WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |

«Фирстова Виктория Валерьевна ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ 14.03.09 – Клиническая ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека

Федеральное бюджетное учреждение наук

и

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

(ФБУН ГНЦ ПМБ)

На правах рукописи

Фирстова Виктория Валерьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ

ВЫБОРА СТРАТЕГИИ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО



ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

член-корр. РАН, д.м.н., проф. Караулов А.В.

Оболенск-2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Особенности формирования иммунного ответа к мироорганизмам F. tularensis

1.1.1. Особенности неспецифического иммунного ответа к бактериям F. tularensis

1.1.2. Гуморальное звено в формировании противотуляремийного иммунитета.. 26 1.1.3. Клеточное звено в формировании противотуляремийного иммунитета...... 28 1.1.4. Моделирование инфекционного и вакцинного процессов туляремии.......... 3 1.1.5. Оценка напряженности противотуляремийного иммунитета

1.1.6. Современные методы оценки противотуляремийного иммунитета.............. 36

1.2. Иммунологические аспекты чумы

1.2.1. Иммунопатогенез чумы

1.2.2. Особенности неспецифического иммунного ответа при чуме

1.2.3. Особенности формирования адаптивного иммунного ответа против Y. pestis

1.2.4. Современное состояние иммунопрофилактики чумы

1.2.5. Поиск маркеров, отражающих наличие протективого противочумного иммунитета

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ШТАММЫ

2.2. Среды и условия культивирования

2.3. Антигены микроорганизмов

2.4. Лабораторные животные

2.5. Схемы иммунизации животных

2.6. Выделение иммунокомпетентных клеток

2.6.1. Получение спленоцитов

2.6.2. Выделение лимфоцитарной массы на градиенте плотности

2.7. Стимуляция лимфоцитов

2.8. Цитометрический анализ

2.8.1. Окрашивание поверхностных маркеров

2.8.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов

2.8.3. Цитометрический анализ экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов

2.8.4. Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом цитофлюориметрии с использованием CFSE (карбоксифлуоресцеинсукцимидиловый эфир) красителя

2.8.5. СBA анализ

2.9. Определение титра антител к антигенам чумного микроба

2.10. Определение антител к антигенам F. tularensis

2.11. Определение напряженности иммунитета

2.12. Постановка реакции лейкоцитолиза с тулярином

2.13. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

2.14. Статистический анализ

Глава 3. ОЦЕНКА ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОГО КЛЕТОЧНОГО И

ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/с ПОСЛЕ

ИММУНИЗАЦИИ ПРЕПАРАТАМИ ПРОТИВ ТУЛЯРЕМИИ

3.1. Выявление антител к антигенам F. tularensis в сыворотке крови иммунизированных против туляремии мышей

3.2. Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis

3.3. Оценка клеточного противотуляремийного иммунитета по активации синтеза ИФН-, ФНО- и ИЛ-17 в ответ на рестимуляцию лимфоцитов in vitro тулярином и КНК F. tularensis 15 НИИЭГ

3.4. Изменение активности синтеза ИФН- и ФНО- лимфоцитами под влиянием антигенов F. tularensis

3.5. Оценка специфичности тулярина

3.6. Оценка специфичности КНК F.tularensis

3.7. Разработка методов in vitro для оценки эффективности иммунологической перестройки у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ

3.8. Оценка напряженности иммунитета к туляремии у мышей через разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ и показателями противотуляремийного иммунитета в системе in vitro

3.9. Выявление иммунологических маркеров, коррелирующих с защитой от заражения туляремией мышей, иммунизированных разными препаратами против туляремии





Обсуждение

Глава 4. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО

ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОГО ИММУНИТЕТА У ЛЮДЕЙ,

ВАКЦИНИРОВАННЫХ ЖИВОЙ ТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНОЙ.................. 121

4.1. Оценка гуморального противотуляремийного иммунитета

4.1.1. Выявление антител к антигенам F.tularensis в сыворотке крови людей..... 121 4.1.2. Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей

4.1.2.1. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов

4.1.2.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности лимфоцитов и моноцитов

4.1.2.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD86 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов

4.2. Оценка результатов реакции лейкоцитолиза с тулярином

4.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии поверхностных маркеров Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей, под влиянием тулярина

4.3.1. Сравнительная оценка изменений активации и численности CD45RO+ субпопуляции Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis

4.3.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 и HLA-DR рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов

4.3.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD107b и CD95 рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т-лимфоцитов

4.3.4. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD154, CD28 и CD25 рецептора на поверхности Т лимфоцитов

4.4. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов

4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации

4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов методом цитометрии. 139

4.5. Оценка эффекторной активности лимфоцитов

4.5.1. Оценка синтеза цитокинов лейкоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F.

tularensis в реакциях in vitro

4.5.2. Уровень синтеза ИФН- и ФНО- Т лимфоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro

Обсуждение

Глава 5. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У

МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/С ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ КОММЕРЧЕСКОЙ

ЖИВОЙ ИЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ЧУМНЫМИ ВАКЦИНАМИ........ 152

5.1. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-9 рецепторов на поверхности Тлимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V

5.2. Оценка перестройки маркера ранней активации CD69 на поверхности лимфоцитов под влиянием антигенов Y. pestis

5.3. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов мышей в ответ на активацию клеток антигенами чумного микроба

5.4. Изменение активности синтеза ИФН-, ФНО- и ИЛ-4 лимфоцитами под влиянием антигенов Y. pestis

5.5. Изменение цитокиновой активности спленоцитов под влиянием антигенов Y. pestis

5.6. Изменения экспрессии ко-стимулирующих молекул CD28 и CD154 на поверхности Т лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V

5.7. Изменение экспрессии CD69 и CD86 рецепторов на поверхности CD19+ CD22+ В лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V

5.8. Выявление антител к F1 и V антигенам Y. pestis в сыворотках крови иммунизированных мышей

5.9. Выявление корреляций между напряженностью иммунитета к чуме у мышей и изменением экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов под влиянием антигенов чумного микроба в системе in vitro

Обсуждение

Глава 6. ОЦЕНКА ИММУННОГО ОТВЕТА У ЛЮДЕЙ ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОЙ ЧУМНОЙ ВАКЦИНОЙ

6.1. Выявление антител в сыворотках крови доноров к антигенам Y. pestis........ 186

6.2. Изменение экспрессии рецепторных молекул в присутствии антигенов Y. pestis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба

6.2.1. Изменение экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности Влимфоцитов

6.2.2. Изменение экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов

6.2.3. Изменение экспрессии CD86 и CD80 рецепторных молекул на поверхности В-лимфоцитов

6.3. Изменение экспрессии поверхностных маркеров Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов Y. pestis

6.3.1. Изменение экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т-лимфоцитов... 193 6.3.2. Изменение экспрессии CD95 рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов

6.3.3. Изменение экспрессии CD107b рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов

6.3.4. Изменение экспрессии CD45RO рецептора на поверхности HLA-DR+ субпопуляции Т лимфоцитов

6.4. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетентными клетками, полученными от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба

6.4.1. Изменение активности синтеза цитокинов ИФН- и ФНО- субпопуляциями Т лимфоцитов под влиянием антигенов чумного микроба

6.4.2. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетеными клетками крови под влиянием антигенов чумного микроба

Обсуждение

Глава 7. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО

ОТВЕТА ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ................. 213

Глава 8. ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ЛЮДЕЙ ПОСТОЯННО

ПРИВИВАЮЩИХСЯ ПРОТИВ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Крупные вспышки и спорадические случаи туляремии и чумы, относящиеся к особо опасным возвращающимся инфекционным заболеваниям, периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе, и в России [5, 31, 36,].

Сохранение эпизоотически активных природных очагов, вероятность применения Francisella tularensis и Yersinia pestis при биотеррористических актах, сложность постановки клинического диагноза обусловливают необходимость разработки новых средств вакцинопрофилактики. В тоже время серьёзным препятствием в создании новых вакцин является отсутствие объективных критериев для оценки эффективности и продолжительности иммунитета.

Разработка методов оценки поствакцинального клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета является актуальным направлением, решение которого особенно необходимо для осуществления индивидуального подхода к ревакцинации; выбора антигенов, активирующих клеточное звено иммунитета, при конструировании вакцин; для заключения о наличии напряженного иммунитета, особенно против аэрозольного заражения инфекциями.

В нашей стране и странах СНГ для профилактики чумы и туляремии используются живые вакцины. Живая чумная вакцина и туляремийная вакцина обеспечивают защиту на один год и пять лет, соответственно, и требуют периодической ревакцинации. В случае ревакцинации живой вакциной человека, имеющего специфический иммунитет к инфекции, вакцинопрофилактика будет не эффективной. Это связано с активацией клеток памяти и синтезом антител и активацией клеточных реакций, которые приведут к элиминации бактерий вакцинного штамма до формирования иммунитета.

О наличии противочумного или противотуляремийного иммунитета судят по наличию антител в крови к F1 антигену Y.

pestis и ЛПС F. tularensis, соответственно. В то же время при формировании противочумного и противотуляремийного иммунитета большая роль отводится обоим звеньям иммунной системы: гуморальному и клеточному. После вакцинации и заболевания туляремией или чумой появляются специфические антитела, которые играют определенную роль в защите от повторного заражения, но, тем не менее, не всегда коррелируют с защитой организма от инфекции [88, 138, 285, 366].

Поэтому для оценки напряженности противочумного/противотуляремийного иммунитета необходимо выявлять как специфические антитела, так и оценивать специфические клеточные реакции.

Поиску методов, позволяющих выявить наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета, посвящено множество работ [3, 9, 320, 342]. В 70-е годы оценку напряженности Т-клеточного иммунитета против туляремии и чумы проводили, используя накожную или внутрикожную аллергическую пробу с тулярином или пестином, соответственно.

Однако широкого распространения эти методы не нашли в связи с побочными реакциями, проявляющимися в ухудшении состояния вакцинированного/больного (как проявление общей реакции организма), а в некоторых случаях развитием некроза (как проявление местной реакции). В дальнейшем для выявления специфического клеточного иммунитета предлагались реакции in vitro: реакция лейкоцитолиза с тулярином для оценки клеточного противотуляремийного иммунитета и показатель повреждения нейтрофилов в тесте с пестином – для оценки клеточного противочумного иммунитета. С появлением современных методов исследований наличие клеточного протиовотуляремийного и противочумного иммунитета пытались оценивать на основании подсчета CD45RA/+, CD62 эффекторных клеток памяти [320], по усилению пролиферативной активности лимфоцитов [9], усилению синтеза клетками ИФНИЛ-2 и ФНО- [150] в ответ на рестимуляцию клеток in vitro антигенами туляремийного или чумного микроба. Тем не менее, вопрос о методах оценки клеточного протиовотуляремийного и противочумного иммунитета остается открытым.

Цель исследования – разработать алгоритм оценки напряженности поствакцинального иммунитета к чуме и туляремии в реакциях in vitro.

Задачи исследования:

1. Проанализировать наличие корреляции между изменением экспрессии маркеров лимфоцитов, их пролиферативной активностью, цитокиновой активностью в реакциях in vitro под влиянием тулярина, кислото-нерастворимого комплекса, рекомбинантного белка 1696, ультразвукового дезинтеграта F. tularensis и напряженностью иммунитета к туляремии у мышей.

2. Выявить различия в ключевых показателях специфической активации лимфоцитов под влиянием тулярина и кислото-нерастворимого комплекса F. tularensis, коррелирующие с защитой мышей от заражения бактериями туляремии различной вирулентности.

–  –  –

4. Изучить влияние степени воспаления, индуцированного разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ на формирование клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета.

5. Предложить методы оценки иммунитета к туляремии у людей.

6. Изучить изменение функциональной активности лимфоцитов под влиянием F1, V, Pla антигенов и ультразвукового дезинтеграта Y. pestis в реакциях in vitro и выявить маркеры, отражающие наличие клеточного противочумного иммунитета.

7. Выявить различия в механизмах активации В и Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis и Y. pestis в клеточных реакциях in vitro у вакцинированных и невакцинированных против туляремии и чумы.

–  –  –

9. Оценить иммунный статус у постоянно вакцинирующихся против чумы, туляремии, сибирской язвы людей.

10. Изучить возможность использования предложенных методов для комплексной оценки специфического иммунитета при других инфекциях.

Научная новизна Впервые показано, что защита мышей против заражения F. tularensis 503 (subsp. holarctica) коррелирует с усилением экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов, синтезом ИФН- и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на активацию клеток кислото-нерастворимым комплексом. О наличии протективного иммунитета при заражении штаммом Schu F. tularensis subsp.

tularensis – наиболее вирулентным штаммом туляремийного микроба – косвенно свидетельствуют не только уровень антител к липополисахариду и кислотонерастворимому комплексу F. tularensis, способность лимфоцитов синтезировать ИФН-, ИЛ-17 и активировать Т хелперы под влиянием кислото-нерастворимого комплекса, но также и способность цитотоксических лимфоцитов активироваться под влиянием кислото-нерастворимого комплекса.

Впервые показано, что у вакцинированных против туляремии доноров под влиянием антигенов F. tularensis отмечается специфическое усиление экспрессии маркера ранней активации CD69 на поверхности Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, и маркера поздней активации HLA-DR на поверхности Т-клеток памяти (CD3+CD4+CD45RО+).

Выявлены разные пути активации Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса у невакцинированных и вакцинированных против туляремии доноров. Под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса лимфоциты вакцинированных доноров активировались через CD28 и CD154 рецепторные молекулы. Лимфоциты неиммунных доноров активировались без участия CD154, что свидетельствовало об отсутствии активации Th1 иммунного ответа.

Впервые показано, что в отличие от невакцинированных доноров у иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходило усиление экспрессии CD86, что отражает активацию не только гуморального, но и клеточного звена иммунитета.

Выявлены разные механизмы межклеточной активации Т и В лимфоцитов, полученных от интактных и иммунных мышей под влиянием F1 антигена.

Активация клеток у иммунных животных происходила по CD28-независимому пути за счет взаимодействия рецепторов В лимфоцитов CD40L с индуцибельной мембранной молекулой CD154, способствующей развитию иммунного ответа по Th1 пути.

Впервые показано, что маркер поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена Y. pestis специфически появляется и на поверхности CD45RO+ CD45RO+ Т хелперов и на поверхности цитотоксических лимфоцитов, полученных от иммунизированных живой чумной вакциной доноров.

Теоретическая и практическая значимость Результаты настоящего исследования вносят существенный вклад в изучение особенностей механизмов активации Т и В лимфоцитов иммунного и неиммунного организма под влиянием специфических антигенов Y. pestis и F. tularensis. Научно обосновано и подтверждено в экспериментах на животных, что способность лимфоцитов изменять экспрессию поверхностных маркеров и активность синтеза цитокинов под влиянием антигенов Y. pestis и F. tularensis in vitro отражает наличие специфического клеточного иммунитета, достаточного для защиты от заражения туляремией и чумой. Расширены представления об иммунологических механизмах обеспечения протективного иммунитета против бактерий F. tularensis разной вирулентности.

В результате проведенной работы предложен комплекс иммунологических показателей, отражающих наличие клеточного противотуляремийного и противочумного иммунитета, что важно для оценки иммунобиологических свойств антигенов и штаммов – кандидатов в вакцинные, а также для выявления специфического иммунитета у людей после вакцинации.

Результаты проведенных исследований послужили основой при составлении ниже перечисленных документов:

- МУ 3.3.1.2161-07. Методические указания. «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» (утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12.02.2007 г.);

Загрузка...

- МР 1.2.0052-11. «Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29.12.2011 г.);

- «Методические рекомендации. Оценка напряженности специфического клеточного иммунитета у людей к возбудителю туляремии in vitro» (одобрены Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утверждены директором ФБУН ГНЦ ПМБ, протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 8 от 07.10.2011 г.).

Разработанные документы используются в ФБУН ГНЦ ПМБ, ФКУЗ РНИПЧИ «Микроб» для отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis, изучения свойств потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы против туляремии и чумы, повышения эффективности оценки противочумного и противотуляремийного поствакцинального иммунитета у людей.

Данные экспериментальных исследований диссертационной работы используются при чтении лекций на курсах по магистерской образовательной программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и по программе курсов повышения квалификации «Микробиология. Основы и особенности работы с биологическими агентами I-IV групп патогенности в научно-исследовательских лабораториях».

Методология и методы исследования Методология исследования спланирована с учетом современных принципов научного познания и организована адекватно поставленной цели. Объектами исследования являлись экспериментальные животные и доноры, периодически вакцинируемые против чумы, туляремии и сибирской язвы. Предметом исследования являлось изучение особенностей формирования специфических клеточных реакций против возбудителей особо опасных инфекций.

Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов: биологических, микробиологических, микроскопических, иммунологических, цитометрических, оценки физиологического состояния животных, методов статистической обработки результатов.

Биологические методы исследования включали проведение экспериментальных исследований на мышах, термометрирование и определение веса животных, оценку внешнего вида и общего состояния.

Микробиологические методы исследований применяли для выявления обсемененности бактериями органов животных, а также в целях получения бактериальных культур Y. pestis, F. tularensis, B. anthracis для иммунизации животных.

Для оценки жизнеспособности иммунокомпетентных клеток, морфологии бактерий, подсчета клеток применяли микроскопические методы исследований.

Цитометрические методы исследований использовали для иммунофенотипирования лимфоцитов, оценки изменения пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием специфических антигенов и митогенов, определения активности синтеза внутриклеточных цитокинов субпопуляциями лимфоцитов, проведения CBA-анализа, позволяющего в небольшом объеме сыворотки или супернатанта выявлять концентрации 10-12 цитокинов одновременно.

Иммунологические методы исследований включали в себя получение спленоцитов, лимфоцитов, культивирование иммунокомпетентных клеток, определение титра антител к возбудителям туляремии и чумы методом твердофазного иммуноферментного анализа, постановку реакции лейкоцитолиза, реакцию басттрансформации лимфоцитов.

При выполнении работы использовались информационные средства:

отечественные и международные научные компьютерные базы данных и информационные ресурсы PubMed, Medline, Wiley Online Library, e-library, материалы российских и зарубежных научных журналов, российских и международных конференций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов, синтеза ИФН- и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на реактивацию кислотонерастворимым комплексом, а также наличие антител к липополисахариду и кислото-нерастворимому комплексу F. tularensis коррелируют с наличием протективного противотуляремийного иммунитета у мышей.

2. По изменению количества клеток, экспрессирующих CD69 рецептор на поверхности Т хелперов и HLA-DR маркер на поверхности СD3+СD4+СD45RO+ клеток, под влиянием тулярина можно судить о наличии противотуялермийного клеточного иммунитета у людей.

3. Активация Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислотонерастворимого комплекса у вакцинированных против туляремии доноров инициируется через CD28 и CD154 рецепторную молекулы. Лимфоциты неиммунных доноров активируюся без участия CD154, что свидетельствует о ингибировании Th1 иммунного ответа.

4. В крови, полученной от доноров, иммунизированных живой чумной вакциной, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходит усиление экспрессии CD86, что способствует активации Т лимфоцитов.

5. По увеличению экспрессии маркера поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена Y. pestis на поверхности CD45RO+ лимфоцитов можно судить о наличии противочумного клеточного иммунитета у людей.

в Федеральном бюджетном учреждении науки

Работа выполнена «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ.

Личный вклад соискателя Диссертационная работа выполнена лично автором, а также в сотрудничестве с коллегами: отдела иммунобиохимии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.б.н.

С.Ф.Бикетов; отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.м.н. А.Н.Мокриевич; лаборатории биологических испытаний ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.И.Борзилов; лаборатории биологической безопасности ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.Е.Тюрин.

Степень достоверности и апробация результатов исследования О достоверности результатов работы свидетельствует использование современных автоматизированных методов исследования, поддерживающихся программными обеспечениями для анализа и статистической обработки результатов. Использование адекватных методов исследования позволило количественно оценить способность Т и В лимфоцитов к специфической активации под влиянием антигенов, а также выявить маркеры отражающие наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 42 от 24 декабря 2014).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов:

Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2009); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство»

(Москва, 2010); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010);

10-м интернационального симпозиума «Yersinia 2010» (Бразилия, Ресиф, 2010);

6-ой международной конференции по зоонозам (Мексика, Канкун, 2011);

1-ой Международной конференции по инфекционным заболеваниям и наномедицине (Непал, Катманду, 2012); Международном симпозиуме по опасным заболеваниям (Австрия, Вена, 2014).

Предложенный метод оценки клеточного противтуляремийного иммунитета используется для оценки поствакцинального иммунитета у сотрудников ФБУН ГНЦ ПМБ, а также в учебном процессе Пущинского государственного естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и курсах повышения квалификации при ГНЦ ПМБ. Подготовлены методические рекомендации и методические указания.

Публикации Основное содержание работы

отражено в 35 научных публикациях, в том числе в 13 статьях в журналах из списка изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, 1 руководстве и одной монографии.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 281 странице, содержит 24 таблицы, 48 рисунков.

Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Библиография включает в себя 422 источника, в том числе 46 отечественных и 376 зарубежных.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Особенности формирования иммунного ответа к мироорганизмам F. tularensis 1.1.1. Особенности неспецифического иммунного ответа к бактериям F. tularensis F. tularensis – высоковирулентный патогенный вид грамм-отрицательных внутриклеточных бактерий, вызывающих развитие туляремийной инфекции.

Род Francisella – единственный представитель семейства Francisellaceae, принадлежащего к -подклассу Proteobacteria [166]. На основании результатов ДНК/ДНК гибридизации в роде Francisella предложено различать несколько видов микроорганизмов: F. tularensis, F. philomiragia и F. novicida, хотя некоторые F. novicida относят к подвиду F. tularensis. Вид F. tularensis включает три подвида: F. tularensis subsp tularensis, F. tularensis subsp. palaearctica, F. tularensis subsp. mediasiatica and F. tularensis subsp. novicida, которые различаются по степени вирулентности и географическому распространению.

Наиболее вирулентными для человека являются микроорганизмы F. tularensis subsp nearctica (F. tularensis subsp tularensis, тип А.I в соответствии с зарубежной классификацией) [341].

Клинические проявления туляремии зависят от путей проникновения бактерий. Возбудитель туляремии может проникать в организм аэрогенным, алиментарным или трансимиссивным путями. В случае отсутствия лечения смертность для людей составляет 5 %. Наиболее опасным путем проникновения F. tularensis считается аэрозольный – при котором смертность составляет около 60 % в случае отсутствия лечения.

Инфекция не передается от человека к человеку. Инкубационный период заболевания составляет от 1 до 21 дня. Для развития туляремийной инфекции достаточно попадания всего 10 бактерий в организм человека [325, 326]. После проникновения в организм хозяина бактерии мигрируют в лимфатические узлы, а затем в селезенку, печень, легкие, почки, толстый кишечник, нервную ткань и костный мозг [181]. Через несколько дней после начала заболевания основными резервуарами F. tularensis являются печень и селезенка, в меньшей степени – костный мозг и легкие. Со стороны периферической крови наблюдается небольшое увеличение в количества лейкоцитов [413].

Защита организма от возбудителей туляремии, как от любых других бактерий, осуществляется за счет врожденных и приобретенных иммунологических реакций. В начале инфицирования иммунокомптентные клетки макроорганизма за счет механизмов врожденного иммунитета распознают консервативные для микроорганизмов и отсутствующие у позвоночных, патогенассоциированные молекулярные структуры. Эти структуры распознаются специальными рецепторами – паттерн- или образ-распознающими рецепторами (pattern recognition receptors – PRR). Паттерн-распознающие рецепторы включают мембран-ассоциироованные толл-подобные рецепторы (TLR) и цитозольные NOD-подобные (NLR) [228].

В связи с тем, что Francisella вначале находится в фагосоме, а затем высвобождается в цитоплазму, бактерии могут взаимодействовать как с мембранными, так и с цитопламатическими паттерн-распознающими рецепторами. Сигналы TLR и NLR стимулируют продукцию определенных цитокинов, определяющих формирование типа адаптивного иммунного ответа [118].

F. tularensis, Изучение микробных лигандов ответственных за взаимодействие с TLR показали, что липопротеины активируют гетеродимеры TLR-2/TLR-1 или TLR-2/TLR-6 [370].

Ключевыми медиаторами формирования воспалительного ответа на микробы F. tularensis являются TLR-2 и MyD88. TLR-2 способствует активации NF-B дендритными клетками, которые начинают синтезировать ФНО- и экпрессировать маркеры созревания [217] и индуцировать выработку широкого ряда провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами в ответ на активацию их бактериями вакцинного штамма F. tularensis [103, 47]. Связавшись с мембранным TLR-2 микробы вакцинного штамма локализуются внутриклеточно в фагосоме, содержащей TLR-2/MyD88 [103].

Как и другие грам-отрицательные микроорганизмы в структуру F. tularensis входят липополисахариды (ЛПС). Распознавание TLR4 структуры ЛПС играет важнейшую роль в активации врожденного иммунитета против граммотрицательных бактерий. Однако ЛПС F. tularensis различных подвидов имеет измененную структуру, которая слабо распознается ЛПС-связывающими белками TLR4 и TLR-2 [136, 370]. Таким образом, ЛПС F. tularensis не принимает участия в формировании воспалительных реакций. По всей видимости, одними из компонентов, участвующими в активации синтеза провоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками, являются два липопротеина F. tularensis TUL4 и FTT1103, которые способны связываться с TLR-2 и запускать формирование иммунного ответа [370].

В зависимости от вирулентности штамма ЛПС F. tularensis характеризуется различной способностью активировать экспрессию TLR2 и TLR4. Вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективного антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В399 A'Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов толл-подобных рецепторов [40, 46]. Тем не менее, эксперименты, проведенные на TLR-4 дефицитных мышах, не показали усиления чувствительности к бактериям F. tularensis, что свидетельствует об отсутствии ключевого значения TLR-4 в защите организма от инфекции [95].

Индукция первичного адаптивного иммунного ответа сопряжена с процессом антиген-презентации. Наиболее мощные антиген-презентирующие клетки в макроорганизме – это дендритные клетки – только они способны эффективно активировать наивные Т лимфоциты [16]. Однако бактерии F. tularensis оказывают иммуномодулирующее действие на антигенпрезентирующие клетки. Причем отмечаются некоторые различия в модулирующем действии бактерий вакцинного штамма и вирулентного штамма F. tularensis типа А. В частности, вакцинный штамм вызывает «фенотипическую»

активацию (увеличение экспрессии МНС II и CD86 рецепторов), но не «функциональное» созревание (отсутствие секреции ФНО- и ИЛ-12) антигенпрезентирующими клетками. Такой ослабленный провоспалительный ответ наблюдается у клеток, полученных от вакцинированных против туляремии людей, в системе in vitro. Вирулентный штамм типа А F. tularensis полностью супрессирует иммунный ответ: не индуцирует «фенотипическую» активацию дендритных клеток, макрофагов, не индуцирует выработку провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-12, ИЛ-10, ИЛ-1). Подавление вирулентным штаммом иммунного ответа сопряжено также со стимуляцией выработки TGF-, что способствует репликации бактерий [287].

F. tularensis, Основным фактором, обуславливающим вирулентность является их способность выживать и размножаться внутри дендритных клеток и F. tularensis макрофагов [168]. Для проникновения внутрь макрофагов используют специальную стратегию захвата. В прикреплении к клеткам-мишеням F. tularensis участвует фермент нейраминидаза.

F. tularensis Фагоцитоз проходит по комплемент-зависимому пути.

Связывание происходит только с С3 рецептором, но не с мембран-атакующим комплексом C5b-C9 [121, 100]. В процессе фагоцитоза также участвуют Fc рецепторы, белок А суфрактанта [68, 70, 179, 293, 330]. При отсутствии опсонизации фагоцитоз F. tularensis опосредован маннозным рецептором 7 при участии рецепторов-мусорщиков класса А и нуклеолина [70, 179, 293, 330].

При этом развитие фагоцитарных реакций не приводит к формированию кислородного взрыва, за счет ингибирующего действия кислой фосфатазы AcpA [306] и MinD белка, который работает как помпа свободных радикалов кислорода[62]. Для дальнейшего выживания внутри макрофагов F. tularensis использует IglC белок весом 23 кДа, который взаимодействует с TLR-4 рецептором [306] и MglAB оперон, который регулирует транскрипцию факторов вирулентности бактерий [235].

После проникновения в макрофаги бактерии F. tularensis изолируются от внутриклеточной среды в фагосоме. Через 30-60 минут после фагоцитоза мембрана фагосомы деградирует, F. tularensis типа A и B ингибируют закисление фагосом и бактерии проникают в цитоплазму клетки, где активно размножаются [324]. Кинетика высвобождения из фагосомы определяется особенностями опсонизации. При сравнении кинетики высвобождения из фагосомы бактерий не опоснизированных и опсонизированных сывороткой было обнаружено, что опсонизация задерживает время выхода бактерий из фагосомы и снижает размножение F. tularensis в цитоплазме [179].

Способность F. tularensis выходить из фагосомы и размножаться в цитоплазме клетки позволяет предположить о презентации антигенов F. tularensis с главным комплексом гистосовместимости I и участием рецепторов CD8. Это необходимо учитывать при разработке вакцин против туляремии. По всей видимости, наиболее эффективными будут вакцины, которые будут способствовать презентации иммунопротективных антигенов через I класс главного комплекса гистосовместимости.

После фагоцитоза и выхода F. tularensis из фагосомы в фагосоме запускаются процессы созревания, в процессе которых в фагосоме появляются ранние эндосомальные маркеры – EEA1 и поздние эндосомальные маркеры CD63, LAMP-1, и LAMP-2 [101, 184]. Необходимость закисления фагосомы для выхода из нее F. tularensis остается под вопросом. В некоторых исследованиях показано, что на поздних стадиях созревания, даже через 3ч после инфицирования фагоцитов, закисления фагосомы не происходит [101]. По другим данным происходит кратковременное закисление фагосом уже через 1 ч после инфицирования фагоцитов F. tularensis и в случае блокирования закисления фагосомы бактерии не могут выйти в цитоплазму [97, 167, 323].

F. tularensis Покинув фагосому бактерии начинают усиленно пролиферировать в цитозоле[61]. Проникновение бактерий в цитоплазму запускает процессы апоптоза. F. tularensis запускает активацию каспазы-3 [82, 231, 302, 322, 391], хотя до конца механизмы апоптоза не изучены. Известно, что в зависимости от вида штамма F. tularensis оказывает различное влияние активацию каспаз и характер апоптоза. В частности F. tularensis типа А активируют каспазу 3 и незначительно каспазу 1 [182]. Живой вакцинный штамм F. tularensis запускает секрецию ИЛ-1 и активирует каспазу 1. В конечном счете, инфицированные макрофаги подвергаются апоптозу, а освободившиеся бактерии инфицируют новые клетки.

Исследования последних лет, показавшие способность F. tularensis и F. novicida выживать вне клеток крови в течение инфекционного процесса [165, 414], позволили предположить важное участие внеклеточных медиаторов в инфекционном процессе. F. tularensis всех подвидов устойчивы к бактерицидному действию сыворотки крови, что обусловлено особенностями карбогидратной структуры капсулы, в частности строением ЛПС О-антигена [100, 371].

Бактерии F. tularensis кроме макрофагов способны инфицировать и другие клетки. Механизм проникновения F. tularensis и их жизенный цикл внутри этих клеток до конца не изучен. Предполагается, что проникновение бактерий в эпителиальные клетки ассоциировано с полимеризацией актина, перестройкой микротрубочек и сигналов по фосфатидилинозитол 3-киназа- (PI3K) и тирозинкиназному путям. После проникновения F. tularensis в эпителиальную клетку бактерии начинают активно реплицироваться [120]. Эпителиальные клетки способны захватывать живые и инактивированные F. tularensis с одинаковой скоростью, что позволяет предположить об участии поверхностных лигандов бактерий [120].

Бактрии F. tularensis могут инфицировать эритроциты [202], фибробласты [173], клетки почечного эпителия [203] и гепатоциты [109]. Механизм проникновения F. tularensis в нефагоцитирующие клетки и возможность их репликации внутри этих клеток до конца не выяснены. При проникновении бактерий в эритроциты задействованы оба механизма – комплемент-зависимый и комплемент-независимый, но ничего не известно о жизненном цикле бактерий внутри эритроцитов [202].

Дендритные клетки поглощают F. tularensis при участии механизмов, связанных с опсонизацией бактерий и интегринов CR3 и CR4 [75]. Нейтрофилы поглощают по тому же механизму, что и дендритные клетки [251, 256, 262, 296].

Примерно через 24 ч инфицирования F. tularensis могут наблюдаться в мультимембранных терминальных вакуолях. Мультимембранные терминальные вакуоли являются околоядерными, слитыми с лизосомами. Образование мультимембранных вакуолей, содержащих F. tularensis харакетрно как для Schu S4, так и для бактерий вакцинного штамма [92]. Более 90 % F. tularensis LVS способны проникать из фагосомы в цитоплазму клетки. Анализ маркеров ранних фагосом (трансферриновый рецептор и его лиганд, трансферрин, ЕЕА1) показал, что как живые F. tularensis LVS, так и убитые F. tularensis LVS примерно с одинаковой скоростью захватываются макрофагами [122]. Это свидетельствует о том, что активные компоненты патогенов, модулирующие фагоцитарный процесс макрофагов, вырабатываются позднее. Маркерами поздних фаголизосом являются CD-63, лизосомальный интегральный мембранопротеин, LAMP-1, LAMP-2 и гидролазы такие как катепсин-D. Методом иммуноэлктронной микроскопии было показано, что CD63, но не катепсин D, появляется в фагосомах, захвативших бактерии F. tularensis (как живые, так и убитые). Ингибирование появления катепсина D способствует снижению возможности слияния фагосомы с лизосомой [83].

Ведущую роль в формировании протективного иммунитета против внутриклеточных инфекций отводится стремительному развитию антимикробных реакций в частности продукции провоспалительных цитокинов Th-1 типа в ответ на внедрение возбудителя в организм [15]. При заражении мышей вирулентным штаммом F. tularensis уровень ИФН- и ФНО- увеличивается только на 3-4 сутки [56]. По всей видимости, позднее повышение провоспалительных цитокинов в ответ на внедрение в организм возбудителя туляремии позволяет в течение первых двух суток размножиться F. tularensis в органах и тканях, что способствует тяжелому течению инфекции с летальным исходом [114]. В элиминации патогенных бактерий из макроорганизма значительная роль отводится фагоцитраным реакциям. Важная роль бактерицидных систем организма на начальных этапах развития инфекции подтвердилась в экспериментах, в которых животным до аэрозольного заражения F. tularensis вводили синтетические аналоги TLR-4, TLR-3 или ИЛ-12, способствующих активации бактерицидной активности фагоцитов, что приводило к снижению обсемененности органов и снижению летальных исходов [135, 240].

В отличие от вирулентных вакцинный штамм F. tularensis LVS стимулирует синтез ИФН- и ФНО- уже через 24-48ч после иммунизации мышей. ИФН- и ФНО- способствуют синтезу реактивных форм азота макрофагами в результате чего ингибируется внутриклеточное размножение и выживание бактерий вакцинного штамма F. tularensis внутри клетки [143]. ФНО- стимулирует бактерицидную активность и инициирует развитие адаптивного иммунного ответа. ФНО- играет большую роль в обеспечении защиты организма от развития туляремийной инфекции при интрадермальном введении LVS и необходим для ингибирования внутриклеточной репликации LVS в макрофагах.

При аэрозольном пути проникновения F. tularensis LVS большое значение играет синтез ИЛ-17А который: стимулирует активированные F. tularensis LVS дендритные клетки, которые начинают синтез ИЛ-12 и ИФН-; способствует поляризации цитокинового ответа по Th1 пути; способствует рекрутизации нейтрофилов в очаг воспаления [142, 247].

Нейтрофилы активно поглощают F. tularensis как вакцинного, так и вирулентных штаммов, однако бактерии выживают в цитозоле нейтрофила, покидая фагосому [261]. Тем не менее, нейтрофилы активно участвуют в активации иммунной системы за счет выработки цитокинов и хемокинов, которые привлекают в очаг воспаления и активируют другие ИКК [108].

Тучные клетки, участвующие в формировании аллергических реакций гиперчувствительности 1 типа, способны ингибировать размножение бактерий F.tularensis LVS за счет синтеза ИЛ-4, что связано с увеличением АТФ внутри макрофагов и закислением органелл [309].

Участие натуральных киллеров в формировании противотуляремийного иммунитета не является ключевым и сводится по всей вероятности к продукции ими ИФН-. По всей видимости при недостаточной активности НК компенсацию их работы выполняют другие ИКК, способные синтезировать ИФН- (ДК, макофаги, полиморфноядерные нейтрофилы). Это подтвержают эксперименты, в F. tularensis которых показано, что у иммунизированных LVS мышей, иммунодефицитных по НК, уровень ИФН- был ниже по сравнению с иммунизированными F. tularensis LVS иммунокопметентными мышами на 50 % [82].

Возбудитель туляремии является факультативным внутриклеточным микроорганизмом. Поэтому основной в формировании противотуляремийного иммунитета является совместная активация Т и В лимфоцитов.

1.1.2. Гуморальное звено в формировании противотуляремийного иммунитета В процессе формирования иммунитета к инфекции необходимо участие одновременно Т и В лимфоцитов. Основной функцией В лимфоцитов в формировании специфического иммунитета является синтез антител. Однако В лимфоциты также принимают активное участие в регуляции эффекторной, регуляторной функций Т-клеток, а также активности Т-клеток памяти. Регуляция Т-клеточного ответа В лимфоцитами осуществляется с участием костимулирующих рецепторов (СD80, CD86), цитокинов и хемокинов, лигандов TLR.

В лимфоциты могут выступать в роли антиген-презентирующих клеток, и особенно важна эта функция В лимфоцитов, когда концентрация антигена очень низкая. Презентируя антиген Т лимфоцитам, В клетки регулируют активацию, дифференцировку и пролиферацию CD4+ лимфоцитов.

В соответствии с цитокиновым профилем В-клетки могут дифференцироваться в В-1 или В-2 клетки. В частности при активации В-клеток Т лимфоцитами или антигенами в присутствии Th1 цитокинов (ИФН- и ИЛ-12) В-лимфоциты дифференцируются в В-1 клетки, которые в большом количестве не секретируют ИЛ-4, ИЛ-13 или ИЛ-2, но активно синтезируют ИЛ-10.

Активированные Т лимфоцитами в присутствии Th2 цитокинов В лимфоциты дифференцируются в В-2 клетки, которые активно синтезируют ИЛ-2, лимфотоксин, ИЛ-4, ИЛ-13 и практически не синтезируют ИФН-.

В формировании гуморального противотуляремийного иммунного ответа основная роль принадлежит так называемым В-1 лимфоцитам, которые преимущественно локализуются в плевральной полости, слизистой кишечника и селезенке у мышей и синтезируются в основном антитела против Т-независимых антигенов [102]. Продукция антител этими клетками против F. tularensis начинается уже на 2-3 день после иммунизации мышей F. tularensis LVS.

Однако, при вторичном иммунном ответе В лимфоциты играют частичную роль в формировании протективного противотуляремийного иммунного ответа, а главная роль отводится работе Т лимфоцитов. Об этом свидетельствует эксперименты, где показано, что иммунная сыворотка или очищенные противотуляремийные антитела не защищали мышей от вирулентного штамма F. tularensis типа А [372], хотя и характеризовались протективными свойствами от менее вирулентного штамма F. tularensis типа Б [222, 236, 352]. Кроме того, попытки создать вакцину на основе ЛПС F. tularensis или его конъюгатов с белками также не увенчались успехом и позволили получить лишь слабую защиту от вирулентного штамма F. tularensis типа Б [102, 221].

При наличии специфических антител опсонизация ими бактерий Schu S4 способствует усилению синтеза ФНО- и ИЛ-6 макрофагами и таким образом способствует активации клеточных реакций. При отсутствии опсонизации бактерий Schu S4 усиления синтеза провоспалительных цитокинов не происходит, а значит, не формируется клеточный иммунный ответ. Исследования последних лет показали, что бактерии высоковирулентного штамма F. tularensis SchuS4 типа А, но не вакцинного штамма, способны напрямую связывать плазмин-серин протеазу, которая деградирует антитела [119], таким образом, ингибируя специфический гуморальный ответ и клеточные реакции.

О важной роли клеточного иммунного ответа при туляремии свидетельствует также тот факт, что при введении иммунной сыворотки мышам противотуляремийная защита обуславливалась антителами только в случае активации Fc-рецепторов макрофагов, что было обусловлено активацией специфического фагоцитоза с участием антител [222].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 10 |
 
Похожие работы:

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«БАБЕШКО Кирилл Владимирович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЧТЕНИЯ СФАГНОБИОНТНЫХ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ГИДРОЛОГИЧЕСКОГО РЕЖИМА БОЛОТ В ГОЛОЦЕНЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Цыганов...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Черкасова Анна Владимировна НОВЫЕ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИЕ БАД: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Специальность: 05.18.07– Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: доктор технических наук,...»

«Труш Роман Викторович ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СКАЙ-ФОРСА И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель Горшков Григорий Иванович заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Белгород – п. Майский 2015 г. СОДЕРЖАНИЕ...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«ЕГОРОВА Ангелина Иннокентьевна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У МУЖЧИН КОРЕННОЙ И НЕКОРЕННОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ ЯКУТИИ В РАЗНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Д.К....»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.