WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |

«ФЕДОРОВА Екатерина Алексеевна ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«И Н С Т И Т У Т Э К С П Е Р И М Е Н Т А Л Ь Н О Й М Е Д И Ц И Н Ы»

_____________________________________________

На правах рукописи

ФЕДОРОВА

Екатерина Алексеевна

ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРУСА ГРИППА,



ВЛИЯЮЩИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО

ИММУННОГО ОТВЕТА

В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ПРИ ВАКЦИНАЦИИ

03.02.02 – вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, доцент И.В. КИСЕЛЕВА Санкт-Петербург –

ОГЛАВЛЕНИЕ

Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ

Раздел 2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа. Общие сведения.

1.1.1 Строение вириона

1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа

1.2. Белки вируса гриппа

1.2.1 Белки полимеразного комплекса (PB2, PB1, PA)

1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа – гемагглютинин и нейраминидаза

1.2.3 Нуклеопротеин (NP)

1.2.4 M1 и М2 белки

1.2.5 Неструктурные белки

1.3 Специфический иммунитет к вирусу гриппа и ЖГВ

1.3.1 Гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа и ЖГВ

1.3.2 Клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа и ЖГВ

1.3.3 Методы оценки гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию.............. 25 1.3.4 Морская свинка как модель для изучения противогриппозного иммунитета..............

1.4 Свойства вируса гриппа, которые могут повлиять на иммуногенность гриппозных вакцин

1.4.1 Температурочувствительность «диких» вирусов, ее возможные механизмы..............

1.4.2 Влияние ts–фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины

1.4.3 Ингибиторочувствительность «диких» вирусов, ее природа и возможные механизмы

1.4.4 Связь ингибиторочувствительности с иммуногенностью

1.4.5 Связь рецепторной специфичности с иммуногенностью

1.5 Кодонная оптимизация как способ повышения иммуногенности

1.5.1 Теоретические основы оптимизации кодонного состава

1.5.2 Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин

1.5.3 Повышение иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава

1.6 Заключение к обзору литературы

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Вирусологические методы

2.2 Методы работы с лабораторными животными

2.3 Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа

2.4 Молекулярно–биологические методы

2.5. Методы компьютерного моделирования

2.6 Методы статистической обработки

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Отработка модели для постановки опытов по исследованию показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа

3.1.1 Сравнительный анализ патогенетических особенностей гриппозной и вакцинальной инфекций у морских свинок

3.1.2 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах

3.1.3 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с одиночными кодирующими мутациями в гемагглютинине....... 70 3.1.4 Заключение

3.2 Влияние ингибиторочувствительности штамма вируса гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок

3.2.1 Сравнение ингибитороустойчивого и ингибиторочувствительного вариантов вируса А/Singapore/1/57 (H2N2), имеющих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютинина, в экспериментах in vitro и in vivo.

3.2.2 Показатели гуморального иммунного ответа после заражения морских свинок вариантами вируса А/Singapore/1/57 (H2N2) в экспериментах in vivo

3.2.3 Характеристика 7:1 и 6:2 реассортантов, унаследовавших нейраминидазу от ИЧ или ИУ вируса-родителя





3.2.4 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа A/California/7/2004 (H3N2)

3.2.5 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и 6:2 реассортантами на основе вируса гриппа B/Wisconsin/1/2010

3.2.6 Заключение

3.3 Отдельные аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина и их влияние на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами

3.3.1 Гетерогенность в аминокислотном составе гемагглютинина популяции дикого вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и клетках MDCK

3.3.2 Картирование аминокислотных отличий в гемагглютинине клонов дикой популяции А/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинных реассортантов, подготовленных на их основе

3.3.3 Показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок, вакцинированных штаммами, подготовленными на основе вариантов вируса А/New Caledonia/20/99 (H1N1), имеющих одиночные аминокислотные отличия в гемагглютинине

3.3.4 Заключение

3.4 Влияние оптимизации кодонного состава гемагглютинина на свойства вирусов гриппа и показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo.............. 97 3.4.1 Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе.

3.4.2 Фенотипические свойства вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине

3.4.3 Показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине в экспериментах in vivo

3.4.4 Отработка методики получения вакцинных штаммов ЖГВ на основе штаммов для инактивированной вакцины (PR8 реассортантов).

3.4.5 Реассортация вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57

3.4.6 Заключение

3.5 Cвязь фенотипических признаков «диких» родительских вирусов с иммуногенностью вакцинных штаммов, подготовленных на их основе:

ретроспективный анализ данных клинических испытаний живой гриппозной вакцины

3.5.1 Влияние ts–фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины

3.5.2 Влияние ингибиторочувствительности «дикого» родительского

3.5.3 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ

3.5.4 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на выраженность клинических реакций при введении ЖГВ

3.5.5 Заключение

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Раздел 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ:

Благодарность

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………………………………………………179 Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Вакцинопрофилактика гриппа, как и многих других вирусных инфекций, остается эффективным средством предупреждения развития этого заболевания. Существует два основных направления специфической профилактики гриппа – вакцинопрофилактика с помощью инактивированной (ИГВ) и живой гриппозной реассортантной (ЖГВ) вакцин. Преимущество ЖГВ заключается, во-первых, в возможности наращивания больших объемов препарата в короткие сроки, что особенно важно в случае возникновения угрозы новой пандемии и в странах с высокой плотностью населения, во-вторых

– в стимуляции более широкого спектра факторов адаптивного иммунитета, в том числе во «входных воротах» инфекции Эксперты Всемирной организации [33-35, 38, 314].

здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют применение ЖГВ наряду с ИГВ, поскольку в результате вакцинации этим препаратом у привитых возникает перекрестный иммунитет к разным вариантам вируса гриппа [345].

На количественные и качественные характеристики поствакцинального адаптивного иммунного ответа к ЖГВ могут в комплексе влиять гено- и фенотипические признаки как вакцинируемых людей, так и вакцинного штамма. Если первая сторона этого вопроса изучена довольно основательно, то вторая – значительно слабее. Настоящая работа посвящена исследованию связи между некоторыми биологическими признаками вируса гриппа (чувствительность к повышенной температуре и к неспецифическим ингибиторам сыворотки крови, наличие отдельных или множественных аминокислотных замен в белках) и интенсивностью гуморального иммунного ответа на этот возбудитель.

Степень разработанности темы. Развитие иммунного ответа на ЖГВ и вирусы гриппа изучается как в экспериментальных работах [47, 49], так и с эпидемиологической точки зрения [34, 283]. Накоплены данные о закономерностях его формирования при гриппозной инфекции и вакцинации Разработан комплексный метод оценки гуморального [33-34, 41].

противогриппозного иммунитета [33, 39].

В отдельных работах описана связь иммунного ответа организма с такими фенотипическими признаками вирусов гриппа А, как чувствительность к высокой температуре инкубации, чувствительность к неспецифическим сывороточным ингибиторам [14, 30-31, 78-79, 321]. Однако в данных работах изучен только один показатель иммунного ответа:

антигемагглютинирующие антитела. Периодически появляются новые сведения об одиночных мутациях, влияющих на иммунный ответ [97-98, 156, 188], и экспериментальные исследования в этом направлении позволят дополнить знания о роли определенных аминокислотных позиций в белках вируса гриппа.

На настоящий момент активно развивается направление оптимизации кодонного состава генетических конструкций, используемых в противовирусных вакцинных препаратах. Данный прием позволяет повысить иммуногенность ДНК-вакцин [165, 364], в том числе гриппозных [96, 316, 331]. В литературе описано получение аттенуированного штамма полиовируса с деоптимизированным кодонным составом [90]. Сведения о применении этой методики по отношению к живому вирусу гриппа в литературе отсутствуют.

Таким образом, литературные данные о влиянии биологических свойств вируса гриппа на формирование поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа, разрозненны и не позволяют сделать окончательный вывод о том, какие свойства «дикого» вируса гриппа дают возможность повысить иммуногенность вакцинных штаммов в отношении индукции гуморального иммунитета.

Целью работы явилось изучение отдельных биологических свойств вирусов гриппа, влияющих на показатели гуморального иммунного ответа при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Обосновать возможность использования морских свинок как модели для изучения гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию и вакцинацию живой гриппозной вакциной.

2. На базе этой модели изучить связь количественных показателей гуморального иммунного ответа с чувствительностью вирусов гриппа к неспецифическим сывороточным ингибиторам и наличием одиночных аминокислотных замен в гемагглютинине.

3. Охарактеризовать штаммы вируса гриппа с искусственно измененным составом кодонов в гене, кодирующем гемагглютинин, и оценить влияние изменения кодонного состава на показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo.

4. На основе анализа результатов клинических испытаний оценить влияние свойств температуро- и ингибиторочувствительности «дикого» родительского вируса на интенсивность гуморального ответа у людей, привитых живой гриппозной вакциной.

Научная новизна. Впервые обоснована возможность использования морских свинок как модели для изучения гуморального иммунного ответа на ЖГВ.

Впервые исследованы свойства живых вирусов гриппа А с измененным составом кодонов сегмента генома, кодирующего гемагглютинин, в экспериментах in vitro и in vivo и показана перспективность кодонной оптимизации гемагглютинина живого вируса гриппа А применительно к повышению его иммуногенности.

Впервые в опытах in vivo и по материалам клинических испытаний проведен сравнительный анализ иммуногенности реассортантных вакцинных штаммов ЖГВ, подготовленных на основе «диких» вирусов гриппа А и В, с разным уровнем ингибиторо- и температуроустойчивости. Установлена связь этих свойств с выраженностью гуморального иммунного ответа.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Работа включает как теоретические, так и практические аспекты. Полученные данные о влиянии на иммуногенность изученных фенотипических свойств вирусов гриппа А и В, аминокислотных замен в гемагглютинине, изменения кодонного состава гемагглютинина дополняют знания о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа к этому возбудителю. Решен ряд практических задач:

Обоснована возможность использования морских свинок в качестве модельного объекта для изучения показателей гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа А и В.

Разработана схема оценки показателей гуморального иммунного ответа к ингибиторочувствительным вирусам гриппа А и В у морских свинок.

Сформулированы принципы отбора «диких» вирусов гриппа А и В для использования в качестве источников антигенных детерминант при подготовке вакцинных штаммов ЖГВ, позволяющие повышать показатели гуморального иммунного ответа.

Показана перспективность применения методики направленного изменения кодонного состава HA живых вирусов гриппа А для повышения их иммуногенности при интраназальном введении.

Отработаны приемы, позволяющие повысить эффективность реассортации вирусов, содержащих внутренние гены от высокоурожайного вируса A/PR/8/34 с холодоадаптированным донором аттенуации.

Методология и методы исследования. Основной методологической базой явились экспериментальные исследования на морских свинках. Были использованы вирусологические, серологические, иммунологические и молекулярно–биологические методы (см. «Материалы и методы»).

Личный вклад автора. Автором лично спланирована, подготовлена и проведена экспериментальная часть данного исследования: работа с вирусами и с животными, исследование биоматериалов, молекулярно-биологический анализ. Осуществлена статистическая обработка полученных данных. Автором систематизированы и проанализированы архивные данные клинических испытаний вакцинных штаммов, проведенных в разные годы силами коллектива отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ»).

Положения, выносимые на защиту.

Морские свинки могут быть использованы как модель для изучения поствакцинального и постинфекционного гуморального иммунного ответа к вирусам гриппа.

Вакцинные штаммы, подготовленные на основе устойчивых к температуре и неспецифическим сывороточным ингибиторам «диких» вирусов гриппа, обладали повышенной иммуногенностью в отношении индукции гуморального иммунного ответа.

Одиночные аминокислотные замены T131I в HA1 и D112N в HA2 гемагглютинина вакцинных штаммов, подготовленных на основе вируса гриппа А/New Caledonia/20/99 (H1N1), приводили к снижению показателей гуморального иммунного ответа у экспериментальных животных.

Полученные данные о применении метода кодонной оптимизации гемагглютинина вируса гриппа А открывают перспективы конструирования высоко иммуногенных живых гриппозных вакцин.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность и объективность выносимых на защиту положений и выводов диссертации подтверждается значительным объемом исследований и большим массивом статистически обработанных данных.

Результаты были представлены на 16 международных и российских конференциях, в том числе I и II Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (СПб, 2010; 2012); на международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодежь – медицине будущего» (Одесса, Украина, 2011); на 4 и 5 конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 2014; Рига, Латвия, 2014); на Всероссийской научно–практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, 2011); на научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение» (СПб, 2012); на XVI и XVII Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (СПб, 2013 и 2014); на международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (СПб, 2013); на VIII Международном конгрессе по контролю за гриппом (ЮАР, Кейптаун, 2013); на 8 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); на научно-практической конференции молодых ученых ''От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций: подходы, традиции, инновации" (СПб, 2014); на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, 2014); на межлабораторной конференции ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.

М.П. Чумакова», а также регулярно заслушивались на заседаниях отдела вирусологии им.

А.А.Смородинцева ФГБНУ «ИЭМ» (2010–2014).

Публикации. Основные результаты и положения диссертации, выводы и заключение полностью отражены в 14 научных статьях, 9 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки РФ, или входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования.

Раздел 2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа. Общие сведения

Вирус гриппа (р. Influenza) относится к сем. Orthomyxoviridae. Выделяют три рода:

вирусы гриппа А, В и С. Природным резервуаром вирусов гриппа А являются птицы, но вирусы гриппа А поражают также широкий круг животных, включая свиней, лошадей, и морских млекопитающих. Ряд подтипов вирусов гриппа А вызывает инфекции у человека. Вирусы гриппа В и С поражают прежде всего человеческую популяцию [264].

1.1.1 Строение вириона Вирусы гриппа – оболочечные вирусы с сегментированным геномом, представленным одноцепочечной антисмысловой РНК. Геном вирусов гриппа А состоит из 8 сегментов, в составе вириона связанных в нуклеопротеиновые комплексы В структуре [161].

нуклеопротеинового комплекса РНК связана с белком – нуклеопротеином (NP), а также с РНКзависимой-РНК-полимеразой. Полимераза вируса гриппа состоит из трех субъединиц: два основных белка полимеразы (PB1, PB2) и кислый белок полимеразного комплекса (PA). В процессе упаковки РНК в нуклеопротеин NP образует так называемый кор, вокруг которого РНК формирует спиральную структуру [161]. Геном, упакованный в нуклеопротеиновый комплекс, окружен матриксным белком М1 и окружен липидной оболочкой, которая представляет собой фрагмент билипидного слоя мембраны хозяйской клетки, содержащий вирусные белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA) и белок М2 [189]. Гемагглютинин и нейраминидаза являются основными антигенными детерминантами вируса, и вариации в их структуре приводят к появлению новых эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа. На настоящий момент насчитывается 18 сероподтипов гемагглютинина и 11 – нейраминидазы [350]. В вирионе также присутствует NEP (ранее обозначавшийся как NS2), в комплексе с белком M1 [356].

Загрузка...

1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа Вход вириона гриппа в клетку происходит после взаимодействия гемагглютинина с рецептором клеточной поверхности, содержащим сиаловую кислоту [297]. После связывания с рецептором, вирус попадает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в клатрин-окаймленной везикуле. Снижение рН внутри эндосомы до значений 5,0-6,0 вызывает структурные изменения в молекуле гемагглютинина, приводящие к слиянию оболочки вируса с мембраной эндосомы, в результате чего вирион попадает в цитоплазму [151].

Для обеспечения слияния, молекула гемагглютинина HA0 подвергается расщеплению на субъединицы НА1 и НА2, что обеспечивает освобождение пептида слияния, расположенного на N-конце субъединицы НА2.

Белок M2, минорный компонент оболочки вируса гриппа, является протонной помпой, пропускающей ионы Н+ внутрь оболочки вируса до слияния мембран, обеспечивая диссоциацию М1-капсида от рибонуклеопротеинового комплекса [342], что обеспечивает эффективный транспорт генетического материала вируса в цитоплазму зараженной клетки.

Далее генетический материал транспортируется в ядро клетки, за счет взаимодействия белка NP вируса с компонентами клеточного цитоскелета [246].

В ядре клетки генетический материал вируса транскрибируется вирусной РНКзависимой РНК-полимеразой с получением мРНК, на основе которых производится синтез вирусных белков [147]. В процессе репликации вируса с генетических сегментов, состоящих из антисмысловой РНК, вирусной полимеразой считываются смысловые копии, которые служат матрицей для синтеза антисмысловых генетических сегментов, предназначенных для упаковки в новые вирионы, что также осуществляется РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса [262].

Сборка вирионов начинается в ядре клетки с присоединения NP к сегментам РНК и формирования рибонуклеопротеиновых комплексов. Отдельные белки NP формируют комплексы, вокруг которых происходит упаковка РНК-сегмента. Концевые участки РНК содержат сигналы упаковки, обеспечивающие упаковку сегментов в вирион. Каким образом детерминируется состав сегментов в вирионе при упаковке, до сих пор неизвестно точно, но предполагается, что процесс детерминируется РНК-РНК взаимодействиями между сегментами, поскольку зрелые вирионы вируса гриппа редко содержат неправильный или избыточный набор генетических сегментов [161]. Для окончательной сборки вириона упакованный в рибонуклеопротеиновый комплекс генетический материал покидает ядро клетки, в данном процессе задействованы белки NEP и M1. Далее нуклеокапсид, в комплексе с белком NEP, перемещается к области raft-микродоменов мембраны и там выходит из клетки, в процессе выхода приобретая оболочку, в которой содержатся белки HA, NA и M2 [241]. Основную роль в процессе отпочковывания от мембраны играет белок М1, который взаимодействует с мембраной клетки N-концевым доменом [361].

Для окончательного освобождения вириона необходима работа нейраминизады: она предотвращает агрегацию вирионов непосредственно после выхода и разрушает связь между сиало-содержащими рецепторами клеточной поверхности и высвобождающимися вирионами [203].

1.2. Белки вируса гриппа 1.2.1 Белки полимеразного комплекса (PB2, PB1, PA) РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гриппа представляет собой гетеротример, состоящий из двух основных (PB1, PB2) и одного кислого белка (PA) [68]. Молекулярный вес комплекса составляет около 250 кДа [205]. Субъединицы гетеротримера плотно упакованы в структуру с полостью внутри. При взаимодействии с субстратом комплекс претерпевает конформационные изменения. Центральным компонентом полимеразного комплекса является белок PB1, который взаимодействует с двумя другими субъединицами. PB1 взаимодействует с вирусным промотором, осуществляет элонгацию РНК и отщепление кэпа [82]. Субъединица PB2 необходима для осуществления транскрипции вирусной РНК [201], а также имеет кэпсвязывающий сайт [120]. PA необходим для репликации и транскрипции, а также участвует в эндонуколеазном отщеплении кэпированного РНК-праймера Для эффективной [205].

транскрипции и репликации вируса требуется участие всех трех субъединиц комплекса.

Мутации в белках полимеразного комплекса могут привести к значительным изменениям в реализации жизненного цикла вируса. Так, лизин в позиции 627 PB2, обнаруженный у птичьих штаммов гриппа, приводит к изменению температурного оптимума работы полимеразного комплекса, что связано с изменением вирулентности штаммов [294].

Тирозин в позиции 436 PB2, треонин в позиции 515 PA приводят к изменению вирулентности вирусов в популяциях водоплавающих птиц [205].

Отдельные аттенуирующие замены в белках полимеразного комплекса описаны для холодоадаптированных доноров живой гриппозной вакцины [157, 181].

1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа – гемагглютинин и нейраминидаза

1.2.2.1 Гемагглютинин Строение гемагглютинина. Гемагглютинин вируса гриппа представляет собой интегральный белок липидной оболочки вируса. Он обеспечивает специфическое распознавание рецепторов, прикрепление вирусной частицы к рецепторам на поверхности клетки и плавление мембраны эндосомы для обеспечения выхода вирусной частицы в цитоплазму клетки [297].

Гемагглютинин - гомотример, трансмембранный гликопротеин I типа, цилиндрической формы, размером примерно 135 в высоту и 35–70 в радиусе. Каждый мономер состоит из глобулярной головки и ножки, в негликозилированной форме молекулярная масса мономера около 60 кДа. Глобулярный домен полностью принадлежит субъединице НА1, ножка состоит из частей, принадлежащих как субъединице НА1, так и субъединице НА2 [299]. До расщепления на цепи HA1 и HA2 каждый мономер представляет собой единую цепь НА0. В процессе синтеза НА0 котрансляционно транспортируется в эндоплазматический ретикулум, затем через систему цистерн комплекса Гольджи транспортируется на плазматическую мембрану. HA0 расщепляется на субъединицы HA1 (327 аминокислот) и HA2 (222 аминокислоты), соединенные дисульфидными мостиками. Свободные концы в сайте расщепления (С-конец НА1 и N-конец НА2) отстоят друг от друга на расстояние 20. В молекуле НА0 в сайте расщепления большая часть вирусов гриппа содержит остаток аргинина, у высокопатогенных штаммов птичьего гриппа в данном участке располагается ряд остатков положительно заряженных аминокислот [303].

Каждый мономер заякорен в мембране спирально уложенным трансмембранным пептидом длиной 27-28 аминокислот, расположенным в области С-конца каждой из цепей НА2, последние 10 аминокислот формируют короткий участок, расположенный в цитозоле [346].

Глобулярные участки гемагглютинина сформированы аминокислотными остатками НА1 116 –261, уложенными в «jelly-roll»-мотив из 8 антипараллельных слоев. Дистальные концы глобулярных участков содержат высококонсервативные рецептор-связывающие карманы, вокруг которых располагаются высоко вариабельные антигенные сайты [167, 340]. Оставшиеся части НА1 входят в структуру ножки в основном в составе -слоев. HA2, которая формирует основную часть ножки, уложена преимущественно в спиральную структуру длиной 80.

Первые 20 аминокислот субъединицы HA2 представляют собой гидрофобный пептид слияния, необходимый для выхода вируса из эндосомы [167]. Строение пептида слияния является важной детерминантой патогенности вируса гриппа и мутации в данной области влияют на фузогенную активность гемагглютинина и, соответственно, эффективность запуска инфекционного цикла вируса [347]. Пептид слияния богат глицином, что обеспечивает достаточную гибкость в данном участке При нейтральном рН, N-концы пептидов слияния расположены в пространстве между субъединицами тримера в трансмембранном участке. При снижении рН участок претерпевает конформационные изменения, необходимые для установления контакта между гидрофобными областями мембраны эндосомы и молекулы гемагглютинина [167].

олигосахариды, оказывающие значительное влияние на функции N-связанные гемагглютинина, обнаружены в глобулярном домене и в ножке тримера. В глобулярной части расположение сайтов гликозилирования вариабельно, в ножке, как в субъединице НА1, так и в субъединице НА2 – более консервативно [288, 328].

Рецепторный карман. Рецепторный карман вируса гриппа, расположенный в глобулярной части, служит для специфического распознавания рецепторов на клеточной поверхности и связывания с ними. Клеточными рецепторами вируса гриппа являются терминальные остатки сиаловой кислоты [340]. Рецепторный карман сформирован петлями 120, 130, 150, 220 и спиралью 190 [242]. Аминокислотные остатки, формирующие рецепторный карман вируса гриппа, консервативны среди разных подтипов вируса гриппа. Структурные исследования позволили установить роль отдельных аминокислотных остатков во взаимодействии с рецептором в рецепторном кармане: на рисунке 1 видно ориентацию остатка сиаловой кислоты в рецепторном кармане, показаны водородные связи между молекулой сиаловой кислоты и аминокислотными остатками рецепторного кармана [216].

Рисунок 1. Схематическое изображение рецептор-связывающего сайта гемагглютинина, взаимодействующего с аналогом рецептора вируса гриппа с указанием ключевых позиций, участвующих во взаимодействии с рецептором и водородных связей между отдельными аминокислотными остатками и аналогом рецептора.

Желтым показан остаток сиаловой кислоты, серый – участки молекулы гемагглютинина. Красным показаны атомы кислорода, темно-синим – атомы азота. Водородные связи обозначены пунктирными линиями. Иллюстрация из статьи [216] Консервативный остаток серина 136 формирует водородную связь с карбоксильной группой, которая также соединена водородной связью с амидом пептидной связи 137, гистидин 183 и глутаминовая кислота 190 формируют водородные связи с 9-гидроксильной группой, тирозин 98 соединен водородной связью с 8-гидроксильной группой. 5-ацетамидо азот формирует водородную связь с пептидной связью 135, и метильная группа данного остатка участвует в Ван-дер-Ваальсовом взаимодействии с 6-членным кольцом триптофана 153. 7гидроксильная группа и ацетамидокарбонил водород связаны водородной связью и формируют Ван-дер-Ваальсово взаимодействие с остатком лейцина 194 [297, 340]. Участие данных функциональных групп во взаимодействии подтверждено структурными исследованиями [340], а также исследованиями свойств белков с мутациями в ключевых аминокислотных позициях [131]. На связывание с эритроцитами влияли замены только в трех из перечисленных аминокислотных позиций: Y98F, H183F, и L194A. Эти результаты подтверждают важность водородной связи Tyr98 с 8-гидроксильной группой сиаловой кислоты и неполярный контакт Leu194 с N-ацетил-метильной группой. His183 формирует водородные связи с Tyr98, а также с 9гидроксильной группой сиаловой кислоты. Trp153 и Tyr195, формирующие часть сети водородных связей, наряду с His183 и Tyr98, могут быть замещены фенилаланином, вследствие чего наступает только частичное ингибирование связывания [297].

Гемагглютинин вируса гриппа имеет специфичность к связи, которой остаток сиаловой кислоты соединен с остатком галактозы. В природе встречаются два основных типа связи:

Neu5Ac-(2,3)-Gal и Neu5Ac-(2,6)-Gal. Гемагглютинины разных подтипов вирусов имеют разное сродство к этим связям: вирусы гриппа птиц присоединяются преимущественно к остаткам, присоединенным -2,3 связью, вирусы гриппа человека предпочитают -2,6 связь [279]. За смену рецепторной специфичности вирусов Н2, Н3, Н6 отвечают аминокислотные остатки в позициях 226 и 228 [98], у вирусов подтипа Н1N1 – остатки 190 и 225 [126], у вирусов гриппа В

– аминокислотный остаток 198 [335]. Структурные исследования показали, что, хотя аминокислоты в указанных позициях не взаимодействуют с остатком сиаловой кислоты напрямую, при возникновении аминокислотных замен в ключевых позициях изменяется конформация рецептор-связывающего кармана, что изменяет аффинность к рецептору [278].

Антигенные сайты НА. Вокруг консервативного рецепторного кармана расположена высоко вариабельная область, постоянно изменяющаяся под действием иммунного пресса – антигенные сайты гемагглютинина [297].

У вирусов подтипа H3N2 описаны антигенные сайты A, B, C, D, E [357]. Для вирусов подтипа Н1 описано 4 основных антигенных сайта в головке гемагглютинина – Ca, Cb, Sa и Sb [94, 242]. У пандемического вируса A/California/07/09 в состав антигенного сайта Sa входит 13 аминокислот, Sb – 12, Ca – 19 аминокислот, Cb – 6. На рисунке 2 показано расположение основных антигенных сайтов в молекуле гемагглютинина подтипа Н1.

В состав антигенных сайтов входят аминокислотные остатки, локализованные в глобулярной части молекулы гемагглютинина, формирующие ее поверхность. Общей чертой антигенных сайтов является петлеобразная структура, изменения в которой возможны без влияния на остальные части молекулы гемагглютинина, а также наличие сайтов гликозилирования [297]. Присоединение олигосахаридов позволяет уйти от воздействия иммунного ответа. Это может происходить двумя путями: во-первых, часть поверхности гемагглютинина покрыта углеводными цепями, приобретенными в клетке хозяина, которые являются для организма «своими» и маскируют вирусный белок ; во-вторых, в процессе антигенного дрейфа отдельные сайты гликозилирования исчезают, другие появляются, что сильно изменяет поверхность гемагглютинина.

Рисунок 2. Схема расположения антигенных сайтов Sa, Sb, Ca и Cb в молекуле гемагглютинина подтипа Н1.

Слева – вид со стороны одного из мономеров гемагглютинина, справа – вид со стороны верхней части молекулы. Антигенные сайты обозначены цветом и подписаны на рисунке. Область рецепторного кармана гемагглютинина обведена на правом рисунке. Иллюстрация из [242].

1.2.2.2 Нейраминидаза (NA) Нейраминидаза (NA) – второй поверхностный белок вируса гриппа, представляющий собой трансмембранный гликопротеин с энзиматической активностью. Нейраминидаза расщепляет -2,3 или -2,6 связь между остатком концевой сиаловой кислоты и гликопротеином вируса или клетки хозяина. Это является обязательным условием для эффективного распространения вируса: в случае блокирования нейраминидазной активности, вирионы агрегируют, присоединяясь к остаткам сиаловых кислот клеточных гликопротеинов [229]. Показана также роль нейраминидазы в деградации сиало-содержащих компонентов муцина в дыхательных путях, что позволяет вирусной частице попадать к клеткам эпителия и эффективно прикрепляться к рецепторам [222].

Ген, кодирующий нейраминидазу, имеет длину около 1413 нуклеотидов и кодирует белок, в среднем состоящий из 470 аминокислотных остатков. Анализ последовательности белка нейраминидазы разных подтипов вируса гриппа А, выполненный на основе белков подтипов N1-N9, выявил вариации размера. В основном последовательность белка насчитывала 469-470 аминокислот, всего длина последовательности насчитывала от 453 до 471 аминокислоты. 102 аминокислоты были консервативны внутри вирусов гриппа А, 76 – среди вирусов гриппа как А, так и В [65].

Строение нейраминидазы. По форме белок представляет собой гомотетрамер грибовидной формы обладающий [325], N-ацетил-нейраминозил-гликогидролазной активностью. В молекуле нейраминидазы выделяют четыре основных региона, включая гидрофильную терминальную часть на N-конце, гидрофобный трансмембранный домен, область ножки и глобулярную головку, которая содержит активный центр белка [107].

Гидрофильный хвост состоит из шести аминокислотных остатков (MNPNQK), которые высоко консервативны среди большей части вирусов гриппа А, за исключением некоторых вариантов подтипа N1 свиного происхождения. Последовательность трансмембранного домена у белков вирусов разных подтипов значительно отличается, но в регионе между 8 и 37 аминокислотным остатком обычно располагается гидрофобный участок. Область ножки также высоко вариабельна, но в структуре белка, относящегося к любому подтипу, обычно имеется гидрофильная область длиной около 30 аминокислот. В данном гидрофильном участке могут прослеживаться обширные делеции (чаще всего – в популяциях домашней птицы), наличие которых не влияет на характер течения инфекции. [210]. Глобулярная головка содержит наибольшее количество консервативных аминокислотных остатков, в том числе формирующих активный центр белка [183]. В целом, глобулярная часть более консервативнаа, чем ножка и трансмембранная часть [106]. В молекуле нейраминидазы имеется как минимум 5 потенциальных сайтов гликозилирования [325].

Головка представляет собой консервативную структуру, напоминающую 6-лопастной пропеллер, каждая лопасть которого представлена четырьмя антипараллельныхми беталистами, стабилизированными дисульфидными мостиками и соединенными петлями вариабельной длины [65]. По пространственному строению головки нейраминидазы выделяют две основные группы белков: к первой группе относятся нейраминидазы подтипов N1, N4, N5 и N8, ко второй - N2, N3, N6, N7 и N9. В структуре нейраминидазы вирусов в группе 1 была обнаружена значительных размеров полость вблизи от активного центра, отсутствующая в кристаллических структурах нейраминидаз второй группы. Полость образуется за счет сдвигания «петли 150» (аминокислотные остатки 147–152) [65].

Активный центр нейраминидазы сформирован 21 аминокислотой, данная область высоко консервативна среди вирусов гриппа А и В, как по последовательности нуклеотидов, так и по пространственным характеристикам [65]. При присоединении субстрата наблюдается незначительное изменение конформации. 11 консервативных аминокислот контактируют с субстратом, еще 6 консервативных аминокислот формируют «вторую створку» [88], которая удерживает на месте остатки, формирующие активный центр.

Субстратная специфичность нейраминидазы по отношению к связи, которой присоединен остаток сиаловой кислоты, зависит от происхождения вируса, и обычно совпадает с рецепторной специфичностью гемагглютинина [327], хотя и не является настолько однозначной: нейраминидазы вирусов гриппа свиней и человека более аффинны к связи -2,6, нейраминидазы птичьих вирусов предпочитают -2,3 связь [309]. Замена изолейцина на валин в позиции 275 (подтип N2) приводит к повышению аффинности к -2,6 связи [183].

В вирионе отдельные мономеры нейраминидазы формируют нековалентно связанные гомотетрамеры, но энзиматической активностью обладают и отдельные мономеры, а также глобулярная часть, искусственно отделенная от ножки и трансмембранного домена. Область ножки играет значительную роль в отпочковывании вирионов: вирусы с делециями в ножке имеют сниженную энзиматическую активность, что в случае значительных изменений, приводит к аггрегации вирионов на клеточной поверхности, в основном влияя на эффективность распространения вируса [106].

Антигенные сайты в молекуле нейраминидазы. Гуморальный иммунный ответ против поверхностных антигенов вируса гриппа направлен прежде всего против гемагглютинина – наиболее многочисленного белка поверхностной оболочки вируса. Антитела к нейраминидазе не предотвращают прикрепление вируса к клеткам, тем не менее, роль антинейраминидазных антител в блокировании инфекции показана путем анализа мутантных по отдельным позициям штаммов [139, 284]. На животной модели показана роль антинейраминидазных антител в защите от летальной инфекции [339]. Исследования сывороток крови лиц, перенесших гриппозную инфекцию, либо вакцинированных противогриппозными препаратами, выявили наличие антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с нейраминидазой шифтовых вариантов вирусов [52-54].

Также, как и в случае гемагглютинина, антинейраминидазные антитела присоединяются к конформационным эпитопам, расположенным на поверхности молекулы. Картирование антигенных эпитопов, производилось разными исследователями с использованием отбора escape-мутантов под действием моноклональных антител. Позиции аминокислот, замены в которых приводили к устойчивости к моноклональным антителам, оказались сходны в молекулах нейраминидазы разных подтипов [297]. Функцию нейраминидазы угнетают антитела, образующиеся к областям, расположенным в непосредственной близи от активного центра фермента. При воздействии препарата антинейраминидазных антител прикрепление и вход вируса в клетку происходит, инфекция блокируется на уровне выхода вирионов из клетки [312].

В молекулах нейраминидаз подтипов N2 [338] и N9 [194] описан ряд эпитопов, к которым образуются нейтрализующие нейраминидазную активность антитела: все эпитопы расположены в пределах области 329-403. [139] на модели штамма A/Memphis/31/98 (H3N2) также показали, что с противоположной стороны от области 329-403 расположен эпитоп, включающий вариабельные позиции 199, 220 и 221. Fanning с соавт. [119] в результате анализа последовательностей генов нейраминидазы было показано, что аминокислотные остатки 197 и 199 являются вариабельными и «филогенетически значимыми» в нейраминидазах подтипа N2.

По данным [119], аминокислотный остаток 198 был консервативен внутри нейраминидаз подтипа N2. Замена в позиции 198, по данным [139], приводила к существенному снижению активности нейраминидазы, а мутации в позициях 199, 220, и 221 не влияли на активность фермента.

Вариабельными областями «головки» нейраминидазы вируса A/Memphis/31/98 (H3N2) являлись аминокислотные остатки с 140 по 155, с 328 по 370, и в меньшей степени с 381 по 403.

Анализ последовательностей нейраминидазы человеческих изолятов вирусов подтипов H2N2 и H3N2 с 1957 по 1998 год показал, что регион с 328 по 370 аминокислотный остаток был высоко вариабелен [139].

В структуре ножки нейраминидазы также описаны вариабельные участки, не вовлеченные во взаимодействие с нейтрализующими антителами [116].

1.2.3 Нуклеопротеин (NP) Нуклеопротеин кодируется пятым сегментом генома, длиной около 1565 нуклеотидов.

Белок имеет длину 498 аминокислот, богат остатками положительно заряженных аминокислот.

У вирусов гриппа В и С соответствующий белок имеет длину 560 и 565 аминокислот [206, 239].

Отдельные молекулы нуклеопротеина способны к олигомеризации и при сборке вириона формируют олигомерные тяжи, с помощью которых происходит упаковка РНК вируса.

Нуклеопротеин входит в вирион в составе рибонуклеопротеинового комплекса [243].

Белок NP состоит из двух доменов: головки и основного домена, а также концевого петлеобразного региона. Головной домен более консервативен, чем основной. При олигомеризации консервативный петлеобразный конец входит в паз, расположенный на другой молекуле NP. РНК-связывающий домен высоко консервативен и включает в себя выступающий фрагмент и гибкую петлю между головным и основным доменом белка. Сравнение последовательности гена NP вирусов гриппа А (более 2500 штаммов) выявило полиморфизм по 30,1 % аминокислотным остаткам [243]. NP взаимодействует с большим количеством макромолекул, как вирусного происхождения, так и клеточного. Кроме связывания с одноцепочечной РНК, он взаимодействует также с полимеразными белками PB1 и PB2, входящими в состав рибонуклеопротеина, а также с капсидным белком М1. Также была показана способность к взаимодействию NP с компонентами клетки: ядерными импортинами (А-класс), F-актином и рядом других молекул [261].

Нуклеопротеин играет важнейшую роль в активации клеточного звена иммунного ответа [137]. ЦТЛ-ответ на NP характеризуется достаточно широкой кросс-реактивностью по отношению как к сезонным, так и пандемическим вирусам гриппа, поскольку ответ часто развивается на наиболее консервативные области белка [137, 305]. В экспериментах на животных, а также по результатам отдельных исследований клинических случаев была показана кросс-реактивность NP-специфичных CD8+ Т-клеток при заражении вирусами гриппа подтипов H1N1, H7N7, H3N2 и H5N1 [117, 185, 195, 224].

1.2.4 M1 и М2 белки Седьмой сегмент генома кодирует белки М1 и М2.

М1 – белок вирусного капсида, формирующий оболочку вириона. В структуре вириона белок М1 взаимодействует с липидным бислоем, связан с верхней частью белка М2, а также взаимодействует с гемагглютинином [66].

Белок М1 состоит из двух глобулярных доменов, в которых выделяют РНКсвязывающий участок, область связывания с липидами, и участок, отвечающий за регуляцию транскрипции [291]. Белок М1 несет сигнал ядерной локализации, необходимый для осуществления ядерного транспорта вирусного генома, упакованного в рибонуклеопротеин, связанный с М1 [217]. При повышении концентрации белка М1, он выступает как ингибитор транскрипции вирусных РНК [76]. М1 участвует в самосборке вирионов, осуществляя взаимодействие с вирусным РНП, а также с белками оболочки вируса [66].

Белок М2 – протонная помпа поверхностной оболочки вируса гриппа. По структуре М2 представляет собой тетрамер, встроенный в липидную оболочку вируса [285]. При снижении рН после попадания вируса гриппа в эндосому белок М2 осуществляет транспорт протонов внутрь оболочки вируса, что вызывает диссоциацию рибонуклеокапсида от белка М1.

Происходит изменение конформации гемагглютинина с последующим протеолизом, что приводит к освобождению пептида слияния [285]. M2 является мишенью противигориппозных препаратов амантаданового ряда [92] и основой для разработки универсальных вакцин [118].

1.2.5 Неструктурные белки Белок PB1-F2 кодируется вторым сегментом генома, дополнительной рамкой считывания [360]. Белок имеет длину около 87 аминокислот и представляет собой трансмембранный белок, несущий сигнал митохондриальной локализации. Была продемонстрирована роль белка PB1-F2 в запуске апоптоза клетки: белок олигомеризуется в мембране митохондрий, образуя поры, что приводит к деполяризации мембран из-за перераспределения протонов и выбросу цитохрома С в цитоплазму клетки, что является сигналом к запуску апоптоза [95, 129, 359]. Предполагается тканевая специфичность экспрессии PB1-F2: данный белок активно синтезируется в макрофагах, запуская клеточную гибель [104].

Восьмой сегмент генома кодирует неструктурные белки NS1 и NS2 (NEP).

NS1 – один из наиболее обильных белков, синтезирующихся в инфицированной клетке.

Его длина 227-237 аминокислот. На N-конце данный белок содержит РНК-связывающий домен [334]. NS1 связывает мРНК клетки-хозяина, препятствуя их выходу из ядра, а также подавляет их сплайсинг [202]. Также показано, что NS1 взаимодействует с фактором инициации трансляции eIF4GI, увеличивая эффективность трансляции вирусных мРНК [87]. Также показана роль NS1 в подавлении индукции синтеза интерферонов типа I [184] и в запуске апоптоза клетки [142].

NS2 (NEP) - белок, участвующий в транспорте вирусного РНП из ядра с использованием транспортных систем клетки [247]. Была показана также роль данного белка в регуляции транскрипции и репликации вирусного генома [276].

1.3 Специфический иммунитет к вирусу гриппа и ЖГВ Устойчивость к гриппозной инфекции возникает за счет как местного, так и системного иммунного ответа. Антитела, секретируемые в верхнем респираторном тракте, являются основным фактором устойчивости к гриппозной инфекции [33]. Секреторный иммуноглобулин А вовлечен в защиту в верхнем респираторном тракте, сывороточные IgG – в нижнем респираторном тракте [35]. Иммунный ответ, возникающий в результате инфекции, защищает от реинфицирования тем же штаммом, либо антигенно близким вариантом [34, 282].

Естественная инфекция может вызвать длительную устойчивость, что было показано в исследовании, посвященном изучению появляения гриппа подтипа H1N1 в 1977 году, когда инфицированы оказались только молодые люди в возрасте до 20 лет [263]. Но поскольку вирус гриппа подвержен резким и непредсказуемым изменениям, иммунитет после перенесенной инфекции может защищать от гриппозной инфекции и непродолжительное время – несколько лет до появления антигенно новых штаммов [37, 283]. Гуморальный иммунный ответ, как местный, так и системный, играет ведущую роль в защите от инфекции, а клеточноопосредованный иммунный ответ действует на этапе уничтожения зараженных вирусом клеток при инфицировании [109].

При инфицировании человека вирусом гриппа, антитела образуются ко всем основным белкам вируса [111, 265]. Основную роль в защите от инфекции играют антитела к поверхностным гликопротеинам (НА, NA), тем не менее, образуются антитела и к консервативным антигенам M и NP, которые не являются вирус-нейтрализующими [71].

Напротив, цитотоксический Т-клеточный ответ в основном направлен против «внутренних»

белков вируса - M и NP.

1.3.1 Гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа и ЖГВ Гуморальный иммунный ответ на гриппозную инфекцию заключается в формировании антител против различных антигенов вируса гриппа. Антитела против гемагглютинина наиболее важны для нейтрализации вируса и предотвращения заболевания [10].

Антинейраминидазные антитела менее эффективны на этапе предотвращения инфекции, но сдерживают ее развитие, препятствуя высвобождению вируса из инфицированных клеток [109]. Поскольку штаммы ЖГВ представляют собой аттенуированные вирусы гриппа, иммунный ответ при вакцинации развивается по тому же механизму, что и при естественной инфекции [8-9, 33, 41].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |
 
Похожие работы:

«ПОРЫВАЕВА Антонина Павловна ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.02 Вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Глинских Нина Поликарповна Екатеринбург 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«ПОДОЛЬНИКОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА МОЛОКА КОРОВ УРБАНИЗИРОВАННОЙ ТЕРРИТОРИИ (НА ПРИМЕРЕ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность: 03.02.08 – экология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Заслуженный работник высшей школы РФ доктор...»

«Храмцов Павел Викторович ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович...»

«Кузнецова Наталья Владимировна СОВРЕМЕННОЕ ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РЕКИ ЯХРОМА КАК МОДЕЛЬНОЙ МАЛОЙ РЕКИ ПОДМОСКОВЬЯ 03.02.10 – гидробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Алексеев Иван Викторович РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСНОГО ИНЖЕНЕРНО-ГЕОЛОГИЧЕСКОГО И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА НА ЯКОВЛЕВСКОМ РУДНИКЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ВЕДЕНИЯ ОЧИСТНЫХ РАБОТ ПОД НЕОСУШЕННЫМИ ВОДОНОСНЫМИ ГОРИЗОНТАМИ Специальность 25.00.08 – Инженерная геология,...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Шемякина Анна Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА BETULA L. 03.02.14 – Биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Колесникова Р.Д. Хабаровск – 20 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЙ. 1.1 Общие...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.