрессным и простым в исполнении, достаточно чувствительным и специфичным. Стоимость исследования значительно ниже по сравнению с другими диагностическими тестами. Учитывая эти преимущества перед другими методами, РАЛ может найти свое применение в диагностических лабораториях рыбохозяйств.

Использование формата реакции ОТ-ПЦР-РВ для одновременного выявления в патологическом материале нескольких возбудителей с применением ПЦР-чипов позволит создать диагностическую тест-систему нового поколения с высокой аналитической и диагностической чувствительностью и специфичностью. За счет снижения количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа по сравнению с классическим вариантом ОТ-ПЦР, совмещения в микрореакторе чипа обратной транскрипции и ПЦР и оптимизации режима термоциклирования сократится время проведения анализа.

Таким образом, применение РАЛ и метода ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов для проведения скрининговых исследований на ИНГТ даст возможность выявлять возбудителя на ранних стадиях заболевания.

Следовательно, разработка экспресс-методов выявления вируса ИНГТ лососевых рыб для дополнения существующей схемы диагностики является актуальной.

Степень разработанности темы. Для изучения структуры и свойств возбудителя ИНГТ были исследованы различные изоляты вируса, выделенные на территории Северной Америки, Европы и Азии. На основе анализа отличий генов N и G были определены 5 генетических групп вируса ИНГТ [90].

Применяя моноклональные антитела к гликопротеину и нуклеопротеину вируса ИНГТ была проведена серологическая дифференциация его штаммов [89, 140].

Изучена цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и изучена их чувствительность к некоторым вирусам лососевых [16, 50]. Изоляты вируса ИНГТ были адаптированы к различным клеточным линиям рыб (ЕРС, RTG-2, ВF-2 и др.) [7, 16, 50, 125].

Были разработаны разные варианты ОТ-ПЦР для выявления вируса ИНГТ.

Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вируса ИНГТ [57, 128, 136]. Разработаны системы мультиплекс-ПЦР [153, 159] и мультиплекс-ПЦР-РВ с целью выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ИНПЖ [65, 110]. ОТ-ПЦР-РВ возможно проводить не только в пробирке, но и в микрореакторах чипа, на гидрофильном дне которых адсорбирована смесь компонентов для одновременного проведения обратной транскрипции и ПЦР, что позволяет при оптимизации режима термоциклирования сокращать время проведения анализа. В нашей стране в таком формате разработаны коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять возбудителей некоторых вирусных и бактериальных болезней птиц и КРС [164]. Сведения о разработке метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ отсутствуют.

Экспресс-метод для выявления антигенов вирусов, бактерий и других патогенных микроорганизмов, который основан на агглютинации сферических частиц латекса, сенсибилизированных специфичными антителами, находит применение как в медицинской, так и ветеринарной практике. Широкий спектр тестов латексной агглютинации для нужд ветеринарии производят предприятия «Microgen Bioproducts» (Великобритания), «БиоВитрум» (РФ) и др. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир) были синтезированы латексные препараты для диагностики различных вирусных болезней животных, в частности бешенства, микоплазмозов птиц и др. [8, 31]. Сведения о разработке РАЛ для выявления вируса ИНГТ отсутствуют.

Цели и задачи исследований. Основная цель данных исследований заключалась в разработке экспресс-методов, позволяющих выявлять вирус ИНГТ в патологическом материале рыб. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

а) подобрать оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ;

б) получить поликлональные и моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ и дать им характеристику;

в) оптимизировать параметры получения латексных диагностикумов и разработать экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных антител;

г) разработать экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ;

д) провести апробацию разработанных методов при диагностических исследованиях полевого материала в рамках мониторинга из ряда регионов РФ в 2014-2015 гг.

Научная новизна результатов исследований. Подобраны оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ. Предложена методика по вирусвыделению из патологического материала рыб одновременно в нескольких чувствительных культурах клеток с определением титра накопления вируса. Определены оптимальные параметры получения латексных препаратов и впервые разработан экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных антител. Впервые разработан экспрессметод ОТ-ПЦР-РВ в формате диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, вирусной геморрагической септицемии (ВГС) и весенней виремии карпа (ВВК) в пробах патологического материала рыб. Проведена апробация разработанных методов РАЛ и ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов при диагностических исследованиях полевого материала на вирусные заболевания рыб в рамках мониторинга в ряде регионов РФ в 2014-2015 гг.

Изучены Теоретическая и практическая значимость работы.

культуральные свойства штамма «Аркус 32/87» и изолята «Воронин 14/08»

вируса ИНГТ. Определена оптимальная инфицирующая доза вируса ИНГТ и выбрана наиболее подходящая клеточная линия для его культивирования.

Оценена эффективность культивирования вируса в клеточной линии гонад радужной форели (RTG-2) в зависимости от его пассажного уровня и концентрации фетальной сыворотки КРС в поддерживающей среде.

Культуральный антиген вируса ИНГТ с высоким титром накопления получали на основе штамма «Аркус 32/87», который использовали для получения вирусспецифичных сывороток и моноклональных антител.

Получены 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ. Проведена оценка чувствительности и специфичности связывания полученных антител с белками вируса ИНГТ в ИФА и вестерн-блотанализе. Для разработки диагностических тест-систем использовали моноклональные антитела, специфичные к G- и N-белкам вируса ИНГТ, с активностью в двойном сэндвич-варианте ИФА 1:192000 и 1:384000, соответственно.

Определены оптимальные условия синтеза и хранения латексных диагностикумов с разными функциональными группами в процессе физической и химической адсорбции антител, специфичных к вирусу ИНГТ. Разработан экспресс-метод РАЛ (реакция агглютинация латекса) для выявления вируса ИНГТ с использованием полученных моноклональных и поликлональных антител. Оценены диагностические характеристики полученных латексных препаратов.

Разработан экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов рыб. Предложены оригинальные системы праймеров и зонды, а также оптимизированы режимы термоциклирования для каждой тест-системы. Разработаны тест-системы с высокими показателями эффективности амплификации, аналитической и диагностической чувствительности и специфичности.

Разработаны «Методические рекомендации по вирусвыделению из патологического материала рыб на культуре клеток» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 20 декабря 2013 г.

), «Методические рекомендации по выявлению вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых в реакции агглютинации латекса» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 17 июня 2015 г.), «Методические рекомендации по выявлению вирусов рыб в обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением диагностических ПЦР-чипов» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 09 октября 2015 г.).

Проведено депонирование использованных в работе штамма вируса ВГС «Аланд» и штамма вируса ВВК «Яяла» в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (справка о депонировании штамма вируса геморрагической септицемии (ВГС) лососевых рыб «Аланд» (диагностический) № 41/15 – 3 от 08.04.2015 г.; справка о депонировании штамма вируса весенней виремии карпа (ВВК) «Яяла»

(диагностический) № 45/15 – 9 от 05.08.2015 г.).

Разработанные методы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Методология и методы исследования. Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей), вирусологические (вирусвыделение, культивирование вируса) и серологические (ИФА, РИФ, РАЛ) методы исследований.

Положения, выносимые на защиту:

а) метод вирусвыделения из патологического материала рыб одновременно в клеточных линиях RTG-2, EPC, FHM с определением титра накопления вируса;

оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ;

б) получение 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ, и их характеристика для разработки диагностических тест-систем;

в) тест-системы на основе реакции агглютинации латекса для выявления вируса ИНГТ лососевых с применением поликлональных и моноклональных антител;

г) экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов рыб;

д) результаты апробации разработанных методов при диагностических исследованиях полевого материала из ряда регионов РФ в 2014-2015 гг.

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУН Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва), ООО «Люмэкс-Маркетинг»

(г. С.-Петербург): к.б.н. Ф.А. Бровко, к.б.н. М.М. Никитину и ФГБУ «ВНИИЗЖ»:

сотрудникам реф. лаб. болезней аквакультуры, к.б.н., ст.н.с. Гос НИИОРХ А.В.

Лысанову за помощь в проведении отдельных этапов работы; д.б.н., г.н.с. Н.С. Мудрак, к.б.н. Д.Б. Андрейчуку, к.б.н. Назарову Н.А. за консультативную помощь; д.б.н., проф. С.С. Рыбакову за содействие в выполнении работы. Автор выражает признательность в.н.с. реф. лаб. болезней аквакультуры, к.в.н. Д.К. Павлову.

Материалы Степень достоверности и апробация результатов.

диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ», на 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2014 г.), 10-ой Молодежной международной научно-практической конференции: «Наука XXI века: новый подход» (г. Санкт-Петербург, 2014 г.), Международной научнопрактической конференции «Инновационный вектор развития в условиях риска и неопределенности: новые задачи и пути их решения в экономике, экологии, зоологии, химии, биологии и др.» (г. Санкт-Петербург, 2015 г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития современной науки: социально-экономические, естественно-научные исследования и технический прогресс» (г. Ростов-на-Дону, 2015 г.), VIII Всероссийской научно-практической конференции "Тенденции развития естественных и гуманитарных наук" (г. Ростов-на-Дону, 2015 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения; иллюстрирована 30 таблицами и 13 рисунками.

Список использованной литературы включает 164 источника, из них 112 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика возбудителя инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб В соответствии с классификацией Международного Таксономия.

Комитета по таксономии вирусов, возбудитель ИНГТ лососевых рыб (сем.

Salmonidae) принадлежит к роду Novirhabdovirus в семействе Rhabdoviridae порядка Mononegavirales [88, 125, 157].

Дифференциация геногрупп и серогрупп вируса ИНГТ. В настоящее время выделяют 5 геногрупп. Оценку отличий генов N и G большинства выделяемых штаммов вируса из Северной Америки, Европы и Азии проводили ряд авторов Emmenegger et al. (2000), Troyer, Kurath (2003), Enzmann et al. (2005), Kim et al. (2007), Kolodziejek et al. (2008), Johansson et al. (2009). Исходя из найденных различий, была создана схема классификации, которая позволила отнести большинство изолятов к 1-3 геногруппам вируса ИНГТ [120, 137].

Большинство изолятов западной части Северной Америки, являющейся исторически естественным ареалом вируса ИНГТ, произошли от формы тихоокеанских лососей и образуют 2 генетические группы, связанные географическим положением. Штаммы вируса ИНГТ геногруппы 1 (U), выделенные от нерки, преобладают в Северо-Тихоокеанском регионе, штаммы группы 2 (L), обнаруженные у чавычи – в Вашингтоне, Орегоне и Айдахо [76, 90, 104]. Изоляты этих групп характеризуется относительно низким уровнем разнообразия нуклеотидных последовательностей. Штаммы, выделенные от радужной форели в Южном Орегоне, Калифорнии и Айдахо, формируют третью геногруппу (M) с большим генетическим разнообразием, что свидетельствует о постоянной адаптации вируса к новому хозяину или новым условиям воспроизводства [53, 63, 67, 77, 78, 79, 105, 117, 155]. Отмечают, что при экспериментальном заражении вирусом ИНГТ группы U наблюдается более высокая смертность рыбы по сравнению с группой М, поскольку изоляты U группы высоковирулентны [101, 134]. Оценивая нуклеотидный состав G гена различных изолятов, выявили, что наиболее высокое разнообразие (8,3%) отмечается для геногруппы М [95]. Также были определены геногруппы E и I изолятов вируса ИНГТ, выделенные от радужной форели в Европе и Азии, соответственно. Nishizawa et al. (2006), Kim et al. (2007), Enzmann et al. (2010) отмечают, что эти группы, по всей видимости, произошли от североамериканских и включают изоляты, которые больше не обнаруживают или те, которые не демонстрируют отличительных характеристик [77, 89, 90, 142]. В 2008 г. на территории Австрии выявлены изоляты вируса ИНГТ, которые произошли от геногруппы М и образовали подгруппы M-Eur-1 и M-Eur-2, заметно отличающиеся по нуклеотидному составу от североамериканских и азиатских изолятов [100]. Анализируя 9 изолятов вируса ИНГТ, выделенных от радужной форели на территории Японии, выявили геногруппу IRt с разнообразием нуклеотидной последовательности 4,5%, в то время для североамериканских изолятов характерны генетические отличия в 3,6%.

Nishizawa T., et al. пришли к выводу, что японские изоляты вируса ИНГТ имеют наибольшее родство с геногруппами U, M, L [123]. Изоляты, выявленные на территории Кореи, тесно связаны с группой IRt, поскольку предположительно занесены с территории Японии [96].

Загрузка...

Engelking et al. (1991), Nicholos et al. (1995) et al., применяя моноклональные антитела к N-белку и G-белку вируса ИНГТ, проводили оценку принадлежности изолятов из Калифорнии, Орегона, Вашингтона и Айдахо к различным серогруппам и пришли к выводу, что наиболее консервативным белком вируса ИНГТ является нуклеопротеин. Ristow, Arnzen et al. (1991), используя мышиные моноклональные антитела к гликопротеину и нуклеопротеину вируса ИНГТ, обнаружили ряд различий по G-белку и отнесли исследуемые изоляты к разным серогруппам. В настоящее время моноклональные антитела против гликопротеина вируса ИНГТ позволяют проводить более точную серологическую дифференциацию его штаммов [75, 89, 100, 120, 140].

Морфология вириона. Вирионы имеют пулеобразную цилиндрическую форму, округлую на одном конце и плоскую на другом, с длиной 180 нм, диаметром 75 нм [84, 125, 132, 153]. Геном вируса ИНГТ представлен несегментированной одноцепочечной негативной спиральной РНК длиной приблизительно 11000 нуклеотидов [125]. РНК вируса ИНГТ кодирует шесть белков: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (P-белок), матриксный протеин (M-белок), гликопротеин (G-белок), невирионный протеин (NV-белок) и РНКзависимую РНК-полимеразу (L-белок) (рис. 1) [56, 120].

Рисунок 1 – Схематичное изображение генома вируса ИНГТ

Вирусная РНК вместе с нуклеопротеином составляет рибонуклеопротеин (РНП). РНП, связанный с L- и P-белком, образуют активный РНК-комплекс, который контролирует транскипцию и репликацию вируса. G- и M-белок формируют внешнюю оболочку вириона, на наружной поверхности которого располагаются выступы в виде шипов длиной 10 нм, прикрепляющиеся к билипидному слою. Сходство нуклеотидных последовательностей NV-гена некоторых рабдовирусов рыб позволило их объединить в род Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae с вирусом ИНГТ в качестве типового вида [104, 109, 125, 154]. Строение вириона вируса ИНГТ схематично представлено на рисунке 2.

–  –  –

Структура и функции вирусных белков. Нуклеопротеин. N-белок – фосфорилированный полипептид, состоящий из 456 аминокислот, с молекулярным весом 42 кДа. N-белок вместе с РНК образует РНП.

Нуклеопротеин является основным внутренним белком вируса ИНГТ и выполняет важнейшие функции: защищает вирионную РНК от действия рибонуклеаз, регулирует процессы репликации и транскрипции.

Аминокислотная последовательность N-белка является наиболее консервативной, поэтому антитела к РНП используют в диагностических исследованиях [56, 125].

Фосфопротеин. Р-белок – фосфорилированный полипетид, состоящий из 256 аминокислот, с молеклярным весом 26 кДа. Фосфопротеин играет ключевую роль в качестве некаталитического кофактора в транскрипции и репликации вирусного генома. Фосфопротеин является регуляторным белком, связывающим L-белок в комплекс с вирусным геномом. P-белок взаимодействует с нуклеопротеином и L-белком через области, которые являются специфическими для каждого из них [56, 113].

Гликопротеин. G-белок – один из наиболее изученных белков, как на структурном, так и на иммунологическом уровнях. Гликопротеин состоит из 540 аминокислот и имеет молекулярный вес 57 кДа. G-белок имеет четыре области:

сигнальный пептид, эктодомен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Молекула гликопротеина имеет 2 олигосахаридные цепи, которые соединяются с внешней гидрофильной частью белка. Гидрофобной негликолизированной частью G-белок погружен в билипидный слой.

Гликопротеин состоит из тримеров, которые образуют около 400 треугольных выступов на поверхности вириона. G-белок вируса ИНГТ выполняет важные функций: трансмембранный домен осуществляет внутриклеточный транспорт гликопротеина; эндодомен взаимодействует с М-белком; G-белок является главным поверхностным белком вируса ИНГТ, ответственным за выработку вируснейтрализующих антител [68, 87, 132].

Матриксный белок. М-белок вируса ИНГТ - нефосфорилированный протеин, содержит 248 аминокислоты и имеет наименьший из всех белков вириона молекулярный вес - 22 кДа [56]. Главная функция матриксного протеина заключается во взаимодействии его димеров с цитоплазматическим доменом G-белка и РНП во время сборки вириона вируса ИНГТ [115].

РНК-зависимая РНК-полимераза. L-белок имеет высокий молекулярный вес (225 кДа) и состоит из 2030 аминокислот. Является каталитическим компонентом полимеразного комплекса, который, наряду с фосфопротеином, отвечает за большинство ферментативных реакций, участвующих в репликации и транскрипции вирусной РНК. L-белок играет уникальную роль вначале инфекционного процесса, инициируя первичную транскрипцию геномной РНК после проникновения РНП в цитоплазму инфицированной клетки [113, 125].

Жизненный цикл вируса. Жизненный цикл начинается с адсорбции вируса на поверхности клетки-мишени, за счет связывания G-белка со специфическим рецептором на поверхности клетки. После происходит слияние оболочки вируса и клеточной мембраны [3]. Затем начинается пенетрация, которая осуществляется с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза в процессе образования крупных цитоплазматических везикул, окружающих вирионы. Происходит слияние оболочки вируса и мембраны везикул, а так же наблюдается диссоциация М-белка и РНП (раздевание). Слияние катализируется G-белком и понижением рН внутри эндосом, что приводит к высвобождению РНП комплекса в цитоплазму клетки-хозяина [125, 132]. После проникновения негативной РНК вируса ИНГТ в цитоплазму клетки L-белок осуществляет транскрипцию геномной РНК, образуя лидерную позитивную РНК и полиаденилированные мРНК, которые в процессе трансляции на рибосомах формируют вирусные белки. Позитивная РНК является матрицей для формирования негативной РНК вируса ИНГТ. Процессы созревания белков вируса ИНГТ (фосфорилирование, гликозилирование и т.д.) происходят в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулюме (ЭПР). N-, P- и L-белки формируют единый комплекс, который инкапсилирует негативную спиральную геномную РНК и тем самым образует центральную часть РНП. М-белок формирует капсулу для РНП, в результате этого собирается комплекс М-РНП, подвергающийся гликозилированию. Процесс самосборки вириона осуществляется без участия ферментов и АТФ [59].

Устойчивость вируса. Вирус ИНГТ чувствителен к воздействию высоких температур. При 45°С за 15 минут он инактивируется более чем на 99%, моментально разрушается при 60°С. Низкие температуры консервируют вирус, и в течение всей зимы он сохраняется в водоемах. Ультрафиолетовые лучи убивают вирус за 5-10 минут, солнечный свет обезвреживает его через 5-7 дней.

Вирус устойчив к многократному замораживанию и оттаиванию, хорошо сохраняется в лиофилизированном состоянии. Вирус ИНГТ чувствителен к эфиру и изменению рН. В среде с сильнокислой и сильнощелочной реакциями его вирулентные свойства резко снижаются и затем полностью исчезают. В качестве дезинфицирующих средств для инактивации вируса ИНГТ используют 1-5% раствор формальдегида, 3-5% раствор соляной кислоты, 4% раствор гидроксида натрия, 45-70% раствор этилового спирта [5, 41].

Культивирование вируса. Вирулентные штаммы вируса ИНГТ можно культивировать в организме восприимчивых видов рыб (форель, нерка, лосось и др.). Также для этих целей используют перевиваемые культуры клеток рыб, в которых достигается высокий уровень накопления вируса [125]. Доказана чувствительность к вирусу ИНГТ следующих перевиваемых культур клеток: из гонад радужной форели (RTG-2), хвостового стебля толстоголового гольяна (FHM), папулезной эпителиомы карпа (ЕРС) и др. [7, 16, 24, 125]. В перечисленных культурах клеток при 14-18oС вирус начинает размножаться спустя 16 - 24 ч, первые признаки ЦПД появляются через 32 - 48 ч, которые выражаются в увеличении базофилии ядра и уменьшении плотности хроматина в нем. Через 3 - 4 дня размер ядра увеличивается и часто в одной клетке наблюдают два или несколько ядер. Затем клетки округляются и образуют группы в виде виноградной грозди. Через 5 - 7 дней после заражения клетки отделяются от поверхности культурального флакона, и в это время титры вируса бывают самыми высокими [16].

2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по ИНГТ в России и в мире Механизм и пути передачи возбудителя. Заражение происходит при контакте рыбы с возбудителем ИНГТ в результате взаимодействия здоровых и больных рыб или при нахождении здоровой рыбы в воде, содержащей вирусные частицы. Инфицированная рыба выделяет вирус с мочой и слизью, с половыми продуктами, через жабры и кожу. Возбудитель передается через воду, ил и рыбоводный инвентарь. Возможен оральный путь передачи при каннибализме, скармливании внутренностей инфицированных рыб. Молодь заражается при передаче вируса от родителей своему потомству через икру, а также от возвратившихся из моря производителей, переболевших ИНГТ [1, 41, 126].

Эпизоотии ИНГТ обычно имеют два пика: весенний (конец зимы — начало лета) и реже — осенний (конец лета и осень), но при 8-17 °С могут наблюдаться в любое время года. Наиболее остро болезнь протекает при 10-12 °С, что приводит к гибели 80—100 % молоди. Если не принимать экстренных мер, то в течение одного месяца погибают более 90% сеголеток.

Рыбы старшего возраста (годовики и двухлетки), как правило, болеют реже и легче. Возможна также циркуляция вируса в популяции рыб без возникновения вспышки ИНГТ.

Основные пути распространения ИНГТ - бесконтрольные перевозки больных рыб и оплодотворенной икры из неблагополучных по ИНГТ водоемов или хозяйств в благополучные зоны. Обострению течения болезни способствует совместное выращивание в одном водоеме или бассейне здоровых и больных рыб и содержание рыб разных возрастных групп. Перенос вируса в благополучный водоем может произойти вследствие захода в них рыбвирусоносителей при отсутствии заградительных сооружений на магистральных каналах водоисточника [12, 122].

Источники и резервуары. Основными хозяевами вируса ИНГТ являются Salmonidae).

представители семейства лососевых рыб (сем. К видам, восприимчивым к данному вирусу в естественных условиях, относятся:

радужная форель (Oncorhynchus mykiss), кижуч (Oncorhynchus tshawytscha), нерка (Oncorhynchus nerka), кета (Oncorhynchus keta) и атлантический лосось (Salmo salar). Представители других семейств, например сельдь (Clupea pallasi), треска (Gadus morhua), осетр (Acipenser transmontanus) также могут быть инфицированы вирусом ИНГТ в дикой природе [125]. При этом у самок накопление вируса обычно выше, чем у самцов [122]. После эпизоотии часть переболевших или устойчивых к заболеванию рыб становятся вирусоносителями, которые формируют естественный резервуар данной инфекции. В качестве вирусоносителей могут также служить карп Кои и желтый окунь [129]. В аквакультуре источником вируса служит также погибшая от ИНГТ рыба [1, 21].

Экономический ущерб. Страны неблагополучные по ИНГТ несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели рыбы, затрат на проведение карантинных мероприятий, уничтожение больных и подозреваемых в заражении ИНГТ рыб, а так же затрат на проведение диагностических исследований в рамках мониторинга [39].

Ситуация по ИНГТ в России и в мире. Вирус ИНГТ распространен по всему миру [162]. Впервые заболевание было зарегистрировано в 1953 г. в США, на рыбозаводах штатов Вашингтон и Орегон, расположенных в бассейнах рек Тихого океана, а затем в Канаде и на Аляске. В семидесятые годы болезнь появилась в Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Японии. С 1987 года встречается во Франции, Италии, Германии. По данным Всемирной Организации здоровья животных (OIE, МЭБ), в течение последних 15 лет было зарегистрировано около 100 вспышек ИНГТ в различных странах мира [4, 125, 143]. В Российской Федерации вспышки данного заболевания зафиксированы в 2000 - 2009 гг. [11, 34, 125, 141]. В 2000 г.

в экспериментальном форелевом хозяйстве п. Рыбное Московской области у молоди радужной форели впервые возникла эпизоотия ИНГТ. Вирус был занесен в хозяйство с икрой неизвестного происхождения. В 2001 г. вирус регулярно выявляли у тихоокеанских лососевых рыб, заходивших на нерест в реки Камчатки [149]. В 2004 г. вирус ИНГТ обнаружили в ООО "Селекцентр" в г. Удомля Тверской области. Не исключена циркуляция вируса ИНГТ на Сахалине и Дальнем Востоке. В Сибири эпизоотическая ситуация неизвестна [49, 52, 150, 163]. В настоящее время приказом Министерства сельского хозяйства РФ ИНГТ отнесен к особо опасным болезням, что предусматривает масштабный контроль данного заболевания, важным звеном которого является эпизоотологический мониторинг [39].

2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при ИНГТ Патогенез. Проникновение вируса ИНГТ в организм рыбы происходит через жабры, либо при попадании на повреждённую кожу или слизистые оболочки. Возможен алиментарный путь заражения при каннибализме. В месте внедрения в организм вирус находится от нескольких часов до нескольких дней.

Затем во время диссеминации он продвигается по нервному, гематогенному и лимфатическому путям, проникает в центральную нервную систему, органы гемопоэза, почки, сердце, где происходит размножение и накопление вируса.

Далее вирус начинает распространяться по всему организму рыбы [132].

Клинические признаки. Заболевание, вызванное вирусом ИНГТ, носит системный характер, проявляется в форме экссудативно-геморрагического синдрома, развитие которого обусловлено размножением вируса в соединительной, гемопоэтической ткани и клетках экскреторной части почек, что ведет к нарушению водно-минерального баланса, выходу плазмы и клеток крови в окружающие ткани и полости тела. Первыми признаками заболевания являются анорексия, угнетенное состояние рыб, утрата реакции на внешние раздражители. У больных рыб отмечают экзофтальм, побледнение жабр, точечные кровоизлияния в периокулярной соединительной ткани глаз и в межлучевой ткани оснований плавников. Из ануса отдельных больных рыб свисают длинные тяжи слизеподобной консистенции. У личинок наблюдаются множественные кровоизлияния в желточный мешок и гидроцефалия в виде припухлости на голове. Хроническая форма течения болезни характеризуется менее выраженными клиническими признаками [12, 104, 109, 124, 125, 161].

Патологоанатомические изменения. При вскрытии больной рыбы в полости тела обнаруживают скопление желтоватого экссудата, множественные кровоизлияния в перивисцеральной жировой ткани, на брюшине, стенках кишечника и плавательного пузыря. Желудочно-кишечный тракт свободен от пищи, иногда наполнен слизеподобным содержимым молочно-белого цвета. При гистологическом исследовании в ацитарных клетках поджелудочной железы находят тельца-включения. В почках регистрируют некротические фокусы и кровоизлияния. Селезенка бледная, в печени иногда выявляют некротические участки [1, 21].

2.4 Лабораторная диагностика ИНГТ Окончательный диагноз на ИНГТ ставится на основании результатов лабораторной диагностики. Установить заражение вирусом ИНГТ невозможно в течение большей части инкубационного периода. Только после репликации в центральной нервной системе, органах гемопоэза, почках и сердце вирус накапливается и может быть посмертно выявлен методами лабораторной диагностики [19, 41, 124, 125].

Объектом лабораторного исследования на ИНГТ является пул внутренних органов рыбы (головного мозга, жаберных крышек, сердца, почек и селезенки).

При вскрытии особое значение придают технике безопасности, а так же исключению возможности перекрестной контаминации образцов [41].

Лабораторная диагностика на основе реакции диффузной преципитации (РДП) в настоящее время не применяется из-за низкой чувствительности.

Иммунохимический метод (ИХМ) в диагностике обычно не используют из-за трудоемкости и длительности постановки реакции [22, 25].

По руководству МЭБ (OIE), для лабораторной диагностики ИНГТ используют методы вирусвыделения в чувствительных культурах клеток, ИФА, РИФ и ОТ-ПЦР [41, 125]. Схема лабораторной диагностики по принципу действия представлена на рисунке 3.

–  –  –

- ОТ-ПЦР

- ИФА

- ОТ-ПЦР-РВ

- РИФ

–  –  –

2.4.1 Выделение вируса в культуре клеток рыб. С целью первичного выделения вируса ИНГТ из патологического материала используют чувствительные клеточные линии гонад радужной форели (RTG-2), хвостового стебля толстоголового гольяна (FHM) и папулезной эпителиомы карпа (ЕРС) [125]. Для заражения готовят 10-кратные серийные разведения супернатанта патологического материала рыб и инокулируют им преформированный 1-2суточный неплотный монослой, сформированным на 70-100%.

Инокулированные культуры клеток инкубируют в течение 10 суток, подвергая ежедневному микроскопированию [23]. При отсутствии в них характериных изменений монослоя, отличных от таковых в положительном контроле, проводят два «слепых» пассажа патматериала. Результат исследования считают негативным при отсутствии изменений монослоя во втором «слепом» пассаже.

Появление признаков цитопатического действия (ЦПД) в инокулированной культуре клеток свидетельствует о выделении цитопатогенного агента [111, 125].

По сравнению с биопробой при выделении вируса ИНГТ в культуре клеток нет необходимости в экспериментальных животных, что снижает стоимость исследования [7, 41].

Реакция заключается в 2.4.2 Реакция иммунофлуоресценции (РИФ).

использовании флуоресцентных конъюгатов, для получения которых молекулы иммуноглобулина, специфичные к антигенам вируса ИНГТ, ковалентно соединяют с флуоресцентной меткой [33, 37, 87, 140]. Конъюгат взаимодействует с антигеном вируса ИНГТ, находящимся в монослое.

Образующийся комплекс антиген-антитело выявляют в инфицированных клетках в виде включений посредством флуоресцентной микроскопии [55, 97, 108].

РИФ обладает рядом достоинств: высокая чувствительность и специфичность, быстрота выполнения и относительная дешевизна. Время проведения анализа составляет около 2-3 часов, что дает ему значительные преимущества перед другими диагностическими методами [91]. К недостаткам относят отсутствие количественного способа учета, субъективность оценки результатов, в связи с чем, необходимо профессиональное обучение и приобретение опыта работы [55, 76].

2.4.3 Иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления вируса ИНГТ проводят сэндвич-вариант ИФА [15, 91]. Анализ заключается в предварительной сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулином G к антигену вируса ИНГТ.

Затем в лунки планшета вносят контрольные образцы и исследуемые пробы, инкубируют в течение часа при 37°С. После этого в течение часа при 37°С в лунках инкубируют специфичный пероксидазный коньюгат и после промывки визуализируют реакцию внесением хромогенного субстрата. Учитывают реакцию с помощью многоканального автоматического спектрофотометра.

2.4.4 Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция В дополнение к вирусологическим и серологическим (ОТ-ПЦР).

исследованиям в настоящее время для лабораторной диагностики вирусных болезней рыб широко используют молекулярные методы, направленные на обнаружение фрагментов нуклеиновой кислоты возбудителя. Показана возможность использования ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса ИНГТ, выделенного от различных видов рыб [17, 58, 64, 66, 70, 81, 102, 114, 117, 133, 136, 153, 160]. Так, в литературе описано применение диагностических ОТ-ПЦР систем на основе праймеров на гены N и G [17, 54, 58, 61, 64, 66, 72, 81, 86, 90, 98, 107, 117]. Большинство опубликованных методов позволяют использовать праймеры на основе гена N, который является высоко консервативным у изолятов вируса ИНГТ различных географических регионов, что делает его удобным для использования в качестве гена-мишени в ПЦР для выявления вируса ИНГТ [57, 72, 85]. Liu, Teng et al.

(2008) разработали ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением праймеров на ген N. Purcell et al. (2006) предложили тест-систему на основе ОТ-ПЦР-РВ с применением праймеров на ген G для проведения широкомасштабного исследования патологического материала лососевых рыб из Северной Америки и типирования выделенных изолятов вируса. Bruchhof еt al. (1995) разработали систему праймеров для амплификации участка гена G размером 548 п.н. Для выявления РНК вируса ИНГТ Kurath, Garver et al. (2006) проводили амплификацию фрагмента гена G размером 753 п.н. [103]. Результаты секвенирования ПЦРпродуктов продемонстрировали высокую специфичность амплификации.

Morzunov, Winton et al. (1995) выявили наиболее консервативную последовательность нуклеотидов RNA: UCURUC(U)7RCCGUG(N)4CACR, которую использовали для разработки праймеров. Emmenegger et al. (2000) использовали систему праймеров для обнаружения фрагментов G-гена с длиной 693 п.н., LaPatra S.E. et al. (2001) – длиной 1231 п.н. Arakawa et al. (1990), Winton, Einer-Jensen et al. (2002) разработали системы праймеров для амплификации различных фрагментов генов N и G [54, 152].

Применение мультиплекс-ПЦР позволяет одновременно амплифицировать несколько последовательностей-мишеней и предполагает использование более одной пары праймеров в одной пробирке [65, 159, 160]. Так, Sweeney at al. (1996) разработали дуплекс-ПЦР для одновременного выявления в одном образце патологического материала лососевых рыб вирусов ИНГТ и ИНПЖ. Williams, Blake et al. (1999) разработали мультиплекс-ПЦР для обнаружения в одном исследуемом образце вирусов ИНГТ, ВГС и ИНПЖ. В выше перечисленных работах используется общепринятый метод ПЦР, применяется система праймеров IHN3 и IHN4, анализ полученных ампликонов размером 371 н.о.

проводится с помощью электрофореза в агарозном геле, поэтому дифференциация продуктов ПЦР производится по их размеру [110, 159]. По сравнению с выделением вируса в культуре клеток метод ОТ-ПЦР может быть более чувствительным, что подтверждают данные исследований Knusel R., Bergmann S.M.,Barlic-Maganja D. et al. [61, 98].

Незаменимым инструментом в диагностике инфекционных болезней аквакультуры стала полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Данный метод характеризуется высокой специфичностью и снижает риск контаминации. В основе метода лежит увеличение флуоресцентного сигнала, регистрируемого с помощью детектора. Тест-системы на основе ОТПЦР-РВ характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и применяются для проведения скрининговых исследований. Разработанный метод позволяет в реальном времени регистрировать накопление продуктов ПЦР и флуоресцентного сигнала, возрастающего при увеличении количества свободного флуорофора.

Применяется технология TagMan PCR, основанная на использовании 5'экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь вносят ДНКзонд, меченый на 5'-конце флуоресцентным красителем (FAM/ROX), а на 3'конце – фосфатной группой и гасителем флуоресценции (BHQ1), который поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение. Зонд комплементарен внутреннему участку амплифицируемой области гена вируса (рисунок 4).

Примечания: 1 – отжиг праймеров, 2 – амплификация, 3 – выщепление метки, 4 – амплификат.

Рисунок 4 – Принцип ПЦР-РВ При отжиге праймеров зонд количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять зонд за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресцентного сигнала будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта [128, 135, 139].

С 90-х гг. XX в. ОТ-ПЦР-РВ проводят также с применением диагностических ПЦР-чипов, на гидрофильном дне которых адсорбирована смесь компонентов для одновременного проведения обратной транскрипции и ПЦР. На сегодняшний день в нашей стране в ООО «Люмэкс-Маркетинг»

разработаны тест-системы, позволяющие выявлять возбудителей различных вирусных и бактериальных болезней птиц и КРС (болезнь Ньюкасла, инфекционный бронхит кур; Chlamidophila abortus, Brucella spp., Leptospira interrogans, Ureaplasma diversum, Trichomonas foetus, Campylobacter fetus и др.) [164]. ПЦР-чипы и микрочиповый амплификатор «АриаDNA» отечественного производства, требуют малый расход реактивов, поэтому их стоимость ниже по сравнению с заграничными аналогами. Для работы достаточно провести выделение РНК вируса из патологического материала и внести ее в микрореакторы, что упрощает процедуру анализа, снижает требования к лабораторному персоналу и сокращает время для проведения исследования.

Нанесение на рабочую поверхность чипа минерального масла позволяет минимизировать риск контаминации и тем самым уменьшить число ложноположительных результатов.

Перевод ОТ-ПЦР-РВ в формат ПЦР-чипов позволит создать диагностическую тест-систему нового поколения с высокой аналитической и диагностической чувствительностью и специфичностью, снижением количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа по сравнению с классическим вариантом ОТ-ПЦР.

Таким образом, по руководству OIE, лабораторная диагностика ИНГТ предусматривает постановку биопробы на чувствительной рыбе, выделение вируса в чувствительных клеточных линиях. Серологическую идентификацию вируса проводят с применением зарубежных коммерческих наборов для ИФА и РИФ. Для выявления РНК вируса используют методы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, предполагающие использование дорогостоящего оборудования и реактивов зарубежных фирм. Применение этих методов предполагает наличие аквабазы, закупку дорогостоящих коммерческих наборов и оборудования для проведения анализа, поэтому разработка экспресс-методов диагностики для дополнения данной схемы актуальна.

2.5 Реакция агглютинации латекса как метод диагностики вирусных болезней Общая характеристика метода. Одним из широко используемых в настоящее время иммунохимических методов диагностики инфекционных болезней является реакция агглютинации латекса (РАЛ), которая применяется как в медицине, так и в ветеринарной практике для выявления небольших количеств антигенов или антител в исследуемом материале [44, 48]. Впервые РАЛ описали Singer J.M. и Plotz C.M. в 1956 г. С тех пор в медицинских и ветеринарных журналах было опубликовано более 400 статей по применению данного вида анализа. В настоящее время в мире широко применяются коммерческие наборы, основанные на РАЛ, для обнаружения антигенов вирусов, бактерий, грибов, одноклеточных паразитов, а также для выявления сывороточных белков, гормонов, лекарственных препаратов и других веществ [20, 138, 163]. Широкий спектр тестов латексной агглютинации для нужд медицины и ветеринарии производят предприятия «Microgen Bioproducts», «Biovitrum» и др. В частности, с помощью модифицированных латексов обнаруживают антигены вируса бешенства, бактерий рода Camphilobacter, Salmonella, Listeria и др. [31, 93]. На основе моноклональных антител синтезированы латексные препараты для скрининга эпителиального опухолевого маркера в крови онкологических больных. Проведена серодиагностика герпеса при помощи латексных препаратов. Латексы также нашли прикладное применение при диагностике геморрагического колита, гемолитическиуремического синдрома и других инфекционных заболеваний [36, 151].

Для получения латексных препаратов используют микроскопические полимерные частицы органической природы, поверхность которых сенсибилизируют биолигандами (антителами). К преимуществам использования латексов относят: 1) монодисперсность частиц, позволяющую визуально выявлять агглютинацию; 2) широкий выбор функциональных групп, вводимых на поверхность частиц, что дает возможность связывать белки и повышать коллоидную стабильность латексных препаратов; 3) гидрофобность поверхности, обеспечивающую высокую степень адсорбции биолиганда на поверхности носителя [14, 94, 118].

РАЛ основана на специфическом взаимодействии антигена и антитела, один из которых иммобилизован на поверхности латексных частиц [83]. РАЛ используют для обнаружения в исследуемом образце антигенов или антител при смешивании биологической жидкости с суспензией латексного препарата (рисунок 5).

А

Б Примечания: А – выявление антигена, Б – выявление антител.

Рисунок 5 – Сущность РАЛ Важным преимуществом РАЛ является возможность проведения анализа как в условиях лаборатории, так и непосредственно на рыбоводных хозяйствах.

Стоимость исследования значительно ниже, чем при использовании других диагностических тест-систем. Длительность реакции составляет 10 - 30 минут.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.