WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Федеральный центр охраны здоровья животных»

На правах рукописи

Сухарьков Андрей Юрьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ

ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ

03.02.02 «Вирусология»

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук



Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук,

Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика возбудителя бешенства

2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по бешенству в России и в мире

2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве

2.4 Лабораторная диагностика бешенства

2.5 Определение уровня антител в сыворотках крови

2.6 Меры борьбы с бешенством

2.7 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы и методы

3.2 Результаты собственных исследований

3.2.1 Отбор проб патологического материала

3.2.2 Контроль поедаемости оральных антирабических вакцин

3.2.3 Разработка метода определения антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе

3.2.4 Разработка метода выявления антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте иммуноферментного анализа

3.3 Обсуждение результатов

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

8 ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А Методические указания по отбору и пересылке проб головного мозга, сывороток крови и костной ткани с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральных антирабических вакцин............... 138 Приложение Б Методические указания по обнаружении флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин

Приложение В Методические указания по определению антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе

Приложение Г Методические указания по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Бешенство – широко распространённое вирусное заболевание животных, которое вызывает нейротропный вирус рода Lyssavirus в семействе Rhabdoviridae, отряд Mononegavirales. В пределах рода выделяют двенадцать генотипов [108]. Наибольший интерес вызывает вирус классического бешенства (RABV). В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира. Классическое бешенство не регистрируется в Японии, Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [78, 160]. Особенно сложная ситуация в Африке, Азии и Латинской Америке, где регистрируют городской тип бешенства.

Страны неблагополучные по бешенству несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели животных, затрат на отлов бродячих животных, карантинные мероприятия, уничтожение больных и подозреваемых в заражении бешенством животных, а так же затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирование численности диких и бродячих животных и диагностические исследования.

Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. С помощью оральной вакцинации было ликвидировано классическое бешенство в большинстве стран Западной Европы. Уменьшение численности диких плотоядных имеет лишь ограниченный эффект [13, 14].

Мониторинг – важная составляющая программы оральной антирабической вакцинации. Он позволяет оценить эпизоотическую обстановку по бешенству в зоне вакцинации, а также качество проводимых мероприятий путем оценки поедаемости вакцинных приманок и уровня серопревалентности.

В Российской Федерации борьбе с бешенством в природной среде с помощью оральной вакцинации диких животных уделяется все большее внимание, как и вопросам мониторинга ее эффективности. Однако проводить исследования по оценке эффективности антирабической вакцинации с использованием классических методов в настоящее время имеют возможность лишь крупные научно-исследовательские учреждения.





Таким образом, актуальной задачей является разработка и усовершенствование существующих методов, позволяющих в ветеринарных лабораториях разного уровня качественно и быстро оценить результаты проведенной оральной антирабической вакцинации.

Степень разработанности темы. Оценке оральной антирабической вакцинации посвящены работы ряда зарубежных [28, 36, 40, 50, 55, 188] и отечественных [5, 8] авторов.

Поедаемость оральных антирабических вакцин рекомендуют оценивать с помощью биологических маркеров, которые включают в состав приманок.

Обычно в качестве маркера используют антибиотики тетрациклинового ряда (тетрациклины) [143]. Данным способом оценивали большинство кампаний по оральной антирабической вакцинации, проводимых в Европе и Северной Америке. В России метод оценки поедаемости оральных вакцин до 2007 года не использовался. Учитывая тот факт, что оральная вакцинация все чаще применяется для борьбы с бешенством в России, было необходимо освоить и внедрить в лабораторную практику этот метод.

Основным методом оценки эффективности антирабической вакцинации на сегодняшний день является РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток. Этот метод имеет ряд недостатков: он дорогостоящий и требует большого количества времени на постановку. Эпизоотическую обстановку по бешенству принято определять путем проведения лабораторных исследований проб головного мозга с помощью РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Однако этот метод малопригоден при широкомасштабных исследованиях, с использованием большого количества проб, ввиду своей трудоемкости. МЭБ (Международное Эпизоотическое Бюро) предлагает в качестве возможной альтернативы для оценки эффективности вакцинации использовать ИФА (иммуноферментный анализ) для определения количества антирабических антител, а для диагностического мониторинга, в случаях, если отсутствует опасность заражения человека, использовать ИФА для выявления ВБ (вирус бешенства) [142]. В связи с этим целесообразно было разработать ИФА для определения уровней антирабических антител и для диагностики бешенства, оценить возможность использования данных методов для проведения диагностического мониторинга и мониторинга эффективности антирабической вакцинации.

Цели и задачи исследований. Основной целью работы являлась разработка методов, позволяющих оценить качество мероприятий по оральной антирабической вакцинации диких животных и провести диагностический мониторинг по бешенству в зоне вакцинации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать методику по отбору и пересылке проб с целью диагностики бешенства животных и оценки качества проведения оральной антирабической вакцинации;

- освоить и внедрить в лабораторную практику метод определения тетрациклина в тканях костей и зубов;

- разработать ИФА для определения уровней антител к гликопротеину ВБ в сыворотках крови животных;

- разработать прямой сэндвич-вариант ИФА для обнаружения вируса бешенства в головном мозге животных;

- оценить поедаемость оральных антирабических вакцин с помощью метода определения тетрациклина в тканях костей и зубов в ряде регионов РФ;

- провести диагностический мониторинг по бешенству с использованием разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА в ряде регионов РФ.

Научная новизна. Оценена поедаемость оральных антирабических вакцин в ряде регионов Российской Федерации и Республики Беларусь, используя метод обнаружения тетрациклина в тканях зубов и костей животных.

Оценена возможность использования прямого сэндвич-варианта ИФА с целью проведения диагностического мониторинга по бешенству. С помощью ИФА проведен мониторинг по бешенству в Калининградской, Ленинградской областях и Республике Карелия.

Разработан ИФА для определения в сыворотках крови животных антител к гликопротеину вируса бешенства, который позволяет проводить количественную оценку иммунитета.

Усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральной антирабической вакцинации.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенных исследований разработанны:

- «Методические указания по отбору и пересылке проб головного мозга, сывороток крови и костной ткани с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральных антирабических вакцин», утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 01.07.2009 (см. Приложение А);

- «Методические указания по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин», утверждены заместителем руководителя Россельхознадзора России 31.05.2010 (см.

Приложение Б);

- «Методические указания по определению антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе», утвержденны директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 2010 (см. Приложение В);

- «Методические указания по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа», утвержденны заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» 2012 (см. Приложение Г).

Разработанные методы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и других научных учреждениях и лабораториях ветеринарного профиля.

В работе применяли Методология и методы исследования.

биохимические, вирусологические, серологические и культуральные методы исследования, использовали выделение вируса биопробой на мышах, реакцию нейтрализации в культуре клеток, иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализы и другие методы.

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, отдельные этапы работы выполнены с участием других сотрудников лаборатории.

Консультативную и методическую помощь при выполнении работы оказывал канд. биол. наук Назаров Н.А.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Оценка поедаемости оральных антирабических вакцин.

- Определение уровней антител к гликопротеину ВБ в ИФА в сыворотках крови животных.

- Выявление антигенов ВБ в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте ИФА.

Степень достоверности и апробация результатов. Для получения достоверных результатов большинство опытов, представленных в диссертации, проводили в нескольких повторах. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии» (г. Чебоксары, 2011 г.) и на 29-ом Международном конгрессе биологов-охотоведов (г. Москва, 2009 г.), а также неоднократно докладывались на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ», Российско-Финских совещаниях по профилактике бешенства диких животных в граничаших с Финляндией регионах России. По теме диссертационной работы опубликовано семь научных статей, в том числе три статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице. Список литературы включает 22 отечественных и 199 зарубежных источников.

Работа иллюстрирована 29 таблицами и 19 рисунками. Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2008-2012 гг. в лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика возбудителя бешенства Классификация и таксономия. Бешенство вызывает нейротропный вирус рода Lyssavirus в семействе Rhabdoviridae, отряд Mononegavirales.

В пределах рода выделяют двенадцать генотипов [108]. К ним относят вирус классического бешенства (RABV) и выделенные на Африканском континенте вирусы Lagos bat (LBV), Mokola (MOKV), Duvenhage (DUVV) [116], а так же Европейские лиссавирусы летучих мышей 1-го (EBLV1) и 2-го типа (EBLV2), австралийский лиссавирус летучих мышей (ABLV). Кроме того, вирус Irkut (IRKV) выделенный в Восточной Сибири, вирус летучих мышей Западного Кавказа (WCBV) [140], вирусы Центральной Азии Aravan (ARAV) и Khujand (KHUV) [41, 137], вирус Shimoni bat (SHIBV), выделенный от летучей мыши в Кении [185] признаны новыми генотипами. Вирус Bokeloh Bat (BBLV) [139], выделенный от летучей мыши в Германии, к настоящему времени официально не признан отдельным генотипом.

Классическое бешенство распространено по всему миру, и является причиной подавляющего большинства зарегистрированных случаев бешенства животных и человека. Другие лиссавирусы, по-видимому, более ограниченны географически и кругом хозяев, при этом выделялись, чаще всего, от летучих мышей.

Лиссавирусы были разделены на две филогруппы, которые также имеют различные антигенные характеристики [80]. RABV, DUVV, EBLV и ABLV благодаря наличию общих антигенных характеристик гликопротеина вызывают перекрестный нейтрализующий иммунитет. Снижение защиты при использовании классических антирабических вакцин наблюдалось в случае заражения IRKV, ARAV и KHUV [69]. Все указанные выше виды лиссавирусов были отнесены к первой филогруппе. Перекрестная защита, при этом, практически отсутствует в случае заражения вирусами, представителями второй филогруппы (MOKV и LBV) [80]. WCBV не показывает перекрестных серологических реакций с представителями обеих филогрупп.

Морфология вириона. Вирионы имеют пулеобразную цилиндрическую форму, округлую на одном конце и плоскую на другом, с диаметром 75 нм (60нм) и длиной 180 нм (130-250 нм) [100, 191, 198].

Геном ВБ (вирус бешенства) представлен несегментированной одноцепочечной негативной спиральной РНК (рибонуклеиновая кислота) длиной приблизительно 12000 нуклеотидов. РНК вируса бешенства кодирует пять белков:

нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (P-белок), матриксный протеин (Mбелок), гликопротеин (G-белок) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок).

Вирусная РНК вместе с нуклеопротеином составляет РНП (рибонуклеопротеин). Кроме того, с РНП тесно связанны два других белка, L-белок и P-белок. Указанные белки и связанная с ними РНК образуют активный РНК-комплекс, который контролирует транскипцию и репликацию вируса. Mбелок и G-белок формируют внешнюю оболочку вириона. Строение вириона ВБ схематично представлено на рисунке 1 [158].

Примечания: G – гликопротеин, M – матриксный протеин, P – фосфопротеин, N – нуклеопротеин, L – РНК-зависимая РНК-полимераза.

Рисунок 1 – Схематическое изображение вириона вируса бешенства Структура и функции вирусных белков. Нуклеопротеин. N-белок один из наиболее изученных белков ВБ после G-белка и самый представительный в количественном отношении. N-белок – фосфорилированный полипептид, состоящий из 450 аминокислот. N-белок вместе с РНК, Р- и L- белками образует РНП. РНП, при введении его в организм, вызывает образование защитного иммунитета у животных против периферического заражения смертельной дозой вируса бешенства [101, 105]. Аминокислотная последовательность N-белка является самой стабильной (консервативной) из вирусных белков, поэтому антитела к РНП используют в диагностических реакциях. N-белок является основным антигеном, обладающим способностью к перекрестным реакциям с антителами к N-белку других родственных вирусов.

Фосфопротеин. Р-белок состоит из 297 аминокислот. Данный белок существует в двух формах с различной степенью фосфорилирования [91, 199]. Он играет ключевую роль в качестве некаталитического кофактора в транскрипции и репликации вирусного генома [45, 104, 129]. Р-белок способен взаимодействовать с N-белком и является ключевым компонентом и регуляторным белком, связывающим L-белок в комплекс с вирусным геномом. Он взаимодействует с Nбелком и L-белком через области, которые являются специфическими для каждого из них. Так же фрагменты P-белка способны ингибировать выработку внутриклеточного интерферона [48].

L-белок. L-белок имеет высокую относительную молекулярную массу и состоит из 2142 аминокислот. Он является каталитическим компонентом полимеразного комплекса, который, наряду с некаталитическим кофактором – P-белком, отвечает за большинство ферментативных реакций, участвующих в транскрипции вирусной РНК и репликации. L-белок играет уникальную роль в начале инфекционного процесса, инициируя первичную транскрипцию геномной РНК после попадания РНП в цитоплазму инфицированной клетки.

М-белок. М-белок вируса бешенства самый маленький из белков вириона, содержит 202 аминокислоты [46, 51, 58, 134, 154]. Он существует в двух изоформах. Кроме того, М-белок образует димеры, которые прочно связываются с G-белком [52]. Главная функция матричного протеина заключается во взаимодействии с цитоплазматическим доменом G-белка и РНП во время сборки вириона ВБ.

Гликопротеин. G-белок – один из наиболее изученных белков, как на структурном, так и на иммунологическом уровнях. G-белок имеет четыре различные области: сигнальный пептид, эктодомен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Зрелый G-белок состоит из 505 аминокислот, но сначала кодируется белок, состоящий из 524, который включает в себя сигнальный пептид [59, 134]. N-концевой 19-аминокислотный гидрофобный сигнальный пептид участвует в транспорте зарождающихся молекул G-белка к аппарату Гольджи, где в дальнейшем отщепляется. G-белок состоит из тримеров, которые образуют выступы на поверхности вириона (около 400 треугольных выступов) [133, 163]. Тримерный шип отвечает за взаимодействие с клеточными сайтами связывания (рецепторами) и, следовательно, играет важную роль в патогенезе бешенства [192]. G-белок важен для индукции гуморального иммунного ответа хозяина и в качестве цели для ВНА. Он также является мишенью для специфических Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток [94, 128].

Жизненный цикл вируса. Жизненный цикл вируса бешенства начинается с адсорбции вируса на поверхности клетки-мишени, за счет связывания вирусного G-белка со специфическим рецептором на поверхности клетки. После связывания вируса с клеточным рецептором, происходит слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной [193]. Далее вирионы проникают в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, что представляет собой образование покрытых оболочкой крупных эндосом (цитоплазматические везикулы) окружающих вирионы. Далее происходит слияние между оболочкой вируса и мембраной везикул, а так же диссоциация М-белока и РНП (раздевание). Слияние катализируется G-белком и понижением рН внутри эндосом, что приводит к высвобождению РНП комплекса в цитоплазму клетки-хозяина [43, 92, 93, 126].

Затем происходит транскрипция вирусного РНК-генома, которая начинается в цитоплазме инфицированной клетки [85, 99] трансляция вирусных белков и сборка новых вирионов [53, 107, 110].

Устойчивость вируса. Вирус чувствителен к воздействию высоких температур. При 70°С он инактивируется моментально, при 60°С в течение 5-10 минут. Низкие температуры консервируют вирус, и в течение всей зимы он сохраняется в мозге трупов животных. В гниющем материале вирус сохраняется в течение 2-3 недель. Аутолитические процессы и гниение вызывают гибель возбудителя в головном мозге трупов в зависимости от температуры через 5-90 дней. Ультрафиолетовые лучи убивают его за 5-10 минут. Солнечный свет при температуре 5-6°С обезвреживает вирус через 5-7 дней. В поверхностных слоях почвы вирус может сохраняться 2-3 месяца. Вирус устойчив к многократному замораживанию и оттаиванию, хорошо сохраняется в лиофилизированном состоянии [4]. В качестве дезинфицирующих средств используют 1-5% раствор формальдегида, хлорную известь, 3-5% раствор соляной кислоты, 5-7% раствор йода, 45-70% раствор этилового спирта. Мыльный раствор в концентрации 1% инактивирует ВБ в течение пяти минут.

Загрузка...

Вирулентные штаммы ВБ можно Культивирование вируса.

культивировать в организме восприимчивых видов животных (мыши, кролики и др.). Также для этих целей используют перевиваемые клетки неврального происхождения. Чувствительными к изолятам уличного бешенства оказались лишь некоторые клоны нейробластом.

Фиксированные штаммы успешно репродуцируются при интрацеребральных пассажах на кроликах, мышах, овцах и других видах животных. Они легко адаптируются к первичным и перевиваемым культурам клеток, в которых показывают различный уровень накопления.

С введением в практику методов культуры тканей появилась возможность получения более чистых по составу и высокоиммуногенных препаратов против бешенства.

Доказана чувствительность к ВБ таких перевиваемых культур как BHK-21, NIL-2, CER и др. Адаптированный к какой либо культуре клеток ВБ в последующем легко реплицируется в других клеточных системах [183]. Для культивирования ВБ могут быть использованы различные клеточные линии, но не все они пригодны для длительных пассажей и получения высокого уровня накопления вируса [4].

Фиксированные штаммы вируса бешенства. Фиксированные штаммы имеют большое значение как объект научного изучения и практического использования. Впервые фиксированный штамм ВБ получен Л. Пастером и был использован для изготовления первой антирабической вакцины. Фиксированные штаммы условно подразделяют на вакцинные и лабораторные.

Вакцинные штаммы применяются для производства антирабических вакцин. К вакцинным относятся штаммы SAD, ERA, Flury, Kelev, и др. В России в прошлом для производства инактивированных мозговых вакцин ветеринарного назначения использовался штамм «Овечий». Используя методы селекции, из него были получены фиксированные штаммы «Щелково-51», «О-73 Уз-ВГНКИ», «РБ-71», «Краснопресненский-85», а впоследствии штаммы ТС-80, «ВНИИЗЖ» и РВ-97. Для производства вакцин медицинского назначения используется штамм Внуково-32 [6].

Лабораторные штаммы используются в различных диагностических реакциях, а также при проверке активности антирабических вакцин путем заражения вакцинированных животных. Лабораторные штаммы представлены двумя близкородственными штаммами CVS и PMPV, полученными из Пастеровского штамма вируса бешенства [190].

2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по бешенству в России и в мире Механизм и пути передачи возбудителя. Заражение происходит при непосредственном контакте с источниками возбудителя бешенства в результате укуса или ослюнения кожных покровов или слизистых оболочек. Доказаны также аэрогенный, алиментарный и трансплацентарный пути передачи вируса. Описаны несколько случаев заражения людей в результате операции по трансплантации органов и тканей [165].

Инкубационный период при бешенстве зависит от многих факторов: места проникновения вируса в организм, количества проникшего в организм вируса, вирулентности и других биологических свойств вируса.

Чем богаче нервными окончаниями ткань в области ворот инфекции, тем выше вероятность развития инфекции. Наиболее опасны раны в области головы, шеи, плечь, а у людей – в области кистей рук. Укусы на бесшерстных местах кожи животных и на незащищенных частях тела людей особенно опасны, так как одежда и шерсть задерживают значительную часть слюны больного бешенством животного. Имеет значение и степень резистентности организма, зависящая от вида, состояния здоровья, возраста животного и многих других факторов [20].

Источники и резервуары. К ВБ чувствительны все виды теплокровных животных. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих (лисица, волк, шакал, енотовидная собака) и куньих, а также грызуны многих видов и домашняя кошка. Менее восприимчивы человек, собака, рогатый скот, лошадь, очень слабо восприимчивы птицы [21]. С учётом характера резервуара возбудителя различают эпизоотии природного типа, когда болезнь распространяют дикие плотоядные, и городского типа, когда источниками вируса и распространителями болезни являются бродячие собаки и кошки.

Рыжие лисицы являются главным распространителем бешенства и наиболее восприимчивым видом в Европейских странах [34, 127]. Вследствие проводимой оральной вакцинации лис практически ликвидировано бешенство в Западной Европе. В последние годы в Европе некоторое эпидемиологическое значение стало приобретать бешенство насекомоядных летучих мышей. Увеличение числа зарегистрированных случаев бешенства у европейских летучих мышей отмечается с 1985 года.

В Канаде болеют, главным образом, лисицы, в США еноты и скунсы [210]. В странах Латинской Америки основным резервуаром бешенства являются собаки и летучие мыши. Наибольшее число случаев бешенства у людей возникает вследствие покуса собаками. Особенно напряжённая в этом отношении ситуация сложилась на Африканском континенте и в некоторых азиатских странах [161].

Для бешенства характерно циклическое течение заболевания [12]. Для развития эпизоотии требуется, чтобы больное животное инфицировало как минимум двух восприимчивых животных. Однако это условие не может выполняться длительное время. Так как многие животные погибают, вследствие чего, количество восприимчивых животных уменьшается, а значит и количество контактов между ними сократщается. Таким образом, эпизоотический процесс бешенства является типичным, как и при других инфекционных заболеваниях, с одной лишь разницей – выздоровление больных особей, как правило, не наступает.

В результате периодического снижения численности восприимчивых животных из-за возникновения вспышки бешенства и восполнения численности популяции инцидентность бешенства колеблется с небольшой амплитудой в течение года и с более значительной в период от трех до пяти лет. При этом определённое влияние оказывают следующие факторы: численность лисиц, плотность их популяции, интенсивность контактов между ними, вирулентность возбудителя, инкубационный период инфекции и т.д. [37].

Экономический ущерб. Страны неблагополучные по бешенству несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели животных, затрат на отлов бродячих животных, карантинные мероприятия, уничтожение больных и подозреваемых в заражении бешенством, а так же затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирование численности диких животных и диагностические исследования.

Ситуация по бешенству в России и в мире. Бешенство – широко распространённое вирусное заболевание животных. В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира. Классическое бешенство не регистрируется в Японии, Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [78, 160]. Особенно сложная ситуация в Африке, Азии и Латинской Америке, где регистрируют городской тип бешенства. В Европе классическое бешенство регистрируют в основном в восточной части, в Западной Европе оно практически ликвидировано.

Наибольшее число случаев бешенства в Европе в 2012 году зарегистрировано в России, Украине, Турции, Белоруссии, Румынии, Польше, Хорватии и Молдавии. Сложная ситуация по бешенству в Эстонии, Латвии и Литве в последние годы в результате проводимых мероприятий значительно улучшилась. Динамика изменения числа случаев бешенства в Латвии, Литве и Эстонии в 2003-2012 годах представлена на рисунке 2.

–  –  –

В настоящее время в России и бывших союзных республиках ситуация по бешенству определяется как эпизоотия природного либо смешанного типа.

Динамика изменения числа случаев бешенства в России в 2003-2012 годах представлена на рисунке 3.

–  –  –

Данные, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о стабильно высоком уровне заболевания в стране. Несмотря на то, что в 2004 и 2006 годах были отмечены некоторые спады инцидентности бешенства, в 2005 и 2007 годах было отмечено существенное увеличение числа случаев этого заболевания, подтверждая его цикличность.

По мнению большинства исследователей, основным резервуаром и переносчиком бешенства являются дикие хищники семейства псовых – лисица, енотовидная собака, волк, корсак, а в тундровой зоне – песец. Структура заболеваемости бешенством в России в 2003-2011 годах показана на рисунке 4.

Рисунок 4 – Динамика изменения структуры заболеваемости бешенством животных в России в 2003-2011 гг.

Из данных, представленных на рисунке 4, видно, что основной вклад в рост числа случаев бешенства вносят дикие животные и обращает на себя внимание увеличение их доли от общего числа случаев бешенства. В тоже время в общей заболеваемости животных прослеживается снижение доли сельскохозяйственных животных с 28% в 2003 до 13% в 2011 году. Доля случаев бешенства домашних животных находится на высоком уровне и варьирует в пределах 27-34%.

В настоящее время случаи заболевания бешенством человека в Северной Америке и Европе (включая Россию) очень редки, по сравнению с Африкой и Азией, так как в большинстве случаев заражение происходит в результате покусов собаками, и наибольшее число жертв наблюдается в странах с городским типом бешенства. Мировая статистика показывает, что чаще других бешенством заболевают лица мужского пола в возрасте младше 16 лет [76, 113, 136, 215].

По-прежнему остается вероятность появления случаев бешенства у человека в свободных от данного заболевания странах. Несколько подобных случаев связано с заражением от летучих мышей (наличие бешенства летучих мышей не влияет на присвоение статуса свободной от бешенства страны).

Примером может служить случай гибели человека в Шотландии после контакта с летучей мышью, инфицированной EBL2 [83]. Также имеют место случаи въезда в страну свободную от бешенства инфицированных в других странах людей [77, 90].

В России, как в неблагополучной по бешенству стране, стабильно возникают случаи гибели людей от классического бешенства (таблица 1).

–  –  –

Из таблицы 1 видно, что ежегодно в России от бешенства погибает несколько человек. Ухудшение эпизоотической обстановки по бешенству может привести к значительно большему числу жертв, особенно при увеличении числа случаев бешенства среди домашних животных.

2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве Патогенез. Проникновение вируса бешенства в организм животного происходит через укус, либо при попадании на повреждённую кожу или слизистые оболочки (в том числе поврежденные). Аэрогенное заражение бешенством также возможно, но в практических условиях этот путь не играет никакой роли в распространении инфекции [37].

Вирус находится в месте внедрения в организм, по данным разных авторов, от нескольких часов до шести дней [20, 119]. Затем он продвигается по периферическим нервам центростремительно со скоростью несколько миллиметров в день и проникает в центральную нервную систему, где происходит размножение и накопление вируса. Гематогенный путь распространения вируса является редким или малозначительным [216]. Далее вирус начинает распространяться центробежно и попадает в различные органы и ткани, например слюнные и слёзные железы, роговицу глаза [1].

Клинические признаки. Проявление бешенства в общих чертах у различных животных сходно, но у каждого вида наблюдаются определенные особенности. Продолжительность инкубационного периода при бешенстве составляет от нескольких дней до нескольких лет [18]. Продолжительный инкубационный период при бешенстве у диких животных является важным фактором поддержания энзоотии бешенства, у лисиц он может составлять до 275 дней [20].

Наиболее характерными симптомами бешенства у животных являются:

повышенная возбудимость, неспровоцированная агрессия или параличи, слюнотечение, нарушение координации движений. В зависимости от превалирования признаков возбуждения или параличей различают буйную и тихую (паралитическую) формы бешенства. Встречается и атипичное течение болезни, которое проявляется различными нетипичными для бешенства признаками. Крайне редко бешенство протекает абортивно, т. е. развитие болезни внезапно приостанавливается и животное клинически выздоравливает.

Для бешенства диких плотоядных животных наиболее характерны такие симптомы как потеря страха перед человеком и агрессивность. Особую агрессивность проявляют волки, шакалы, собаки, скунсы. У лисиц и енотовидных собак агрессивность выражена слабее. Заболевшие лисицы и енотовидные собаки днем могут появляться в населённых пунктах, вступают в драки с собаками [13, 14]. У летучих мышей, как правило, клинических признаков не отмечается, их обнаруживают погибшими, а бешенство обнаруживается только при лабораторном исследовании головного мозга [54].

У человека бешенство проявляется деменцией, общей слабостью, тошнотой, рвотой, покраснением в области укуса, признаками воздухобоязни (аэрофобия) и водобоязни (гидрофобия), а также потливостью [22]. Отмечаются также галлюцинации, трудности при глотании, спазмы лицевых мышц, рта и шеи, продолжительное слюнотечение, нарушение координации движений. Заболевание сопровождается лихорадкой и, в конечном итоге, заканчивается смертью [221].

Патологоанатомические изменения. Патологические изменения при бешенстве не характерны и не позволяют поставить диагноз на эту инфекцию [21]. При наружном осмотре отмечают сильное истощение, следы укусов, расчёсов, часто шерсть пропитана слюной. При вскрытии выявляется застойное полнокровие внутренних органов, наиболее выражено в органах брюшной полости, кровь плохо свернувшаяся, темно-красного цвета. Слюнные железы гиперемированы, отечны. В полости желудка кормовые массы отсутствуют, но часто находят различные инородные тела (волосы, тряпки, ветки и др.).

Слизистые оболочки желудка и кишечника катарально воспалены, местами с кровоизлияниями.

В головном, спинном мозге и оболочках отмечаются гиперемия, отечность и участки кровоизлияния. При гистологическом исследовании в головном мозге больных бешенством животных выявляется диссеминированный негнойный полиэнцефалит, наиболее выраженный в амоновых рогах и продолговатом мозге.

В коре головного мозга и мозжечке наблюдается разрушение нейронов.

Значительные поражения имеются в клетках продолговатого мозга. В периваскулярных лимфатических пространствах появляются скопления клеток, содержащие лимфоциты, макрофаги и плазматические клетки, реже эритроциты.

Наблюдается пролиферация глии вокруг ганглиозных клеток и по ходу нервных волокон [4].

Важное значение имеет обнаружение в цитоплазме специфических включений – телец Бабеша-Негри. Они могут встречаться в слое пирамидальных клеток коры головного мозга, мозжечке, крупных нейронов базальных ганглиев, нейронах спинного мозга, но в максимальных количествах обнаруживаются в гиппокампе. Эти включения имеются у многих павших животных, но если животное убито в начальной стадии болезни, эти тельца могут не выявляться.

Тельца Бабеша-Негри обнаруживаются только у 24,5-73% инфицированных животных.

2.4 Лабораторная диагностика бешенства Окончательный диагноз на бешенство ставиться на основании результатов лабораторной диагностики, которая проводится незамедлительно. Результаты лабораторной диагностики на бешенство у животных являются определяющими при выборе схемы лечения пострадавших от них людей [205]. Установить заражение вирусом бешенства невозможно в течение большей части инкубационного периода. Только после репликации в центральной нервной системе вирус перемещается в слюнные железы и другие ткани, а значит, точный диагноз может быть поставлен посмертно при достаточном накоплении вируса в мозговой ткани. Так как несколько циклов репликации вируса происходят в головном мозге до наступления клинических симптомов [114], выявление образующихся вирусных антигенов в мозге возможно до появления признаков заболевания.

Объектом лабораторного исследования на бешенство является головной мозг, который отбирают путем вскрытия черепной коробки, либо используют полые трубки [23, 39], с помощью которых мозг извлекают через затылочное отверстие. При вскрытии особое значение придают технике безопасности, а так же исключению возможности перекрестной контаминации образцов [187].

Образцы транспортируют в лабораторию замороженными или охлажденными, глицерин в качестве транспортной среды используют только в крайних случаях, когда невозможно консервирование холодом, поскольку доказано уменьшение интенсивности иммунофлуоресценции при диагностике в РИФ даже после отмывки глицерина [197], особенно при использовании в сочетании со стандартной фиксацией ацетоном [32]. Многократные циклы замораживанияоттаивания, могут серьезно повлиять на чувствительность диагностических исследований. Если труп находится на поздних стадиях разложения или произошло повреждение головного мозга, материал может оказаться непригодным для использования классических методов диагностики, таких как РИФ и биологическая проба на мышах [204].

Наиболее точные результаты диагностики достигаются при исследовании сразу нескольких отделов мозга: ствол, мозжечок, кора больших полушарий и аммонов рог [42]. Хотя было высказано предположение, что достаточно изучения только ствола мозга [123, 164], другие авторы показали значимость исследования более чем одной области головного мозга [130, 169, 202], так как это может повысить чувствительность и достоверность диагностики в случае, если животное было убито накануне наступления клинического бешенства или в начале клинической фазы.

Диагностика бешенства основанная на клинической картине не возможна, так как симптомы сходны с некоторыми другими заболеваниями. Диагностика с использованием гистологических изменений (обнаружение телец Негри), а также РДП (реакция диффузной преципитации) в настоящее время не применяется из-за низкой чувствительности. Более того, гистологическое исследование не рекомендовано к применению руководством по диагностике и вакцинам МЭБ [142]. ИГХМ (иммуногистохимический метод) в диагностике обычно не применяют из-за трудоемкости и длительности постановки реакции.

При диагностике бешенства в образцах тканей выявляют белки ВБ или фрагменты его генома. Для этого используют РИФ, выделение вируса в организме животных и в культурах клеток, ИФА, ПЦР (полимеразная цепная реакция) и многие другие. Классификация методов лабораторной диагностики по принципу действия представлена на рисунке 5.

Реакция иммунофлуоресценции. Впервые для диагностики бешенства РИФ применили в 1958 г. Несмотря на то, что она применяется уже более 50 лет, РИФ остается золотым стандартом в диагностике бешенства, так как обладает рядом достоинств: высокая чувствительность, быстрота выполнения и относительная дешевизна. Но существуют и недостатки: отсутствие инструментального учета, субъективность оценки результатов, в связи с чем, необходимо профессиональное обучение и приобретение опыта работы [10].

Рисунок 5 – Методы лабораторной диагностики бешенства

С РИФ сравниваются и оцениваются все другие диагностические тесты на бешенство. Эта реакция так же применяется при выделении вируса на животных и в культурах клеток и при определении ВНА (вируснейтрализующие антитела) в сыворотках крови. Постановка реакции возможна в прямом и непрямом вариантах.

Наиболее часто РИФ применяют в прямом варианте. Реакция заключается в использовании флуоресцентных конъюгатов, для получения которых молекулы иммуноглобулина, специфичные к антигенам вируса, ковалентно соединяют с флуоресцентной меткой. Этот конъюгат реагирует с антигенами ВБ фиксированного ацетоном мазка-отпечатка из ткани головного мозга или культурального монослоя. Мазки фиксируют в ацетоне при температуре минус 20°С. Фиксация повышает проницаемость мембран (стенок) клеток для меченых антител и улучшает адгезию ткани с поверхностью предметного стекла. В европейских лабораториях успешно используют 30-минутный период фиксации.

В качестве альтернативы ацетону описана микроволновая фиксация [60], но она, как правило, не применяется. Промывка удаляет несвязавшийся конъюгат. Затем образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется посредством флуоресцентной микроскопии (рисунок 6).

Б А Примечания: А – положительный результат, Б – отрицательный результат.

Рисунок 6 – Микрофотографии РИФ Для производства конъюгатов в основном используют препараты антител, специфичные к РНП ВБ. РНП обнаруживают в инфицированных клетках в виде цитоплазматических включений [86]. В качестве флуоресцирующей метки для диагностики бешенства используют флуоресцеинизотиоцианат, так как он характеризуется стабильностью и создает характерную ярко зеленую флуоресценцию, которая отличается от флуоресценции создаваемой животными тканями [117]. Конъюгат может содержать контрастирующие краски, такие как эванс синий, для окрашивания фона и снижения неспецифической флуоресценции [176].

Источником молекул иммуноглобулина для приготовления конъюгата служат сыворотки гипериммунизированных животных. Для получения иммунной сыворотки наиболее часто используются хомяки, кролики и лошади гипериммунизированные очищенным и концентрированным фиксированным лабораторным или вакцинным штаммом ВБ [180, 203]. В качестве иммуноглобулинов специфичных к РНП ВБ так же используют моноклональные антитела [33, 75, 219]. В этом случае конъюгат производится из смеси двух или более меченых моноклональных антител, распознающих различные эпитопы РНП ВБ. Хотя поликлональные иммунные сыворотки могут содержать посторонние антитела, при использовании моноклональных антител существует риск чрезмерной специфичности со слабым сродством к некоторым вариантам вируса [189]. Срок постановки РИФ составляет около двух часов, что дает ему значительные преимущества перед другими диагностическими методами [61, 62].

Выделение вируса. Наиболее распространенными подтверждающими РИФ тестами является выделение вируса в организме животных и в клеточных культурах.

Биопроба на мышах [217] является чувствительным и надежным методом [194]. Кусочки из различных отделов головного мозга перетирают и переносят в буферный раствор с добавлением антибиотиков. Далее супернатант, полученный после центрифугирования, вводят интрацеребрально белым мышам весом 6-8 г и следят за появлением у них клинических признаков бешенства в течение 30 дней.

Гибель мышей в первые 48 часов после заражения считается неспецифической [118]. Для подтверждения наличия ВБ у погибших мышей требуется постановка РИФ. К достоинствам данного метода относятся его техническая простота и чувствительность, приближающаяся к 100%. Его главный недостаток, помимо экологических и этических вопросов, связан с длительным использованием живых животных в лабораторных условиях. Обычно признаки инфекции проявляются у мышей на 7-20 день. Продолжительность постановки метода можно сократить путем ежедневного убоя мышей, начиная с пятого дня после заражения, и исследования их мозга в РИФ на наличие в нем вируса. Однако этот способ потребует большего количества мышей на одну пробу и увеличит затратность и трудоемкость метода.

Выделение в культуре клеток. Количество затрачиваемого времени при выделении вируса в культуре клеток, по сравнению с биопробой на мышах, существенно сокращается. Супернатант суспензии ткани головного мозга смешивают с суспензией клеток. Далее одну часть полученной смеси помещают в пластиковый культуральный матрас, другую распределяют по лункам полистиролового культурального планшета. Либо супернатант переносят на клетки уже готового монослоя. Для проведения исследования, как правило, выбирают культуру клеток мышиной нейробластомы [174]. Клетки инкубируют в течение нескольких дней, после чего их исследуют на наличие ВБ с использованием РИФ. Чувствительность данного теста сравнима с биопробой на мышах [175, 218]. В связи с тем, что результаты могут быть получены всего за несколько дней [57], в случаях с покусами людей и отрицательным результатом в РИФ, выделение вируса в культуре клеток имеет гораздо большее практическое значение, чем биопроба на мышах [177]. Однако в некоторых случаях необходимо проведение второго и третьего пассажа, поэтому выделение вируса может занять до двух недель [218].

Хотя быстрота постановки и Иммуноферментный анализ.

чувствительность РИФ сделали его основным методом диагностики бешенства, другие методы выявления антигенов также находят своё применение. Одним из таких методов является ИФА, который в последние годы успешно заменяет многие традиционные методы диагностики вирусных инфекций животных и людей. Данный метод отличается экспрессностью и простотой выполнения.

Используется ИФА в прямом и непрямом сэндвич-вариантах.

Постановка прямого сэндвич-варианта ИФА заключается в предварительной сенсибилизации лунок планшета антирабическим иммуноглобулином. Затем планшет промывают, в лунки добавляют контрольные образцы и исследуемые пробы, инкубируют при 37°С. Содержимое лунок удаляют, наносят антирабический пероксидазный коньюгат и после инкубирования и промывки визуализируют реакцию внесением хромогенного субстрата. Учитывают реакцию с помощью мультиканального автоматического спектрофотометра или визуально [47, 151].

Непрямой сэндвич-вариант ИФА отличается от прямого использованием антивидового конъюгата, который специфически соединяется с иммуноглобулинами определенного вида животного. После нанесения проб и промывки, в лунки вносят вторые антарабические антитела, инкубируют и промывают. Затем вносят антивидовой конъюгат, специфичный к антителам того вида животного, которому принадлежат вторые антитела. Первые и вторые антирабические антитела должны принадлежать разным видам животных [15].

Метод ИФА более чувствителен по сравнению с РИФ при исследовании плохо сохранившихся образцов (разложившейся ткани головного мозга), но уступает ему в чувствительности при исследовании материала хорошего качества [157]. Данный метод позволяет быстро исследовать большое количество проб, вследствие чего подходит для проведения мониторинга бешенства [47]. К достоинствам метода можно также отнести однозначность в интерпритации результатов, возможность использования, как автоматического чтения, так и визуальной оценки результатов, что делает его подходящим для применения в недостаточно оснащенных лабораториях.

Возможно повышение чувствительности метода за счет авидинбиотинового усиления [47], а также использования моноклональных антител.

ИФА с использованием авидин-биотинового усиления показывает хорошую чувствительность и специфичность при исследовании мозговой ткани подозреваемых на бешенство животных, но дает плохие результаты при исследовании слюны подозреваемого на бешенство человека [166].

На основе ИФА разработан метод количественного определения ВБ путем детекции РНП вируса. При этом результаты метода коррелируют с результатами определения инфекционности ВБ в культуре клеток [26]. Разработан также сэндвич вариант ИФА для определения активности антирабических вакцин, предназначенных для ветеринарного использования [207].

Полимеразная цепная реакция. Диагностические методы, нацеленные на обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот возбудителя, разработаны сравнительно недавно. Для многих инфекционных заболеваний молекулярные методы диагностики, быстро вытесняют более традиционные методы, которые направлены на выявление вирусных белков. Показана возможность использования ПЦР для детекции различных фрагментов РНК ВБ, выделенного от различных видов животных [24].

Однако молекулярные методы имеют ряд недостатков. Изменения ВБ, происходящие на уровне генома значительно больше, чем на уровне белка, за счет вырожденности генетического кода [46, 152]. Следовательно, при исследовании молекулярными методами, которые обычно полагаются на гибридизацию относительно коротких отрезков нуклеиновых кислот на РНК-мишени, вероятность не обнаружить вирус, присутствующий в образце, увеличивается в сравнении с методами, основанными на соединении по принципу антигенантитело, таких как РИФ и выделение вируса (на мышах или в культуре клеток).

Эпитопы к антителам, скорее всего, будут сохраняться независимо от изменений в нуклеотидной последовательности. Поэтому при использовании ПЦР для диагностики бешенства необходимо подобрать праймеры на наиболее стабильные участки генома. Кроме того, молекулярные методы, как правило, требуют больше времени и их использование обходится дороже, чем РИФ. Экспресс метод ПЦР позволяет диагностировать бешенство в течение 10 часов с момента поступления проб на анализ [97, 141].

Положительные стороны молекулярных методов в их высокой чувствительности. Однако высокая чувствительность может привести к ложноположительным результатам из-за перекрестной контаминации образцов, которая возникает при проведении ПЦР с нарушением требований, предъявляемых к анализу [120]. ПЦР позволяет не только диагностировать бешенство, но и проводить штаммовую дифференцировку [7, 201]. Это позволяет сделать вывод о принадлежности данного вируса к вакцинному штамму или полевому изоляту.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.