WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 |

««Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатич ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

АЛИМОВА ФАРИДА КАШИФОВНА

«Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma

(Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании

микробиоты и защите растений в агроценозах различных

почвенно - климатических зон на территории Республики

Татарстан»

03.00.07 - микробиология

06.01.11 - защита растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени



доктора биологических наук

КАЗАНЬ 2006

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и биохимии Казанского государственного университета

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор А.Х. Яппаров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Умаров М.М.

доктор биологических наук Госманов Р.Г.

доктор биологических наук Джалилов Ф.С.

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уро РАН, г.Пермь

Защита состоится 22 июня 2006 г. в 1300 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.081.085. в Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета Автореферат разослан «_22_» _мая_2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук З.И.Абрамова Актуальность работы. В современных условиях ведения земледелия особую актуальность приобретают две проблемы. Это постоянно растущие затраты на производственную продукцию, вызванные применением традиционных многооперационных технологий возделывания сельскохозяйственных культур, постоянным и значительным повышением цен на энергоносители, сельскохозяйственную технику, минеральные удобрения, средства защиты растений и другие виды промышленной продукции. Вторая проблема связана с потерей плодородных почвенных ресурсов, снижением видового разнообразия микроорганизмов и ухудшением экологической и фитосанитарной обстановки окружающей среды. В настоящее время идет быстрое и повсеместное сокращение площадей с естественной растительностью. В то же время известно, что только природные комплексы с условно коренной растительностью способны поддерживать состояние среды на приемлемом для жизни уровне.

В связи с этим особый интерес при экологических исследованиях представляют ненарушенные леса, расположенные на территории заповедников, которые могут служить эталоном природных ландшафтов со всем видовым разнообразием, населяющих их организмов, а также почвы не затронутые.

Территория Республики Татарстан, в настоящее время имеет около 19% территории, покрытой сильно нарушенными лесными природными системами. Исключение составляют отдельные хорошо сохранившиеся хвойные участки леса Раифского лесничества Волжско-Камского заповедника Национального парка «Нижняя Кама». Лесопитомники, используемые для восстановления лесов, характеризуются резким ухудшением агрохимических характеристик. В результате этого, почти пятая часть всходов и сеянцев ежегодно погибает от болезней, а в отдельные годы отмечалась даже стопроцентная гибель сеянцев.

Современные технологии обеспечивают последовательную замену энергоемких минеральных удобрений и пестицидов биопрепаратами нового поколения, разработанными отечественными микробиологами, и препаратами, производимыми отечественными биологическими фабриками.

В современных процессах используется микробиологический мониторинг почвенных угодий с целью своевременной оценки ухудшения экологической ситуации, безопасных технологий для сельскохозяйственной промышленности.

Одним из наиболее перспективных видов микроорганизмов для внедрения ресурсосберегающих технологий в сельское хозяйство являются грибы рода Trichoderma, которые представляют собой наиболее изучаемые грибы в настоящее время. Представителей рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере, частично ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и микотоксинов, выделяющихся в окружающую среду.

Возможно, что Trichoderma - это единственный род грибов, для которого каждый вид представлен в GeneBank NCBI, по крайней мере, одним геном, и многие виды представлены последовательностью двух или более генов. В целом, в Банке генов хранится информация о 427 видах Hypocrea (телеоморф) и о 110 видах Trichoderma. Согласно последним данным, более 40% видов, представленных в GeneBank NCBI, (44 названия) являются синонимами или идентифицированы неверно.





Причиной возрастающего интереса к Trichoderma является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленностях, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу и глюкозу, для получения кормовых добавок и в текстильной промышленности. На основе антибиотиков, токсинов и ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений и получения трансгенных растений. Trichoderma также используется для биологической очистки почвы и для получения биокомпостов.

В рамках данного вопроса исследования биоразнообразия определяются как зондирование перспективности использования определенных природных источников с коммерческой целью. Именно такой подход определил разработку международной «Конвенции по биологическому разнообразию» в качестве законодательства по использованию ценных генетических ресурсов.

В настоящее время перед микологами, изучающими Trichoderma, стоит ряд вопросов: по систематическому положению вида, адекватным методам идентификации, по построению естественного филогенетического древа, географической распространенности, разнообразию и выявлению способности к антагонистической активности к фитопатогенам среди всех видов данного рода, по наличию в природе новых видов, в том числе промышленно значимых.

В связи с вышесказанным представляет большой практический интерес анализ распространенности и сохранения видового разнообразия грибов рода Trichoderma на территории Республики Татарстан и их роли в биогеоценозе и антропогенных ландшафтах, а также возможности использования в сельскохозяйственной промышленности.

Целью настоящего исследования явилась оценка биоразнообразия, динамики численности и характеристик структуры популяций Trichoderma в современных почвенных и антропогенных ландшафтах, в эталонных зонах (погребенных и заповедных) на территории РТ, а также выявление основных закономерностей изменения микробиологической активности агроценозов под влиянием антропогенных факторов и роль в этих процессах интродукции штаммов Trichoderma.

Задачи исследования

1. Исследование распространения грибов рода Trichoderma и идентификация аборигенных штаммов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан с использованием морфологических, кинетических и молекулярно-генетических методов.

2. Исследование стратегии жизни, внутривидовой и популяционной гетерогенности местных штаммов Trichoderma, выделенных из различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан.

3. Исследование биохимических свойств штаммов видов Trichoderma: фитотоксичности культуральных жидкостей и некоторых ферментов гидролазного комплекса.

4. Оценка степени влияния различных экологических параметров на выживаемость штаммов Trichoderma.

5. Изучение взаимоотношения штаммов Trichoderma с растениями, фитопатогенными и сапротрофными почвенными микроорганизмами.

6. Отбор стабильных штаммов – продуцентов биопрепаратов по культурально – морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам, взаимодействию с регуляторами роста и бактериями.

7. Оценка биологической активности различных почвенноклиматических зон Республики Татарстан по данным микробиологического мониторинга. Изучение влияния антропогенных факторов и биоудобрений с активными штаммами Trichoderma на микробиологическую активность почв Республики Татарстан.

8. Разработка способов применения местных штаммов Trichoderma в промышленности Республики Татарстан с целью получения кормовых добавок (ксиланазы Trichoderma) для животноводства, переработки растительных, животноводческих, а также городских отходов с целью получения биоудобрений, и для получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые определен видовой состав и географическое распространение грибов рода Trichoderma на территории РТ.

Выделены типичные и случайные виды Trichoderma в современных, погребенных и затопляемых почвах. По данным молекулярно-генетического анализа выделены новые виды Trichoderma из погребенных почв и могильников на территории РТ. Установлена гетерогенность природных популяций Trichoderma и их структура. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов (например, из погребенных почв выделены виды перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз). Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений.

Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии.

Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля применения биофунгицидов и биоудобрений. Впервые изучена эколого-биологическая значимость видов рода Trichoderma в почвенной биоте. Выявлена роль Trichoderma в регуляции супрессивности почв на территории Республики Татарстан. Описана структура популяций Trichoderma при взаимоотношении с растениями.

Установлено, что доля фитотоксических видов зависит от типа стадии сукцессии и типа экологической ниши. Описан комплекс видов фитопатогенных микромицетов, вызывающих поражение сеянцев хвойных, овощных и зерновых культур. Впервые выявлены местные изоляты Trichoderma с высокой антагонистической активностью в отношении почвообитающих патогенных микромицетов и семенных инфекций. Разработаны оптимальные условия культивирования активных штаммов в различных биотехнологических системах и получен биопрепарат новой формы на основе микромицетно – бактериального сообщества с использованием природных регуляторов и промышленных и сельскохозяйственных отходов.

Впервые показана целесообразность использования биопестицида на основе Trichoderma в ограничении численности возбудителей инфекционных заболеваний яровых и озимых зерновых культур, а также и сеянцев сосны на территории Республики Татарстан. Впервые с позиций системного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных микробиологических и биохимических параметров различных природных - климатических зон на территории Республики Татарстан. Показано, что введение в агроэкосистему определенных видов и различных сочетаний удобрений, известкования и сочетания удобрений с известкованием, а также биоудобрений оказывает положительное фитотерапевтическое действие на растения и влияет на уровень супрессивности и плодородие почв. Установлены закономерности биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichodermа. Впервые проведено исследование влияния рН и температуры, соответствующих параметрам желудка моногастричных сельскохозяйственных животных, а также воздействия гидротермической обработки на активность ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma.

Основные защищаемые положения:

1. Запасы жизнеспособных пропагул Trichoderma изменяются в зависимости от расположения в почвенном профиле, от затопляемости почв, антропогенной нагрузки.

2. Распространение, морфологические, молекулярно-генетические, кинетические характеристики и экологические стратегии штаммов рода Trichoderma зависят от типа экологических ниш и почв.

3. Смена популяций штаммов Trichoderma с различной стратегией жизни зависит от стадий сукцессии экологической ниши.

4. Микробиологическая активность, биотический потенциал фитопатогенных грибов в агроценозах изменяются в широком диапазоне в зависимости от типа почвы, биологической активности, окультуренности, внесения удобрений, мелиорантов и фитосанитарного состояния культур в севообороте.

5. Минеральные, органические удобрения и известкование почвы оказывают разнонаправленное действие на биологическую активность и супрессивность агроценозов.

6. Отдельные изоляты рода Trichoderma могут использоваться для восстановления плодородия почв в виде биокомпостов на основе осадков сточных вод крупного промышленного города, отходов пищевых предприятий и сельскохозяйственных производств, а также для получения биопестицидов, биогербицидов для защиты растений от заболеваний, с целью восстановления супрессивности и регуляции биологической активности почв.

7. Стабильность культурально – морфологических признаков Trichoderma является критерием отбора антагонистов.

Практическая значимость работы. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma, теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов. Например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз. Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и биоудобрений. Предложен комплекс методов для проведения микробиологического мониторинга, адекватно отражающего состояние биоты и позволяющего прогнозировать возможные эпифитотии.

Предложены способы получения биокомпостов на основе осадков сточных вод, отходов пищевых и сельскохозяйственных производств с использованием штаммов Trichoderma с высокой гидролазной, фунгицидной и гербицидной активностями с целью внедрения препаратов в практику лесного и сельского хозяйств Республики Татарстан для восстановления плодородия и супрессивности почв. Разработана технология получения биопестицида на основе отходов пищевых предприятий, которая была внедрена в практику производства биопрепаратов на базе биозавода на территории совхоза «Казанский тепличный». Показана возможность использования гидролазного комплекса Trichoderma для переработки отходов спиртовой промышленности в РТ. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз Trichoderma, что позволило правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащие пентозаны. Результаты исследований используются для подготовки лекций на биолого - почвенном факультете КГУ по курсам «Биология почв», «Сельскохозяйственная микробиология», «Экология микроорганизмов», «Микология», «Почвенная микробиология».

Монография «Микробная биотехнология» Изд-во Казань УНИПРЕСС 2006г.

рекомендована для обучения студентов и аспирантов биолого – почвенного факультета КГУ.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзн. Конф. «Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных». - Ташкент. – 1989, Всесоюзн. Совещ.: Нуклеазы микроорганизмов и их практическое применение // Рига. – 1989, Всесоюзн.

Конф.: Методы получения, анализа и применения ферментов. - Рига. - 1990. -, 5 Междунар. Симп. Молодых Ученых. - Болгария, Варна. - 1990., Научн.

Конфер. // Днепропетровск. - 1991., Всесоюз. Симпозиуме: Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия. - Оренбург. – 1991, Всесоюзной Конфер. «Экологические проблемы фармакологии и токсикологии». - Москва. – 1991, Раб. Совещ.: Регуляторы роста и развития растений. - Москва. – 1991,.5-ой Всероссийск. Конфер.: Новые направления в биотехнологии. - Пущино. – 1990, Всесоюз. Конфер.: Ферменты микроорганизмов. - Казань. – 1991, Всесоюзн. Конфер.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. - Пущино. - 1992., Научн. Конфер.: Эволюция почв и почвенного покрова в связи с изменением природной среды // Пущино. – 1992, 6-ой Всероссийской Конфер.: Новые направления биотехнологии. Пущино. – 1994, Конф.: Физиология и биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии. - М. - 1994., Конфер.: Генетика народному хозяйству. - Москва. – 1994, Всесоюзная конфер.: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. - М. – 1994, Forum for applied biotechnology. - Brugge. – 1995, Advanced Biotechnologies and Agriculture. Ferrary-Itali. – 1995, 7th international symposium. - Santos-Brazil. – 1995, III Международн. Конфер.: Регуляторы роста и развития растений. - М. – 1995, Intern. Co-Conf. On ICEP95-ICONE95. - St.Peterburg, Russia. - 1995, Материалы 3-й международной коференции по химии нефти. - Томск. – 1997, 3-й Республ. Научн. Конфер.: Актуальные экологические проблемы районов Татарстана. - Казань. – 1997, 3-й Научно-практич. Конфер.: Достижения и перспективы развития селекции семеноводства сельскохозяйственных культур. - Пенза. – 1999, Всероссийской Научной Конфер.: Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья. - Саранск. – 1999, 9th International Congress of Mycology. - Sydney. – 1999, YI-th International Simposium: In suti and onside biorenudiation. - San-Diego, California. – 1999, Междунар. Научн. Конфер.

Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов русской равнины:

- Пенза. – 1999, X-th International Soil Conservation Organisation Conferens. – 1999, Научной конфер.: Новочеркасск. – 2000, Всероссийской научно-практич. Конфер.: Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий. Ульяновск. – 2000, Всероссийской конференции «сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках» 14-19 июня 2001г, 1-ом Съезде микологов России «Современная микология в России» М., 2002, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. 7-ая международная конференция Санкт- Петербург 15-18 сент 2003, «8-ой, 9-ой Пущинской школах-конференциях молодых ученых. Биология - наука XXI века. 17-21 мая 2004, 2005,2006». Пущино, 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,СанктПетербург – Репино, 15-18 сентября 2003г.,Научно- практическая конференции «Биотехнологии - на поля Татарстана». ОАО "Казанская ярмарка", Казань-2004, Международной научной конференции авг. 25 – сент.

5, 2003, 13-ая международная конференция «Ферменты микроорганизмов:

структура, функция, применение». Казань: КГУ, 2005, Международной научно- практической конференции «Перспективы и проблемы развития битехнологии в рамках единого экологического пространства стран содружества» 25-28мая, 2005, Минск-Нарочь, Республика Белорусь, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 17-18 июня 2004, Втором съезде Общества биотехнологов: Москва, 13-15 октября 2004, Межд. научно-практ. конф. по развитию сотрудничества между Республикой Татарстан и Германией в рамках Президентской программы "Дни Германии в Татарстане и перспективы развития экологического сельского хозяйства и природопользования в Республике Татарстан". 5-6 ноября 2004, Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» 28 - 29 ноября, 2005, XX Congreso Nacional Microbiologa Cceres, Espaa. 19 – 22 septiembre 2005 Ponencias y Comunicaciones “Universidad de Extremadura” Sociedad Espaola de Microbiologa, Symposium of Biology Students in Europe" Finland 2005 University of Helsinki Department of Biology July 29th to August 7th 2005, Межд. Конф «Грибы и водоросли в биогеоценозах- Москва МГУ., 31янв. - 3 февраля 2006, 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium.

Загрузка...

Vienna, Aistria, 5-8 Аpril 2006.

Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 90 научных работ, в том числе 1 коллективная и 2 авторские монографии, 68 научных статей, 15 учебных пособий и методических руководств. Получено 4 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ____ стр.

компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, включающих ____разделов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 235 наименований (из них 159 на иностранных языках) и приложения. Работа содержит 20 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками и 15 фотографиями.

Личный вклад автора. Основная работа по получению экспериментального материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов из тепличного грунта совхоза «Майский», фитоэкспертизе семян зерновых, испытаниях в тепличных грунтах принимали участие доцент кафедры микробиологии Захарова Н.Г. и старший инженер кафедры микробиологии Мочалова Н.К. В организации полевых исследований на базе ТатНИИСХ и ГУ «Татарский НИИ агрохимии и почвоведения РАСХН», принимали участие д.с.х. наук Шакиров Р.С., д.с.х.н. Яппаров А.Х., зав. лаб. к.с.х.н.

Ломако Е.И. Молекулярно-генетические исследования проводились при активной помощи доц. кафедры биохимии Аскаровой А.Н. и сотрудника Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А., хроматографические исследования по азотфиксации и респираторной активности почв проводилось с помощью вед.н.с Гарусова А.В., консультации по методам анализа видов Trichoderma и гетерогенности популяций получены на кафедре микологии и альгологии МГУ у зав.каф.

д.б.н. Дьякова Ю.Т., д.б.н. Лихачева А.В., к.б.н. Александровой А.В., микрофотосъемки конидий были сделаны с помощью д.б.н. Камзолкиной О.В., консультации по методам микологического анализа антропогенных ландшафтов были получены у д.б.н. поф. Марфениной О.Е., участие микроорганизмов в силосовании кормов исследовалось при участии к.б.н.

Вершининой В.И., полевые испытания биоудобрений на основе компостов на основе отходов очистных сооружений г. Казани и Trichoderma для применения под сеянцы сосны проводили на базе лесопитомника Матюшинский при участии д.с.х..н. проф.Ведерникова Н.М., д.б.н., проф.

Селивановской С.Ю., пробы из зон контакта площадей питания Pinus sylvectris L. Раифского заповедника получены от нач. отдела Росприроднадзора России к.б.н. Морозкина А.И., к.б.н.Каримуллиной С.Н., почвенные образцы из древних поселений получены с помощью доц. каф.

почвоведения и агрохимии КГУ Мельникова Л.В., образцы черепов из древних захоронений и описания к ним получены с помощью сотрудников ин-та истории им. Марджани АНРТ Газимзянова И.Р.,Чижевского А.А., к.б.н., конструирование праймеров и программные модели для морфологической и молекулярно – генетической идентификации Trichoderma сделаны при участии преп. каф. биохимии к.б.н. Акберовой Н.И. и аспиранта каф. генетики Тарасова Д.С.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Идентификация и филогения грибов – второй по численности видов группы организмов после насекомых – представляет неразрешенную проблему. Причиной такого положения является относительная бедность таксономических (морфофизиологических) признаков и их значительная внутривидовая изменчивость. Грибы, благодаря особенностям их жизненных циклов, и чередованию полового и бесполого способов размножения с частым превалированием последнего, представляют собой быстро эволюционирующую группу организмов. Поэтому большая их часть, повидимому, представляет не обособленные «значимые» виды, а дивергентные видовые комплексы, идентификация которых в принципе затруднена из-за сложности вычленения таксономически достоверных признаков. Кроме того, как показали молекулярно-генетические исследования последних лет, видовое разнообразие грибов и других микроорганизмов гораздо богаче, чем было принято считать.

Доминирование грибов Trichoderma в микробоценозах связано с реализацией в экосистемах различных типов гетеротрофного и биотрофного взаимодействий с микробиотой и макробиотой (путем паразитизма и даже оппортунистического эндофитизма, и способностью разрушать органический материал и сохранение супрессивности почв). Использование видов Trichoderma в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней и вредителей - началось в 1980 – х годах. Однако в результате неточной идентификации отдельных видов исследователи на практике столкнулись с некоторыми проблемами. Так, в 1980 – х годах была впервые отмечена эпидемия шампиньонов («зеленая плесень»), вызванная видом Trichoderma, идентичным по морфологическим признакам Trichoderma harzianum, который широко использовался в защите растений. Наблюдаемое явление могло вызвать дискредитацию вида Trichoderma, как перспективного антагониста фитопатогенов для сельского хозяйства. В результате микологи вынуждены были вновь пересмотреть систему описаний рода Trichoderma.

Благодаря использованию молекулярно-генетических методов был обнаружен новый вид, морфологически сходный с Trichoderma harzianum, идентифицированный как возбудитель «зеленой плесени» шампиньонов T.aggressivum. Известно, что Банк NCBI Taxonomy содержит названия всех организмов, для которых установлен и помещен в генетические базы данных хотя бы сиквенс гена одного белка.

С момента первого описания этого рода в 1794 г по 1969 г было дано морфологическое описание 8 агрегатов рода Trichoderma, за последующие 20 лет (к 1991 г) число описанных видов возросло до 27. В эру молекулярногенетического анализа наблюдается критический пересмотр старой систематики Trichoderma, основанной на морфологических критериях. С помощью различных молекулярно-генетических методов, таких как неспецифичный ПЦР анализ с использованием праймеров к рибосомным ITS 1 и 2 сиквенсам, были идентифицированы ранее не определенные виды и были построены новые филогенетические древа. В результате количество видов Trichoderma к 2002 г возросло до 46. Мультигенный филогенетический анализ позволили выявить 88 видов Trichoderma к 2005 г. С помощью компьютерной программы Barcode к началу 2006 г. определено 110 видов.

Предполагается, что в ближайшие годы количество видов Trichoderma может достигнуть 130 и более. В настоящее время исследования рода Trichoderma идут параллельно по 3 направлениям: (а) биоразнообразие и распространение в различных регионах биосферы, (б) скрининг видов, перспективных для биотехнологии из новых выделенных и описанных изолятов Trichoderma, и (в) разработка методологии быстрой и правильной идентификации и построения филогенетического древа рода Trichodema /Hypocrea.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Образцы почвы (табл. 1) отобраны в соответствии с правилами отбора проб для микробиологического анализа (Методы …, 1991).

–  –  –

Морфолого-культуральные свойства изучали на минеральной среде (Samuel, 1989), картофельно-глюкозном агаре (PDA), среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы, специальном питательном агаре (SNA) (по Samuels et al., 1998). Для выращивания использовали как твёрдые (агаризованные), так и жидкие среды.

Идентификация по морфологическим признакам проводилась по ключу Александровой (Александрова с соавт., 2001), Samuels (2003) и Chaverri (Chaverri et al., 2003).

Идентификация по кинетическим признакам проводилась по ключу Chaverri (2004).

Размеры объектов замеряли с помощью окуляр–микрометра, так же с помощью программы Paint.

Определение цвета колонии, что необходимо для описания изолятов проводили двумя способами. С помощью шкалы Бондарцева (1959) и с помощью модели RGB. Модель RGB описывает излучаемые цвета и основана на трех базовых цветах - Red (Красный), Green (Зеленый), Blue (Синий). Остальные цвета образуются при смешивании этих трех основных.

Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали сращиванием от двух до восьми колоний на чашках Петри на среде картофельно-глюкозный агар, с последующим визуальным наблюдением за поведением колонии и микроскопированием пограничной зоны между колониями, что позволило наблюдать за анастомозами и оценить относительную частоту их образования. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании сравнивали с описаниями, приведенными у Дьякова и Долговой (1995).

Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на среде Чапека, КГА (Семонян и Мамиконян, 1982).

Гетерогенность популяций выделенных изолятов оценивали по их разделению на культурально-морфологические типы (КМТ) и появлению секторов при росте на чашках Петри (Дьяков, 1998).

Определение ксиланазной, протеазной и целлюлазной активностей изолятов Trichoderma проводили по Konig (2002).

Активность азотфиксация в почве измеряли «ацетиленовым»

методом (Методы…, 1991; Гарусов А. В., 1998).

Определение активности почвенного дыхания осуществляли на газовом хроматографе (Ананьева Н. Д. и др., 1997; Гарусов А. В., 1998).

Дегидрогеназную активность почвы определяли методом Ленарда в модификации Колешко (Колешко, 1981).

Для определения уреазной активности почвы использовали метод Галстяна (Галстян, 1974).

Определение интенсивности разложения целлюлозы в почве определяли методом Звягинцева (Методы …, 1991).

Протеолитическую активность почвы определяли методом Галстяна и Арутюняна (Колешко, 1981).

Определение каталазной активности почвы определяли методом Звягинцева (Методы …, 1991).

Измерение углерода микробной биомассы проводили экстракционнофумигационным методом (ISO 14240-2, 1997).

Определение численности микроорганизмов в почве проводили методом прямого счета в люминесцентном микроскопе по Звягинцеву и Кожевину (Головченко и др., 1995; Кожевин, 1989; Методы …, 1991).

Количественный учет грибов проводился методом Хансена в модификации Мирчинк (1988).

Определение фитотоксичности почвы и КЖ проводили на семенах растений (Методы …, 1991).

Выделение ДНК, ПЦР-анализ. ДНК было выделено из свежего мицелия фенол/хлороформным методом, включающим лизис клеток, с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от белков, нуклеаз с использованием органических растворителей (Druzhinina et al, 2005). Участок ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген 5,8S рРНК, был амплифицирован в реакции ПЦР с использованием комбинации праймеров Ф4 (5’-TCT GAG CCT TCT CGG CGC CT-3’) и A5 (5’-GCG CAG GAA AGG CTG CGG CG-3’), а участок, содержащий ген эндоглюконазы, - с праймерами Ф2 (5’-GGC AAG ACA TGA CAA GT-3’) и A3 (5’-ACA TTG GAG AGT GCG AAG C-3’).

Также для проведения ПЦР были использованы следующие праймеры:

ПР1 – 5’-GAG GTG GNG GNT CT-3’ – неспецифический праймер, консенсусная последовательность белка III фага М13; ПР2 – 5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’ – стандартный прямой праймер фага М13; ПР3-5’ – GGC AAG ACA TGA CAA GT-3’ – неспецифическая последовательность.

Для проведения ПЦР и секвенирования по последовательностям ITS 1 и 2 были использованы праймеры forward SR6R 5’-AAG TAG AAG TCG TAA CAA GG-3’ и reverse LR1 5’-GGT TGG TTT CTT TTC CT-3’.

Режимы ПЦР - амплификации: а) денатурация ДНК - 950С; 1 мин,

б) отжиг праймеров - 540С; 1,5 мин, в) элонгация - 720С; 1 мин.

Результаты ПЦР оценивались в агарозном и полиакриламидном (ПААГ) гелях различной концентрации.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан При исследовании распространения Trichoderma нами использовались зональный, морфологический, таксономический и экологический подходы.

Изучение взаимоотношений Trichoderma с растениями рассматривалось с позиций ярусного и консортивного подходов.

Незатронутые деятельностью человека и являющиеся резервуарами сохранения видового разнообразия почвы рассматривались как эталонные по отношению к антропогенным ландшафтам. В качестве эталонов были отобраны почвы из древнего захоронения (Мурзихинский II могильник), зоны археологических раскопок на территории древних поселений (БольшеКляринское городище), из Раифского заповедника Волжско-Камского биосферного резервата (статус, присвоенный президиумом Международного координационного совета МАБ ЮНЕСКО 29 июня 2005 г), который из-за особенностей рельефа представляет собой модель, имитирующую широтную зональность всей лесной полосы Европейской части России. В качестве альтернативного объекта былы отобраны образцы под Матюшинским лесопитомником с обедненной серой лесной почвой, почвы агроценозов под зерновыми культурами, защищенные грунты, нефтезагрязненные почвы, а также почвы вдоль автотрасс (табл. 2).

Нами было выделено свыше 700 изолятов Trichoderma из образцов почв и подстилок археологических раскопок, государственного Раифского заповедника, почв и агроценозов, антропогенных ландшафтов.

Применение консортивного подхода к изучению влияния растений и животных на распространение позволило выявить виды, ассоциированные с ризосферой, филлосферой и спермисферой, а также виды, ассоциированные с почвенными животными, и обитающие в экскрементах, а также транзитные формы из кишечника дождевых червей сем. Lumbricidae.

В результате исследований была отмечена высокая частота встречаемости (КОЕ/г почвы) изолятов Trichoderma в эталонных почвах и защищенных грунтах. Антропогенные ландшафты – агроценозы и почвы вдоль автотрасс, нефтезагрязненные почвы и нефтешламы характеризовались снижением популяционного уровня более, чем в 100 раз, снижением частоты встречаемости и видового разнообразия. Из комплекса исследованных антропогенных ландшафтов исключение составляли защищенные грунты в теплицах, что связано с ежегодной интродукцией популяций Trichoderma в составе с биофунгицидов, изготавливаемых на основе штаммов - антагонистов фитопатогенов.

Видовое разнообразие Trichoderma на территории Республики Татарстан При исследовании структуры микромицетного сообщества почв выявлено в разных климатических зонах на территории Республики Татарстан более 11 видов Trichoderma, идентифицированных морфологическими и молекулярно-генетическими методами. Для отдельных изолятов не обнаружено гомологичных сиквенсов, которые бы позволили их отнести хотя бы к одному из известных видов.

Идентификация по морфологическим признакам выделенных изолятов показала, что наиболее распространенным и часто встречающимся оказался вид T. koningii (161 изолят). На втором месте по распространенности стоит T.hamatum (100 изолятов), а на третьем –T.longibrachiatum (92 изолята).

Далее следуют T. harzianum (87 изолятов), T. asperellum (80 изолятов) и T.

citrinoviride (69 изолятов), T. atroviride (22 изолята), T.viride (12 изолятов) и T. oblongisporum (10 изолятов). Последний вид встречается немного реже, но все-таки его также можно считать обычным видом. Редко встречались виды T. saturnisporum (8 изолятов) и T. spirale (2 изолята (табл.3). Можно проследить некоторые закономерности распределения видов рода

–  –  –

T. koningii Oudemans et Koning T. asperellum Samuels, Lieckfelt et Nirenberg T. atroviride Karsten T. viride Pers.: Fr.

T. harzianum Rifai T. longibrachiatum Rifai T. citrinoviride Bissett T. spirale Bissett T. saturnisporum Hammill T. oblongisporum Bissett T.hamatum (Bon)Boner *Прохладная зона – Высокогорский, Лаишевский, Сабинский, Зеленодольский, Агрызский районы; **Умеренно-прохладная зона – Альметьевский, Тюлячинский районы; ***Теплая зона – Буинский район, тепличные субстраты; ****Умеренно-теплая зона – Алексеевский район Анализ исследуемых почв показал, что наибольшее разнообразие видов обнаружено в эталонных почвах и наименьшее – в антропогенных ландшафтах. Уменьшение видового разнообразия в антропогенных и современных ландшафтах отмечалось ранее и для других микроскопических грибов. Так, в эталонных почвах нами было выделено 11 видов и группа новых, неидентифицируемых по морфологическим признакам изолятов.

В антропогенных ландшафтах обнаружено среди типичных только 7 видов. Практически не обнаружились в агроценозах ни одной климатической зоны виды T. atroviride, T. spirale, T. citrinoviride, T.

saturnisporum, а также не представлена группа новых видов (табл. 5).

–  –  –

Морфологические и молекулярно-генетические исследования изолятов, выделенных на территории РТ Для анализа видовой принадлежности и внутривидовой изменчивости организмов (выявления клональной изменчивости в гетерогенных популяциях), как необходимое условие, требуется подбор соответственных универсальных праймеров как необходимого условия. Исходя из двух важных свойств UP PCR (неспецифический ПЦР или НП ПЦР) паттернов, видо- и праймероспецифичности на уровне ДНК, можно заключить, что НП ПЦР технология представляет собой удобный инструмент, позволяющий проводить строгую экспресс-идентификацию видов любых организмов. Для этого можно использовать универсальные праймеры. Вместе с тем, на основе широкого набора универсальных олигонуклеотидов, строго специфически праймирующих соответствующие локусы в геноме, появилась возможность детального изучения структуры генома отдельных организмов и генетической структуры популяций и видов любых организмов по локусам, ранее не подлежащих анализу. Выявляемые по ряду праймеров полиморфизмы (измененные по отдельным фрагментам ПЦР паттерны) могут быть использованы в качестве генетических маркеров клонов.

Использование НП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) стала возможной благодаря использованию произвольных или универсальных олигонуклеотидов, праймирующих ДНК любых геномов. Основным свойством амплифицированной с этим праймером ДНК оказалась видоспецифичность, т.е. сходство ПЦР паттернов организмов в пределах биологического вида. Вместе с тем, выяснилось, что некоторые виды организмов характеризуются весьма гетерогенными ПЦР паттернами независимо от используемых универсальных праймеров. Кроме того, обнаружилась разница в действии самих праймеров, часть которых на особях данного вида может давать сходные или идентичные ПЦР паттерны (вариабельные «праймеры). Первые известные попытки идентифицировать грибы методом ПЦР были предприняты с использованием праймеров, сконструированных на основе клонированных видоспецифичных ДНК последовательностей.

Для получения фингерпринтов изолятов Trichoderma, максимально отражающих видовые и внутривидовые различия. нами были взяты неспецифические, случайные, универсальные и специфические праймеры к гену, кодирующему эндоглюканазу, а также к ITS последовательностям участка гена рибосомальной ДНК. Исследование ДНК с помощью ПЦР анализа изолятов Trichoderma из древних захоронений выявило более 10 видов. На рис 2 представлены данные по идентификации отдельной группы видов, выделенных из могильников с использованием ITS праймеров (SR6R и LR1). Наибольшей частотой встречаемости характеризовались 3 вида: – H.

schweinitzii, T. longibrachiatum и T. asperellum.

Для исследования внутривидовой изменчивости нами был изучен феномен «консервативных» и «вариабельных» праймеров. ПЦР идентификация видов с использованием универсальных праймеров (НП ПЦР) позволяет путем сравнения ПЦР паттернов разных изолятов делать заключение об их родстве в рамках биологического вида. Однако, в связи с тем, что не все универсальные праймеры дают сходные или идентичные ПЦР паттерны в пределах биологического вида организма, возникают затруднения в таком сравнении.

Особенно это касается грибов, у которых НП ПЦР паттерны могут коррелировать с паттернами внутрипопуляционных клонов. Нами получены типичные спектры продуктов амплификации ДНК разных видов Trichoderma с использованием неспецифических праймеров. Основная зона распределения фрагментов располагается в диапазоне от 2 до 8000 п.н. и от 370 до 470 п.н.

Рис.2 Кластерная дендрограмма штаммов Trichoderma, построенная на основании сиквенсов ITS – областей с праймерами SR6R и LR1: 1700 – H. schweinitzii, 1701 – T.

longibrachiatum, 1701 – T. longibrachiatum, 1702 – H. schweinitzii, 1703 – H. schweinitzii, 1704 - unclear species identification, 1705 – H. schweinitzii, 1706 – H. schweinitzii, 1707 – T.

longibrachiatum, 1708 – H. schweinitzii, 1710 – T. asperellum, 1711 – T. asperellum, 1712 – T.

asperellum, 1713 – T. asperellum, 1714 – T. asperellum, 2127 – T. asperellum, 2128 – T.

asperellum.

Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов, относящихся к одному виду. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК девяти изучаемых популяций, колеблется от 6 до 14. Каждая популяция имеет специфический спектр ПЦР продуктов – фенотип, характеризующийся: 1) определенным количеством фрагментов; 2) их размерами и 3) степенью выраженности (мажорностью). Некоторые фрагменты являются общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, и выявляют, по-видимому, консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду T. harzianum. Число таких фрагментов составило от 3 до 4 в области 370, 470 и 1650 и 2500 п.н. Неспецифические праймеры, используемые нами, не дали маркерных специфических фрагментов, которые были бы характерны только для одной популяции. В большинстве случаев одни и те же полиморфные фрагменты присутствовали в спектрах продуктов ПЦР ДНК 2 или 3 популяций. Использование 3 праймеров позволило выявить большую гетерогенность среди исследуемых популяций особенно в области от 200 до 400 п.н. Сравнительное исследование клонов изолятов с различным типом взаимоотношения с фитопатогенными почвенными микроорганизмами и растениями не позволило выявить принципиальных различий за исключением фрагментов ДНК в области 470 п.н. Изолят с наибольшей конкурентоспособностью, антагонистической и фитотоксической активностями дальше всех стоит от других изученных изолятов.

Исследование праймеров по отношению их к консервативному или вариабельному типам на примере Trichoderma asperellum показало, что праймер 2 может быть охарактеризован, как «консервативный», так как он не различает взятые в анализ популяции гриба, а праймеры 1 и 3, как «вариабельные». Отмеченная вариабельность фрагментов ПЦР паттернов при использовании «вариабельных» праймеров, вероятно, связана с разницей между клонами гетерогенной популяции. Дальнейшие исследования изолятов подтвердили наблюдаемую нами разницу фингерпринтов с различной стратегией жизни. Исследуемые клоны отличались по скорости роста и конкурентоспособности. Таким образом, нами были подобраны «консервативный» праймер 2 для строго НП ПЦР видоидентификации и «вариабельные» праймеры 1, 2 - для клонов выделенных из гетерогенной популяции. Нами использовался также «консервативный» праймер, который был сконструирован Тарасовым и Акберовой на основании ДНК последовательностей гена эндоглюканазы Trichoderma harzianum, как наиболее широко распространенного и используемого вида в практике сельского хозяйства в качестве агента биозащиты. Сравнительный анализ фингерпринтов показал, что наибольшая гетерогенность ПЦР продуктов наблюдается при использовании праймеров к ITS («вариабельный») последовательности по сравнению с праймером к гену эндглюканазы. Праймер к гену эндоклюганазы можно отнести к «консервативному» типу, так как он не позволяет выявить клональную изменчивость. Специфичный праймер к гену эндоклюганазы был сконструирован на основании известных последовательностей, характерных для T.harzianum, так как, по мнению исследователей, это наиболее распространенный вид в почве и наиболее перспективный, как антагонист.

Молекулярно-генетические исследования опровергли это мнение. Изоляты, которые мы относили на основании морфологических анализов к T.harzianum, после ПЦР анализов с использованием специфичных ITS фрагментов ядерной рибосомной ДНК (внутренних транскрибируемых спейсеров) были отнесены к T. asperellum. Использование сконструированных праймеров к ITS последовательности позволили нам выявить новые виды внутри T.koningii-подобной группы, члены которой имеют сходные морфологические признаки, но различаются по данным ПЦР диагностики рис.3.

На микологическом сайте Самюэлем и Кубичеком с соавторами в середине 2006 года было опубликовано сообщение о том, что на основании молекулярно-генетического анализа с использованием праймеров к ITS локусам было доказано, что вид T.koningii является комплексом видов, сходных только по морфологическим признакам.

На рис. 3 видны полиморфизмы ПЦР продуктов изолятов, выделенных из защищенных грунтов и подстилки Раифского заповедника. Наблюдаемые различия по ITS локусу подтверждают различия на видовом уровне.

Рис. 3. ПЦР паттерны изолятов Trichoderma koningii с праймерами ITS 1 и 2. Дорожки 1маркер, 2-.+Т+А, 3-Т.150, 4 –Т.7, 5 – Т.1, 6 – Т.183, 7 – Т.65, 8 –Т.22, 9 –Т.4, 10 – Т.Gk р/ф, 11- Т.+Tr, «-» – контроль) Последующий ПЦР анализ с более чем 20 изолятами других экологических ниш из группы T.koningii подтвердил их генетическую гетерогенность. Таким образом, морфологическое сходство этой группы не было подтверждено ПЦР анализом. Дальнейшие исследования, проведенные нами с использованием праймеров к ITS последовательности, позволили переидентифицировать такие виды, как T.viride и отнести его из группы доминирующей в редкую, T. asperellum – в часто встречающуюся. Наши исследования подтверждаются последними исследованиями в систематике Trichoderma. Так, T. asperellum отнесен к группе наиболее распространенных в мире, тогда как «типичный» вид T. viride - относят к редким видам. В отдельных случаях мы получили подтверждение морфологической идентификации генетическими методами. Так, результаты сиквенирования ITS последовательности группы изолятов подтвердило принадлежность к виду T. longibrachiatum и T. citrinoviride. Также нами показано достоверное различие ПЦР паттернов изолятов T. spirale и T. longibrachiatum, подтверждающие принадлежность их к различным видам.

Построены дендрограммы, демонстрирующие сходства и различия ДНК паттернов изолятов, выделенных из заповедника, с использованием праймеров к ITS. Сходные фингерпринты T.koningii-подобных видов попали в первую группу (изоляты T.koningii Т.22, Т. 65, Т.183), а отличающиеся во вторую группу (Т.4 и Т.1). Изолят T. viride 6(з) повторно идентифицирован как T. аsperellum 6 (з). По данным электрофореза были построены древа родства (рис. 4). На бинарном древе изоляты разделяются на две группы. В первую группу входит два изолята (Т. 67 и Т. 60). Вторая группа разделяется на две основные ветви: в первой - штаммы заповедника (Т.11(з) и Т.65) и выделенные из ризосферы культур (К3риз. и Т.32 р/ф), во второй - штаммы заповедника (Т.35, Т.61, Т.62) и изоляты из тепличного хозяйства. Среди представленных штаммов К3риз. и Т.32 р/ф входят в одну группу, что свидетельствует о том, что изоляты, выделенные из ризосфер, имеют общее или близкое происхождение. По бинарному построению мы видим, что в одну группу по степени сходства ПЦР паттернов входят штаммы T.oblongisporum 11(з), T.koningii 65 и изоляты, выделенные из ризосферы растений K3риз и T.32р/ф). По-видимому, данные изоляты имеют общее или близкое происхождение. Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов при использовании праймеров к гену эндоглюканазы. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК 9 изучаемых популяций, колеблется от 10 до 14.

Некоторые фрагменты являлись общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, и выявляли, по-видимому, консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду T. harzianum.

Таким образом, нами выделены и повторно идентифицированы изоляты из эталонных и антропогенных ландшафтов. Были сконструированы «консервативные» и «вариабельные» праймеры, регистрирующие межвидовые и внутрипопуляционные изменения. Использование специальной программы Тарасова позволило определить вид Trichoderma asperellum, как наиболее распространенный и занимающий центральное положение среди изученных нами видов. С помощью молекулярногенетического подхода повторно идентифицирован ряд изолятов и уточнена их видовая принадлежность. Сиквенирование ITS последовательностей рибосомной ДНК изолятов, выделенных из эталонных почв, позволило выявить не только известные виды, но и новые, имеющие необычные сиквенсы.

По данным морфологического анализа изоляты Trichoderma из тепличного грунта в зависимости от сроков эксплуатации грунта и времени после высокотемпературной обработки попадают по частоте встречаемости в доминирующую или часто встречающуюся группу.



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«Миронов Андрей Викторович КОРРЕКЦИЯ АККОМОДАЦИОННЫХ НАРУШЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ ЗРИТЕЛЬНО-НАПРЯЖЕННОГО ТРУДА МЕТОДАМИ ФИЗИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 14.01.07 – глазные болезни 14.03.11 восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена на кафедре офтальмологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского»...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...»

«УСАЧЕВ ИВАН ИВАНОВИЧ Микробиоценоз кишечника, его оценка и контроль у овец, целенаправленное формирование у новорожденных ягнят 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Москва-2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», на кафедре терапии, хирургии, ветеринарного акушерства и...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Брянск 2014 Работа выполнена на кафедре экологии и рационального природопользования ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского» доктор сельскохозяйственных наук, профессор Научный...»

«РАГИМОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧ ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ПОЧВ В ФОРМИРОВАНИИ УРОВНЯ БЛАГОПОЛУЧИЯ НАСЕЛЕНИЯ ВЛАДИМИРСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность – 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре почвоведения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Владимирский государственный университет имени Александра...»

«Баскаев Константин Константинович РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОИСКА ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, в группе геномного анализа...»

«Аканина Дарья Сергеевна РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N1 03.02.02 – вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2014 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (РУДН) Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор...»

«Нгуен Тхи Тху Ха МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ ЛЕСНОГО ФОНДА ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ И ЦЕНТРАЛЬНОГО ВЬЕТНАМА 06.03.02 Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Использование недревесных ресурсов вносит существенный вклад в улучшение качества жизни населения многих стран, включая Россию и Вьетнам. До настоящего...»

«УДК: 574.5+(581.19:582.5) Митрукова Галина Геннадьевна КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ РДЕСТА ТУПОЛИСТНОГО (POTAMOGETON OBTUSIFOLIUS Mert. et Koch) И РОГОЛИСТНИКА ТЁМНО-ЗЕЛЁНОГО (CERATOPHYLLUM DEMERSUM L.) 03.02.08 экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург — 2015 Работа выполнена в лаборатории гидробиологии Федерального...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 эпидемиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки « Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Ющенко...»

«МЕЛЬЧЕНКО Александр Иванович МИГРАЦИЯ РАДИОНУКЛИДОВ В АГРОЭКОЦЕНОЗАХ В УСЛОВИЯХ ЛЕСОСТЕПНОЙ И СТЕПНОЙ ЧЕРНОЗЕМНОЙ БИОГЕОХИМИЧЕСКОЙ ЗОНЫ ЮГА РОССИИ Специальность 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Краснодар 2014 Работа выполнена в лаборатории радиационной и химической экологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической...»

«УЛАНОВСКАЯ ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА Биоморфологические особенности Hemerocallis hybrida hort. коллекции Никитского ботанического сада Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ялта – 2015 Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении Республики Крым «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад – Национальный научный центр» Научный руководитель доктор биологических наук, профессор...»

«НИКИТИНА МАРГАРИТА АЛЕКСАНДРОВНА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ОВАРИАЛЬНЫХ ДИСФУНКЦИЙ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПЛОДОВИТОСТИ У КОРОВ ПРИ ГИПОФУНКЦИИ ЯИЧНИКОВ 06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Саратов 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный аграрный...»

«Гривенная Елена Николаевна МОНИТОРИНГ КАЧЕСТВА ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В СИСТЕМЕ МВД РОССИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕЙТИНГОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Краснодар – 2015 Работа выполнена в ФГКОУ ВПО «Краснодарский университет Министерства внутренних дел Российской Федерации». Научный доктор педагогических наук, профессор консультант: Ганченко...»

«ГРИГОРЬЕВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА АГРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ЯБЛОНИ В НАСАЖДЕНИЯХ ЦЧР РФ Специальность 06.01.08 – плодоводство, виноградарство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора сельскохозяйственных наук Краснодар, 2015 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВО «Мичуринский государственный аграрный университет» Министерства сельского хозяйства РФ доктор сельскохозяйственных наук, профессор Научный консультант: Бобрович Лариса...»

«Работа выполнена в Институте биологии южных морей им. А.О. Ковалевского Научный руководитель: доктор биол....»

«ШНЫРЕВА Анастасия Андреевна ГРИБЫ РОДА PLEUROTUS: ГЕНОТИПИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ПОЛОВОЙ СОВМЕСТИМОСТИ 03.02.12 микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский...»

«ПЕРЕВОЛОЦКИЙ Александр Николаевич РАДИАЦИОННО-ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОБСТАНОВКА В ЛЕСНЫХ БИОГЕОЦЕНОЗАХ: ДИНАМИКА, ФАКТОРЫ, ПРОГНОЗ (НА ПРИМЕРЕ РЕГИОНА АВАРИИ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС) Специальность 03.01.01 – радиобиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Обнинск – 2013 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Российской академии...»

«РАДУГИНА Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – Биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Исследования в области регенерации, начавшиеся еще в XVIII веке, вновь приобрели актуальность с появлением современных методов исследования....»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.