WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

«ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Санкт-Петербургский государственный университет»

На правах рукописи

Галкин Алексей Петрович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИОНОВ И

АМИЛОИДОВ В ПРОТЕОМЕ ДРОЖЖЕЙ

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Специальность 03.02.07 – генетика



диссертация на соискание учной степени доктора биологических наук

Научный консультант:

Академик РАН С.Г. Инге-Вечтомов

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и 13 различия

1.1. Амилоиды

1.2. Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов 18

1.3.Функциональные и патологические амилоиды 27 1.3.1. Функциональные амилоиды 27 1.3.2. Патологические амилоиды 1.3.2.1. Системный амилоидоз АА 3 1.3.2.2. Латеральный склероз 1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера 32 1.3.2.4. Болезнь Хангтингтона 36

1.4. Прионы 1.4.1. Прионы млекопитающих 37 1.4.1.1. Прионный белок PrP 37 1.4.1.2. Альфа – синуклеин 1.4.1.2.Белок tau 1.4.2. Прионы низших эукариот 42 1.4.2.1. Фактор [URE3] 1.4.2.2. Фактор [PSI+] 1.4.2.3. Фактор [PIN+] 1.4.2.4. Фактор [SWI+] 1.4.2.5. Факторы [ISP+], [MOT3+], [OCT+] и [MOD+] 50 1.4.2.6. Факторы [] и [GAR+] 52 1.4.2.7. Фактор [Het-s] мицелиального гриба Podospora anserina 53 1.4.3. Функциональная значимость прионов 55

1.5. Взаимодействие прионов и амилоидов и влияние амилоидогенеза на 59 регуляцию протеомных сетей

1.6. Фундаментальные и методологические проблемы в исследовании 65 прионов и амилоидов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 68

2.2. Плазмиды

2.3. Методы дрожжевой генетики

2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 87

2.5. Метод бицистронной люминесценции 88

2.6. Флуоресцентная микроскопия

2.7. Иммунохимический анализ белков.

2.7.1. Выделение белка из дрожжей 9 2.7.2. Дифференциальное центрифугирование 93 2.7.3. Анализ устойчивости белков

–  –  –

3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляции 107 3.1.4. Прионные характеристики эпигенетического детерминанта [NSI+] 110 3.1.5. Генетический контроль проявления фактора [NSI+] 118 Выявление генов, изменение уровня экспрессии которых 118 3.1.5.1.

влияет на фенотипическое проявления [NSI+] 3.1.5.2. Скрининг детерминанта фактора [NSI+] и генов, сверхэкспрессия 121 которых вызывает нонсенс-супрессию в штамме [nsi-]

3.2. Идентификация инфекционных и неинфекционных амилоидов в 126 дрожжах S. cerevisiae методом «протеомного скрининга амилоидов»

3.2.1. Разработка и апробация метода «протеомного скрининга амилоидов» 126 3.2.2. Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме 137 [NSI+] 3.2.2.1. Идентификация белков, формирующих детергент-устойчивые 137 агрегаты в штамме [NSI+] 3.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+] 141

3.3. Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] 146

3.4. Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидных 154 агрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжей

3.5. Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivo 157 амилоидных агрегатов белка PrP с пептидом A в дрожжах S. cerevisiae

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Амилоиды представляют собой белковые полимеры, которые формируются за счт образования упорядоченных межмолекулярных бета-складчатых слов [по: Baxa, 2008]. Инфекционные амилоидные полимеры (прионы), в отличие от неинфекционных, расщепляются на олигомеры, которые в свою очередь способны присоединять и конвертировать новые мономеры белка в амилоидную изоформу [по: Галкин и др., 2006]. Прионы и неинфекционные амилоиды выявлены у самых разных организмов и, зачастую, их формирование вызывает цитотоксический эффект. Согласно медицинской классификации болезни, связанные с образованием межклеточных амилоидных агрегатов, принято называть «амилоидозами», тогда как патологии, которые определяются накоплением внутриклеточных амилоидов, относят к «амилоидозоподобным»





заболеваниям [Sipe et al., 2014]. К числу наиболее социально значимых амилоидных заболеваний относятся болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также прионные болезни. В настоящее время известно более 30 различных амилоидных заболеваний человека [Eisenberg and Jucker, 2012]. У дрожжей S. cerevisiae охарактеризовано восемь белков, которые могут формировать прионные агрегаты и вызывать наследуемые эпигенетические изменения, которые стабильно наследуются в ряду поколений [Нижников и др., 2015].

Открытие инфекционных амилоидов (прионов) у одноклеточных организмов привело к созданию новой концепции «белковой наследственности»

[Wickner, 1994]. Согласно этой концепции, в случае прионизации белок инактивируется или изменяет свои функции, что вызывает наследуемое изменение признака без каких бы то ни было изменений в геноме [Wickner, 1994].

Открытие прионов поколебало центральную догму биологии – в случае прионной конверсии перенос информации идт непосредственно от белка к белку [ИнгеВечтомов, 2013].

Актуальность исследования процесса амилоидогенеза связана также с тем, что возникновение одних амилоидов зачастую индуцирует агрегацию других амилоидогенных белков [Derkatch et al., 2001] и провоцирует глобальные изменения в регуляции протеомных взаимодействий [Nevzglyadova et al., 2009].

Работы последних лет свидетельствуют о том, что некоторые амилоиды могут выполнять жизненно-важные функции, в частности амилоидные конформеры CPEB и Orb2 регулируют долговременную память у Aplysia californica и Drosophila melanogaster, соответственно [Si et al., 2010; Mastushita-Sakai et al., 2010; Majumdar et al., 2012]. Несмотря на определнные успехи в исследовании амилоидогенеза, из-за отсутствия универсальных биохимических методов поиска амилоидов, имеющиеся данные носят разрозненный характер и не позволяют оценить распространнность и значимость амилоидов в живой природе. Наша работа посвящена решению таких актуальных задач, как идентификация амилоидов в масштабах протеома и анализ их взаимодействия in vivo.

Степень разработанности темы

Идентификация каждого нового приона или неинфекционного амилоида крайне трудомка и является заметным научным событием. У млекопитающих новые амилоиды выявляются либо в результате исследования биохимических свойств отдельных белков, либо вследствие анализа состава патологических белковых депозитов [Glenner et al., 1984; McKinley et al., 1983]. Дрожжевые прионные белки обычно выявляют в результате генетических скринингов факторов, стабильно передающихся в ряду поколений и демонстрирующих неменделевское наследование [Derkatch et al., 1997; 2001; Rogoza et al., 2010;

Suzuki et al., 2012]. С помощью генетических подходов можно выявлять лишь те белки, амилоидогенез которых вызывает видимые фенотипические изменения в конкретной модельной системе. Такой подход не является системным и не может дать полного представления о распространнности и значимости амилоидов в регуляции физиологических и патологических процессов. Прогресс в данном направлении исследований может обеспечить разработка универсального биохимического метода скрининга и идентификации инфекционных и неинфекционных амилоидов в протеоме различных организмов. Принцип для разработки биохимического метода выявления неизвестных амилоидов, основанный на их уникальной устойчивости к обработке додецилсульфатом натрия (SDS), был предложен в работе лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна [Kushnirov et al., 2006]. Этот подход позволил выявлять сверхпродуцирующиеся амилоидные белки, но оказался не достаточно чувствительным [Kushnirov et al., 2006]. Недавно подход, основанный на SDS-устойчивости амилоидных фибрилл, был усовершенствован, что позволило выявить некоторые глутамин-аспарагин обогащнные белки, образующие прионные агрегаты в дрожжах [Kryndushkin et al., 2013]. Вместе с тем, этот метод дат много ложно-позитивных результатов и его нельзя считать универсальным, поскольку известны амилоиды неустойчивые к обработке SDS [Kryndushkin et al., 2013].

Исследование взаимодействия амилоидов представляет особый интерес с биомедицинской точки зрения, поскольку экспериментально доказано, что возникновение патологических амилоидных агрегатов одного белка может способствовать амилоидогенезу других белков [Derkatch et al., 2001]. Показано, что индукции амилоидогенеза за счт взаимодействия мономеров одного белка с предсуществующим амилоидным агрегатом другого белка способствует сходство их аминокислотных последовательностей [Kovacs et al., 2002; Rank et al., 2002;

Giasson et al., 2003; Schwarze-Eicker et al., 2005]. Согласно предложенной модели, амилоиды являются «затравкой» для присоединения мономеров другого белка, что способствует физическому сближению мономеров, изменению конформации и агрегации [Derkatch et al., 2001]. Вместе с тем, теоретические предсказания такого рода взаимодействий на нынешнем уровне наших знаний невозможны.

Недавно было показано, что предсуществующие амилоидные агрегаты могут индуцировать агрегацию других белков не только за счт механизма «затравки».

Так, прионизация дрожжевого транскрипционного регулятора Mod5 способствует прионизации Sup35, хотя физически эти белки не взаимодействуют [Arslan et al., 2015]. Механизмы, определяющие такого рода взаимодействия, пока остаются неисследованными.

Изучение взаимодействия амилоидогенных белков в экспериментах на трансгенных животных сопряжено с определнными методическими сложностями, занимает много времени и требует больших материальных затрат.

Использование иммортализованных культур клеток для этих целей не всегда возможно, поскольку патологические амилоиды убивают клетки. Эксперименты in vitro безусловно помогают ответить на определнные вопросы, но имеют ряд ограничений, и их результаты не всегда воспроизводятся in vivo. Наибольший прогресс в исследованиях взаимодействий прионов и неинфекционных амилоидов in vivo достигнут благодаря использованию дрожжевой модельной системы [IngeVechtomov, 2011].

Цель и задачи работы Целью работы является идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в протеоме дрожжей, а также анализ взаимодействия амилоидогенных белков млекопитающих in vivo в дрожжевой модельной системе.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Выявление и характеристика новых наследуемых изменений признаков, опосредованных прионизацией белков дрожжей S. cerevisiae.

2. Идентификация белков, прионизация которых вызывает наследуемые изменения признаков.

3. Разработка универсального метода протеомного скрининга амилоидов и его использование для идентификации белков, образующих агрегаты, обладающие амилоидными свойствами.

4. Проверка адекватности дрожжевой модели для анализа взаимодействия белков млекопитающих, формирующих амилоидные агрегаты.

Научная новизна В результате проведнных исследований впервые показано, что взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] вызывает наследуемое изменение признака. Предложена гипотеза, объясняющая механизм прионных взаимодействий. Показано, что белки Rnq1 и Swi1 в прионной форме приобретают новую, ранее не охарактеризованную функциональную активность.

Выявлен список белков, которые демонстрируют амилоидные свойства in vivo и являются кандидатами на роль функциональных амилоидов дрожжей S. cerevisiae.

Разработана и успешно апробирована новая методология, позволяющая выявлять и идентифицировать прионы и неинфекционные амилоиды различных организмов. В дрожжевой модельной системе выявлены аминокислотные последовательности прионного белка млекопитающих, ответственные за взаимодействие патогенных агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета (A), агрегация которого связана с болезнью Альцгеймера.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе результаты дополняют теорию белковой наследственности. Предложена концепция, согласно которой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другими компонентами протеомной сети, вызывают наследуемые изменения признаков. Показано, что эффекты функционального взаимодействия прионов могут быть описаны в рамках традиционной классификации генных взаимодействий. Охарактеризованное в нашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] в дрожжах может являться удобной модельной системой для исследования закономерностей, определяющих взаимодействие амилоидов человека, вызывающих социально-значимые амилоидные заболевания. Теоретическая значимость работы определяется также выявлением в протеоме дрожжей S. cerevisiae ряда белков, являющихся потенциальными кандидатами на роль функциональных амилоидов.

Практическая значимость работы определяется тем, что разработанная методология протеомного скрининга амилоидов открывает широкие перспективы для выявления функциональных и патологических амилоидов у различных биологических объектов и позволяет оценить распространнность и значимость явлений прионогенеза и амилоидогенеза в живой природе. В частности, разработанный нами подход может быть использован для выявления ещ не охарактеризованных амилоидов, вызывающих заболевания человека, этиология которых пока неизвестна. Выявление аминокислотных последовательностей прионного белка млекопитающих, ответственных за регуляцию физического связывания патологических агрегатов этого белка с амилоидным пептидом бета, может иметь значение для разработки новых подходов к лечению и предотвращению амилоидных заболеваний.

Методология и методы исследования

В работе использованы стандартные методы классической и молекулярной генетики дрожжей и разработаны новые подходы для протеомного скрининга и идентификации амилоидов у различных организмов. В частности, в работе использовали классические методы культивирования E.coli и S. cerevisiae [Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990], стандартный набор методов генной инженерии [Sambrook et al., 1989], различные вариации методов выделения белка, электрофореза в агарозном и акриламидном геле, Вестерн-блот гибридизации [Rubel et al., 2013]. Для сравнительного анализа уровня транскрипции исследуемых генов, а также для оценки эффективности терминации трансляции, использовали методы ПЦР в реальном времени [Livak and Schmittgen, 2001] и бицистронной люминесценции [Valouev et al. 2009], соответственно. Для анализа взаимодействия амилоидных белков in vivo применяли методы флуоресцентной микроскопии и метод FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [Roszik et al., 2013]. Вычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнение выборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили при помощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0. (“StatSoft Inc.”, США).

Разработана новая методология для выявления и идентификации в масштабах протеома белков, формирующих амилоидные агрегаты in vivo. Этот подход объединяет ряд биохимических и протеомных методов, в частности, ультрацентрифугирование белкового лизата, очистку фракции детергентустойчивых белковых агрегатов, двумерный электрофорез окрашенных флуорохромами белков, расщепление сложных белковых смесей на пептиды, их разделение методом и идентификацию белков методом массHPLC спектрометрии.

Положения, выносимые на защиту Дополнена теория белковой наследственности – установлено, что 1.

взаимодействие прионов может вызывать наследуемые изменения признаков.

Белки Rnq1 и Swi1 в результате прионизации приобретают новую 2.

функциональную активность.

С помощью новой методологии в протеоме S. cerevisiae идентифицированы 3.

белки, демонстрирующие амилоидные свойства и являющиеся кандидатами на роль функциональных амилоидов.

4. Показана адекватность использования дрожжевой модели для исследования агрегации и взаимодействия гетерологичных амилоидов.

Степень достоверности и апробация результатов Полученные результаты достоверны и были представлены в виде устных докладов на следующих российских и международных конференциях:

«Нобелевские чтения» 2003, Санкт-Петербург; XXI th YGM Conference, 2003, Гетеборг, Швеция; 2-я конф. МОГиС «Актуальные проблемы современной генетики», 2003, Москва; “Prion 2006”, Турин, Италия; V съезд ВОГиС, 2009, Москва; «Нейронаука для медицины и психологии», 2012, Судак, Украина; FEBS Congress, 2013, Санкт-Петербург; VI Съезд ВОГиС, 2014, Ростов-на-Дону. Кроме того, результаты представлены в виде стендовых сообщений на других международных конференциях и опубликованы в виде тезисов. Результаты представлены также в докладах на заседании президиума Санкт-Петербургского научного центра РАН в 2011 г, на заседании по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», 2010, Москва, в приглашнном докладе в Georgia institute of Technology, США, 2008 и на научных семинарах кафедры генетики и биотехнологии СПбГУ.

Результаты опубликованы в тринадцати научных статьях в международных и отечественных рецензируемых журналах и включены в главу монографии.

Оформлен патент на изобретение РФ №- 2294964.

13 Глава1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Амилоиды и прионы – сходства и различия

–  –  –

Исходно термин «амилоид» (крахмалоподобный) был предложен Матиасом Шлейденом в 1838 году для описания конгломератов крахмала, в норме присутствующих в клетках растений [по: Sipe and Cohen, 2000]. Рудольф Людвиг Карл Вирхов в 1854 году распространил этот термин для описания патологических отложений в печени, которые подобно крахмалу окрашивались йодом [по: Andree and Sedivy, 2005]. Достаточно скоро стало понятно, что амилоидные включения, формирующиеся в различных органах и тканях человека, не содержат вещества сходного с крахмалом [Sipe and Cohen, 2000].

Молекулярная природа амилоидов стала окончательно понятна относительно недавно, после внедрения в медицину и биологию метода тврдофазного ядерного магнитного резонанса.

С точки зрения молекулярной биологии амилоиды представляют собой упорядоченные белковые фибриллы, в которых бета-складчатые листы формируются за счт образования межмолекулярных водородных связей. В результате присоединения к амилоидному олигомеру новых мономеров образуются поперечно исчерченные протофибриллы, которые объединяются в фибриллы и крупные амилоидные агрегаты. Межмолекулярные связи образуют одни и те же последовательности взаимодействующих мономеров, что определяет упорядоченность амилоидных агрегатов [Kajava et al., 2010]. Вместе с тем, трактовка термина «амилоид» по-прежнему неоднозначна. Фибриллы амилоидогенного белка обычно связывают ряд других белков, в том числе протеогликаны, что и объясняет окрашивание амилоидов йодом [Snow et al., 1994]. В связи с этим, зачастую в биомедицинской литературе амилоидами называют весь комплекс белков, связанных с фибриллой амилоидогенного белка.

Более того, в соответствии с современной медицинской классификацией амилоидами принято считать лишь межклеточные агрегаты, которые окрашиваются амилоид-специфическими красителями [Sipe et al., 2014].

В отличие от медицины, для которой характерен оправданный консерватизм, определения, принятые в биохимии и молекулярной биологии, должны основываться на современных знаниях о молекулярных свойствах исследуемых соединений. Именно поэтому, последние пятнадцать лет в молекулярнобиологической литературе в качестве амилоидов принято рассматривать белковые фибриллы любых организмов, имеющие кросс-бета структуру, вне зависимости от ассоциированных с ними компонентов, а также от их внутриклеточной, межклеточной или внеклеточной локализации [Lansbury et al., 1995; Kajava et al., 2010; Shewmaker et al., 2011; Syed and Boles, 2014; Knowles et al., 2014]. В нашей работе, посвящнной идентификации и анализу взаимодействия амилоидов, мы будем придерживаться именно такой точки зрения.

Загрузка...

В качестве иллюстрации амилоидной структуры на рисунке 1 приведено схематическое изображение бета слов, образующихся в результате связывания двух мономеров в параллельной (рис. 1 А) и антипараллельной ориентации (рис. 1 Б). При образовании межмолекулярных бета структур карбоксильные и аминогруппы аминокислот взаимодействующих молекул белка формируют водородные связи [Kajava et al., 2010]. Вероятно, радикалы аминокислот в формировании таких связей не участвуют, но этот вопрос изучен не достаточно полно. Для большинства исследованных амилоидных структур с той или иной степенью достоверности доказана параллельная ориентация цепей (так называемая структура “parallel in register” [Wickner et al., 2010]. Вместе с тем, совсем недавно появились доказательства, что некоторые амилоиды формируют антипараллельные структуры [Gu et al., 2014]. Показано также, что амилоиды могут формировать структуру спирали [Van Melckebeke et al., 2010; Saupe, 2011].

В этом случае бета слой формируется за счт связывания N-терминальной последовательности одного мономера с C-терминальной последовательностью другого мономера.

Рисунок 1. Схематическое расположение мономеров одного и того же белка в параллельной (А) и антипараллельной (Б) ориентации в составе амилоидной фибриллы.

Водородные межмолекулярные связи обозначены красными чрточками.

Есть экспериментальные основания полагать, что последовательности, образующие бета слои, укладываются в виде так называемых «арок» (рис. 2), структура которых может стабилизироваться за счт внутримолекулярных взаимодействий Типичная амилоидная фибрилла [Kajava et al., 2010].

представляет собой гомополимер [Wickner et al., 2010], хотя нельзя исключать, что фибриллы могут включать мономеры другого белка, с гомологичными или сходными аминокислотными последовательностями.

Рисунок 2. «Арочная модель» укладки последовательностей, формирующих бета слои.

[по Kajava et al., 2010].

Следует отметить, что наряду с альфа спиралью, бета слои являются одной из форм укладки белка, и большинство белков содержит последовательности, формирующие такие вторичные структуры. Уникальность амилоидов заключается в том, что они образуются за счт формирования не внутримолекулярных, а межмолекулярных упорядоченных бета слов. Нередко приходится встречать утверждение - «любой белок может формировать амилоидные агрегаты». В этом утверждении есть лишь небольшое зерно истины с точки зрения химика, который ставит эксперименты in vitro, однако с точки зрения биолога, оно лишено смысла. Биолог имеет дело с живыми объектами, и in vivo, даже в условиях сверхпродукции, лишь немногие белки образуют амилоидные агрегаты. Более того, даже in vitro при широком варьировании условий (солевого состава буферов, кислотности и температуры) далеко не всякий белок или пептид может формировать амилоидные фибриллы [Maji et al., 2009].

Амилоидогенные свойства определяет аминокислотный состав последовательности полипептидов. Экспериментально установлено, что наибольшим амилоидогенным потенциалом обладают последовательности, обогащнные гидрофобными аминокислотами, такими как фенилаланин, изолейцин и валин, а наименьшим - обогащнные заряженными аминокислотами [Ahmed and Kajava, 2013]. Такая аминокислота как пролин вообще не образует бета связей и, соответственно, препятствует амилоидогенезу, так как у не отсутствует стандартная аминогруппа.

Разработано несколько теоретических алгоритмов, позволяющих предсказывать способность полипептидов к амилоидогенезу, но эти алгоритмы удовлетворительно работают только для коротких пептидов [по: Ahmed and Kajava, 2013]. Есть основания полагать, что амилоидные свойства белка, определяют не только последовательности способные образовывать бета слои, но и соседние участки полипептидной цепи. Таким образом, теоретические предсказания в настоящее время малоэффективны.

Большинство выявленных амилоидов являются патогенными и демонстрируют цитотоксические эффекты [по: Нижников и др., 2015].

Образование патогенных амилоидных полимеров чаще всего может быть вызвано двумя причинами – аномальным повышением концентрации амилоидогенного белка, или возникновением аминокислотных замен, способствующих агрегации.

Вместе с тем, у некоторых организмов выявлены как конститутивные функциональные амилоиды, так и функциональные амилоиды, формирование которых индуцирует внешнее воздействие [Sugiyama and Tanaka, 2014].

Для амилоидов можно выделить несколько универсальных физикохимических свойств [по: Нижников и др. 2015]:

- поперечная исчерченность, которая определяется поперечным расположением мономеров белка по отношению к центральной оси протофибриллы;

- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный и тиофлавин Т;

высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов, растворяющих почти все белковые комплексы и агрегаты, но не амилоидные фибриллы;

- способность к автокаталитическому росту за счт присоединения свободных мономеров к протофибрилле [McLaurin et al., 2000].

Отметим, что при присоединении к амилоидной протофибрилле мономер изменяет конформацию, что зачастую приводит к инактивации белка, или к приобретению белком новых функций [по: Winklhofer et al., 2008]. Для большинства исследованных белков есть полный спектр доказательств амилоидных характеристик фибрилл, полученных in vitro, а в экспериментах in vivo показано лишь связывание с амилоидспецифическими красителями. Это объясняется серьзными методическими сложностями выделения и очистки амилоидов от прочих белков.

Прионы и их отличия от неинфекционных амилоидов 1.2.

Впервые термин «Prion» (“proteinaceous infectious (particles)”) был предложен Стенли Прусинером для описания особой формы одноимнного белка вызывающей инфекционные нейродегенеративные PrP (Prion Protein), заболевания человека и животных. Прионная форма белка была обозначена PrPSc (от первого описанного прионного заболевания овец “Scrapie”). Нормальная форма белка PrP обозначается PrPC (от Cellular) [по: Prusiner and Scott, 1997].

Согласно определению С. Прусинера «прионы – это инфекционные белковые частицы», которые способны к самовоспроизведению. Эти инфекционные частицы представляют собой амилоидные агрегаты белка Prion Protein. Агрегаты PrPSc удивительно устойчивы и могут передаваться от организма к организму даже принадлежащим разным видам. Инфекционные частицы PrPSc содержатся не только в мозге, но и в других органах и тканях, а также в выделениях лимфатической системы и фекалиях [по: Aguzzi et al., 2008]. Большинство выявленных впоследствии у разных организмов белков, подпадающих под определение «прион» (т.е. инфекционная белковая частица), формируют амилоидные агрегаты.

Рассмотрим основные сходства и различия понятий «амилоид» и «прион». В первую очередь нужно заметить, что описаны некоторые прионы, не обладающие амилоидными свойствами [Brown and Lindquist, 2009], а возникновение дрожжевого приона [] вообще не связано с конформационными изменениями [Roberts and Wickner, 2003]. Подробнее об этом будет сказано в разделе «Прионы». Здесь мы сосредоточимся на обсуждении отличительных черт инфекционных и неинфекционных амилоидов.

Инфекционными являются только те агенты, которые способны размножаться в организме-хозяине. Классическими примерами инфекционных агентов являются бактерии, патогенные грибы, бактерии и вирусы. Поскольку прионы являются инфекционными белковыми частицами, то само определение постулирует способность этих частиц (иначе говоря, амилоидных агрегатов) размножаться, то есть самовоспроизводиться. Именно размножение прионных частиц объясняет распространение прионных инфекций у млекопитающих [Sun et al., 2008] и передачу прионной формы белка в ряду поколений у микроорганизмов [Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Если говорить о S. cerevisiae, то прионный агрегат, образовавшийся в одной клетке, стабильно передается всем е потомкам в ряду клеточных поколений, что однозначно доказывает наличие механизма, обеспечивающего размножение, то есть расщепление прионного агрегата. Для описания прионизации белка PrP было предложено две базовые модели, получивших название «гетеродимерной» и «полимеризационной» [Prusiner, 1989;

Lansbury and Caughey, 1995] (рис. 3).

Рисунок 3. Модели, объясняющие передачу приона [по: Chernoff, 2001].

Отметим, что «полимеризационная» модель отражает механизм амилоидогенеза, но никак не объясняет механизм передачи приона, который должен включать в себя не только рост полимера, но и увеличение количества прионных частиц. Согласно «гетеродимерной» модели два мономера белка взаимодействуют, что приводит к изменению их конформации, далее изменнные мономеры разделяются и служат матрицами для присоединения и конверсии новых мономеров. Эта модель оказалась ошибочной – как было показано в ряде работ, свободные мономеры белка не способны сохранять прионную конформацию. Если говорить об амилоидных прионах, то, как мы понимаем теперь, бета-структуры молекул, формирующих прион, сохраняются лишь в составе полимеров.

Гипотеза, объяснившая механизм размножения амилоидных прионов, была предложена В. Кушнировым и М. Тераванесяном [Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Основываясь на экспериментальных данных, авторы предположили, что в клетках дрожжей прионные агрегаты расщепляет на олигомеры шаперон Hsp104.

Делеция гена, кодирующего этот шаперон, приводит к утрате приона, поскольку амилоидные агрегаты перестают расщепляться и не могут передаваться из клетки в клетку. Позднее было показано, что Hsp104 в комплексе с другими шаперонами обеспечивает расщепление агрегатов большинства дрожжевых прионов [Romanova and Chernoff, 2009]. Размножение агрегатов приона млекопитающих (т.е. увеличение количества инфекционных частиц) было доказано при инфицировании иммортализованной культуры клеток патогенными агрегатами PrPSc. У потомков инфицированных клеток прионный белок был представлен в амилоидной изоформе PrPSc [Butler et al., 1988]. Факторы, обеспечивающие расщепление агрегатов PrPSc по-прежнему остаются неизвестными. Было показано, что агрегаты PrPSc могут расщепляться in vitro при механическом воздействии, а также в результате активности шаперона альфа-кристаллина [Sun et al., 2008], однако эта работа не получила продолжения. Именно расщепление прионных агрегатов на олигомеры, приводящее к увеличению количества инфекционных частиц, является ключевым отличием прионов от классических амилоидов. Эту мысль иллюстрирует схема, приведнная на рисунке 4.

На этапе инициации процессы амилоидогенеза и прионогенеза ничем не отличаются друг от друга. В случае формирования конститутивных функциональных амилоидов уровень продукции белка оказывается достаточным для того, чтобы мономеры связались друг с другом за счт формирования межмолекулярных бета слов. Образовавшаяся затравка присоединяет новые мономеры, что приводит к формированию олигомера и протофибриллы (рис. 4, этап 1).

Рисунок 4. Схема амилоидогенеза и прионогенеза.

Красный круг – мономер белка в исходной конформации. Зелный квадрат – мономер того же белка в амилоидной конформации.

Примерно так же происходит формирование патологических амилоидов и прионов, за исключением того, что в данном случае этот процесс индуцируется аномальным повышением концентрации амилоидогенного белка, или нарушением его взаимодействия с функциональными партнрами.

Образовавшиеся протофибриллы собираются в фибриллы и более крупные агрегаты.

Каждый новый неинфекционный амилоидный агрегат (прион) образуется независимо от предсуществующего. Иначе обстоит дело в случае прионогенеза.

Амилоидные прионные агрегаты, в отличие от неинфекционных амилоидов, расщепляются на олигомеры (рис.4, этап 2), каждый из которых является матрицей для присоединения новых мономеров. Образовавшийся олигомер растт и вновь расщепляется на олигомеры, что приводит к возникновению цикла прионной конверсии (рис. 4). У дрожжей расщепление агрегатов обеспечивает возникновение воспроизводящегося цикла прионной конверсии и позволяет мелким агрегатам передаваться в дочерние клетки, то есть стабильно наследоваться.

Поскольку в случае прионизации белок входит в состав амилоидных агрегатов, это приводит к его полной или частичной инактивации. Прионная инактивация белка может приводить к наследуемому изменению признака у одноклеточных организмов. Именно в этом заключается феномен «белковой наследственности» впервые сформулированный Ридом Викнером – в случае прионизации возникает наследуемое изменение признака без каких бы то ни было изменений в геноме [Wickner, 1994; Wickner et al., 1999]. Кроме того, открытие прионов привело к констатации ещ одного феномена – один и тот же белок в идентичных условиях может быть представлен в организме как минимум в двух альтернативных конформациях. Инфицирование организма прионным агрегатом, или возникновение приона de novo, в результате лишь временного повышения концентрации белка, вызывает наследуемое у микроогранизмов, или стабильно воспроизводящееся в организме высших эукариот, изменение конформации и активности белка. В отличие от прионов, неинфекционные патологические амилоиды могут поддерживаться только в случае постоянной сверхпродукции соответствующих белков. Например, показано, что ряд мутаций, способствующих повышенному уровню секреции амилоидного пептида бета (A), вызывают наследственные формы болезни Альцгеймера [Goate and Hardy, 2012].

Отличие прионов от неинфекционных амилоидных агрегатов удобно проиллюстрировать на следующем примере – прион [PSI+] (прионная форма дрожжевого белка Sup35) стабильно наследуется, поскольку шаперон Hsp104 расщепляет прионные агрегаты, обеспечивая тем самым цикл прионной конверсии [Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998]. Делеция HSP104 или его инактивация приводит к потере прионных агрегатов, так как в отсутствие этого шаперона агрегаты продолжают расти, но не расщепляются и крупные агрегаты не передаются в дочерние клетки, то есть становятся неинфекционными [Borchsenius et al., 2001; Kryndushkin et al., 2003; Kushnirov et al., 2007]. В этом случае, в отсутствие конформационной матрицы (прионных агрегатов) в дочерних клетках вновь синтезируемый белок представлен в мономерной Sup35 конформации. В зависимости от активности Hsp104 белок Sup35 может формировать в дрожжах как прионные, так и неприонные агрегаты. Таким образом, как ни тонка грань между прионами и неинфекционными амилоидами, но она существует.

Доказать или опровергнуть наличие прионных свойств амилоидов млекопитающих значительно сложнее. Для того, чтобы утверждать, что однажды инъецированный агрегат размножается (т.е. запускает цикл прионной конверсии) необходимо использовать модельных животных или культуры клеток, у которых исследуемый белок стабильно поддерживается в нормальной клеточной конформации. Некоторые авторы не могут устоять перед соблазном назвать исследуемый ими амилоид прионом, не имея для этого серьзных оснований. Так в целом ряде работ используется следующая логика: условный белок «Х»

формирует амилоидные фибриллы in vitro. Добавление этих фибрилл к раствору, содержащему мономеры белка «Х» ускорят процесс агрегации. На основании этих данных авторы делают вывод, что исследуемый белок обладает прионными свойствами [Raveendra et al., 2013; Ren et al., 2009; Prusiner, 2013]. В связи с большим количеством таких работ нужно отметить, что ускорение процесса агрегации мономеров за счт добавления предсуществующего агрегата характерно для любого амилоида, да и не только амилоида (достаточно вспомнить из школьной программы пример с добавлением кристалла соли в насыщенный раствор). Предполагается, что данные эксперименты доказывают способность агрегатов к самовоспроизведению, но на самом деле происходит подмена понятий. Самовоспроизведение это увеличение количества агрегатов, а не увеличение их размеров. Очевидно, что эксперименты, рассмотренные на примере гипотетического белка «Х», доказывают увеличение размера предсуществующих агрегатов, но не свидетельствуют об их самовоспроизведении.

Амилоидные агрегаты некоторых белков, подобно прионам, могут транспортироваться из клетки в клетку, в частности, в составе секреторных везикул [Joshi et al., 2015; Medina and Avila, 2014]. Более того, показано, что инъекция амилоидных фибрилл белка в мозг трансгенных мышей, сверхпродуцирующих этот белок, может ускорять процесс амилоидогенеза [Eisele et al., 2010; Morales et al., 2012; Rosen et al., 2012]. Здесь важно сказать, что в условиях сверхпродукции эти белки могут образовывать агрегаты и без инъекции.

В данном случае нельзя утверждать, что именно инъекция приводит к появлению альтернативной формы белка. Ускорение амилоидогенеза может быть вызвано ростом введнных в организм фибрилл.

Вместе с тем, совсем недавно были получены доказательства прионных свойств амилоидных конформеров белков альфа-синуклеин и tau, агрегация которых вызывает нейродегенеративные заболевания. Амилоидные фибриллы белка альфа-синуклеин, полученные in vitro, при инъекции в мозг мышам дикого типа, индуцируют нейродегенерацию, связанную с амилоидогенезом [Luk et al., 2012]. Данных о возникновении патологии в результате инъекции полученных in vitro фибрилл tau пока нет, но появление агрегатов tau и развитие нейродегенерации были показаны при инъекции мышам дикого типа гомогената из мозга человека, содержащего олигомеры tau и пептида A [Lasagna-Reeves, et al., 2012]. Отметим, что в контроле (без инъекции фибрилл альфа-синуклеина или гомогената, содержащего олигомеры tau) эти белки в мозге мышей дикого типа не агрегируют.

–  –  –

* - В случае с исследованием прионных свойств белка tau, нейродегенерация, связанная с агрегацией tau была вызвана инъекцией белкового лизата из мозга человека, умершего от болезни Альцгеймера [Lasagna-Reeves, et al., 2012].

Для доказательства прионных свойств необходимо показать, что при физиологических условиях, без сверхпродукции белка, инъекция его агрегатов приводит к формированию самовоспроизводящихся агрегатов. Не претендуя на абсолютную истину, мы будем рассматривать в качестве прионов только те амилоиды млекопитающих, для которых чтко доказаны инфекционные свойства и способность агрегатов к воспроизведению (см. Табл.1).

Функциональные и патологические амилоиды 1.3.

1.3.1. Функциональные амилоиды В качестве функциональных амилоидов наибольшую известность получили белки спидроин и фиброин, являющиеся основными компонентами соответственно паутины и шлка, из которого состоят домики куколок тутового шелкопряда и некоторых других видов насекомых. До сих пор структура этих природных амилоидов почти не охарактеризована. Процесс образования данных амилоидных фибрилл происходит в секреторных железах за счт быстрого снижения pH и обезвоживания секрета желз [Kenney et al., 2002]. Фиброин на 80% состоит из глицина, аланина и серина. Бета слои формируются повторяющейся последовательностью (Gly-Ala-GIy-AIa-GIy-Ser)n [Ruan et al., 2008]. В случае спидроина бета структуры формируют повторяющиеся последовательности аланина, расположенные в центральной части белка [Humenik et al., 2015].

Функциональные амилоиды обнаружены также у бактерий [по: Syed and Boles, 2014]. Большинство из них является необходимым компонентом экстраклеточной биоплнки, которая соединяет клетки бактерий при определнных условиях внешней среды. Помимо этого, некоторые бактерии секретируют амилоидные олигомеры, токсичные для клеток организма-хозяина, клеток грибов, или для других бактерий. Примеры охарактеризованных бактериальных амилоидов приведены в таблице 2 [по: Syed and Boles, 2014].

Микроцин E492 в амилоидной изоформе выполняет как минимум две функции.

Продукция этого белка и его секреция в виде амилоидных олигомеров отмечена на стадии экспоненциального роста культуры Klebsiella pneumoniae. Олигомеры токсичны для клеток организма – хозяина, а при понижении pH олигомеры собираются в нетоксичные амилоидные фибриллы, которые необходимы для формирования биоплнки. Этот процесс обратимый – при повышении pH фибриллы вновь расщепляются на токсичные олигомеры [Biler et al., 2005].

Таблица 2. Бактериальные амилоиды [по: Syed and Boles, 2014]

–  –  –

Известны также функциональные амилоиды у дрожжей - фибриллы белка Als3 Candida albicans играют роль в клеточной адгезии [Otoo et al., 2008], а белок Bgl2 в амилоидной изоформе стабилизирует структуру клеточной стенки S.

cerevisiae [Kalebina et al., 2008]. Есть основания полагать, что клеточная стенка дрожжей сахаромицетов включает в себя амилоидные фибриллы и других белков [Chan and Lipke, 2014; O'Rourke et al., 2015].

Белок CPEB моллюска Apyisia californica и его ортолог Orb2 у Drosophila melanogaster занимают особое место в ряду функциональных амилоидов. Белок CPEB ответственен за транспорт мРНК в нейронах [Cao et al., 2005]. При прохождении нервного импульса в ответ на выброс серотонина этот белок образует амилоидные олигомеры в зонах нервных синапсов. Показано, что олигомеры CPEB стабилизируют синапсы и способствуют их долговременному сохранению [Si et al., 2010]. Такие же функции выполняют олигомеры Orb2 у дрозофилы. Более того, было показано, что мутации, препятствующие олигомеризации Orb2, блокируют долговременную память дрозофилы [Majumdar et al., 2012]. Таким образом, амилоидные конформеры CPEB и Orb2 обеспечивают долговременную память.

В свете тенденций последних лет эти белки очень быстро стали называть прионами. Для этого у авторов были следующие основания:

1. Было показано, что добавление предсуществующих фибрилл CPEB и Orb2 ускоряет процесс амилоидогенеза мономеров этих белков in vitro. Чтобы не повторяться, скажем только, что это типичное свойство всех амилоидов.

2. Однажды индуцированные агрегаты CPEB поддерживаются в нейронах долгое время, причм уровень продукции этого белка остатся неизменным.

3. Амилоидогенная последовательность белка CPEB в составе химерного белка демонстрирует прионные свойства в дрожжах S. cerevisia. [Heinrich and Lindquist, 2011].

С нашей точки зрения, рассматривая белки CPEB и Orb2, мы сталкиваемся с совершенно особой ситуацией. С одной стороны речь не идт о межклеточной передаче прионных конформеров, но с другой стороны, однажды индуцированная амилоидная конформация поддерживается в неделящейся клетке долгое время.

Вряд ли это можно объяснить постоянным увеличением размера первоначально возникших агрегатов. Можно допустить, что эти агрегаты расщепляются и инициируют воспроизводящиеся акты конформационных переключений вновь синтезируемого белка. В этом случае мы имеем аналогию с дрожжевыми прионами, за тем исключением, что нейроны в отличие от клеток дрожжей не делятся. Возможно, это уникальная ситуация – олигомеры постоянно расщепляются, индуцируют конформационное переключение новых молекул белка, и этот процесс многократно воспроизводится в неделящейся клетке. Пока, для окончательного заключения о прионных свойствах этих белков, информации явно недостаточно.

У человека в меланоцитах в результате процессинга от белка Pmel17 отщепляется фрагмент полипептидной цепи, который формирует амилоидные фибриллы, связывающие меланин. Вероятно, амилоидный «скелет» Pmel17 служит для запасания и хранения пигмента [Fowler et al., 2006].

Есть основания полагать, что млекопитающие запасают многие гормоны секреторных гранул в виде амилоидных агрегатов [Maji et al., 2009]. Было показано, что 31 белок секреторных гранул из 42-х протестированных формируют амилоидные агрегаты in vitro, правда, белки инкубировали 30 дней в условиях, сильно отличающихся от физиологических. Кроме того, секреторные гранулы как непосредственно в организме крысы, так и в иммортализованной клеточной культуре, связывают амилоидспецифический краситель [Maji et al., 2009]. Можно предположить, что гормоны, запасаемые в виде амилоидов, при определнных условиях могут секретироваться в растворимом виде.

Возможно, известные нам функциональные амилоиды – это лишь вершина айсберга. Разработанные ранее методы позволяли лишь направлено проверять, с той или иной степенью достоверности, амилоидные характеристики выбранных для анализа белков, но масштабный протеомный скрининг амилоидов оставался невозможным.

31

1.3.2. Патологические амилоиды

К настоящему времени охарактеризовано около сорока белков, которые могут формировать патологические амилоидные агрегаты в организме человека и других млекопитающих [по: Нижников и др., 2015]. Целая группа патологических амилоидов связана с нейродегенеративными заболеваниями, но известны и амилоиды, вызывающие нарушения работы печени, почек, сердца, а также других органов и тканей. Мы рассмотрим только несколько социально значимых амилоидных патологий, для которых активно обсуждаются возможные прионные характеристики. Патологии млекопитающих, связанные с формированием агрегатов PrPSc, а также белков tau и альфа-синукленина будут рассмотрены отдельно в разделе «Прионы млекопитающих».

1.3.2.1. Системный амилоидоз АА

Системный амилоидоз АА связан с амилоидогенезом белка SAA (Serum Amyloid A) и охарактеризован у разных видов млекопитающих, в том числе у человека, гепарда, домашней кошки и домовой мыши. Это заболевание развивается при ревматоидном артрите, различных опухолях, неспецифическом язвенном колите, малярии и туберкулзе. У человека выявлено три гена, кодирующих белки SAA - SAA1, SAA2 и SAA4. Белок SAA4 продуцируется конститутивно, а уровень продукции белков SAA1 и SAA2 в печени может повышаться в тысячу раз в ответ на бактериальную инфекцию [Westermark and Westermark, 2009]. В случае хронической инфекции в сыворотке крови представлены цитотоксичные амилоидные агрегаты, мажорным компонентом которых является белок SAA1. Показано, что если модельных животных инфицировать не только бактериями, но и инъецировать им в кровь фибриллы SAA1, то амилоидогенез значительно ускоряется. Интересно, что фибриллы SAA1 гепарда могут ускорять амилоидогенез белка SAA1 мыши [Murakami et al., 2013].

Некоторые авторы считают это достаточным основанием для того, чтобы 32 утверждать, что амилоид SAA1 обладает инфекционными свойствами. С нашей точки зрения, ускорение амилоидогенеза за счт чужеродных фибрилл на фоне спровоцированного бактериями тысячекратного увеличения уровня продукции собственного белка не является достаточным доказательством прионных свойств фибрилл SAA1.

1.3.2.2. Латеральный склероз

Латеральный (боковой) амиотрофический склероз это нейродегенеративное заболевание, которое сопровождается поражением двигательных нейронов и вызывает паралич и атрофию мышц. Цитотоксическим эффектом обладают агрегаты белка супероксиддисмутазы (SOD1) [Elam et al., 2003]. В норме SOD1 катализирует превращение высокотоксичных кислородных радикалов в кислород и пероксид водорода. Механизм цитотоксичности, связанный с агрегацией этого белка, пока не охарактеризован. В ряде случаев амилоидные олигомеры или фибриллы образуются в результате мутаций в гене SOD1, но зачастую болезнетворные агрегаты формирует и интактный белок SOD1 [Stathopulos et al., 2003; Chattopadhyay et al., 2008]. Показано, что олигомеры, возникающие в результате мутаций, могут транспортироваться из клетки в клетку и провоцировать агрегацию нормального белка [Furukawa et al., 2013]. Вместе с тем, индукции самовоспроизводящихся агрегатов за счт инъекции амилоидных конформеров SOD1 не отмечено.

1.3.2.3. Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) – наиболее распространенная форма старческого маразма, для которой характерно прогрессирующее расстройство памяти и высших корковых функций вплоть до полной утраты интеллекта. Одним из факторов, приводящих к дисфункции нервных синапсов и к гибели нейронов при БА, является патологическое накопление амилоидного пептида (A), который образуется в результате разрезания трансмембранного белка APP (Amyloid Precursor Protein). Белок APP расщепляют на несколько фрагментов три секретазы

-, и (рис. 5) [по: Selkoe, 2011].

Рисунок. 5. Схема процессинга белка APP [по: Selkoe, 2011].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 
Похожие работы:

«Баранов Михаил Евгеньевич Экологический эффект биогенных наночастиц ферригидрита при ремедиации нефтезагрязненных почвенных субстратов Специальность (03.02.08) – Экология (биология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат...»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Артеменков Алексей Александрович КОНЦЕПЦИЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Брук...»

«ДЕНИСЕНКО ВАДИМ СЕРГЕЕВИЧ ОПЕРЕЖАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ ПОДГОТОВКА СТУДЕНТОВ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ СФЕРЫ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ В КОНТЕКСТЕ ОБЕСПЕЧЕНИЯ НЕПРЕРЫВНОСТИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.04 – Теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры ДИССЕРТАЦИЯ на соискание...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»

«Иртегова Елена Юрьевна РОЛЬ ДИСФУНКЦИИ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И РЕГИОНАРНОГО ГЛАЗНОГО КРОВОТОКА В РАЗВИТИИ ГЛАУКОМНОЙ ОПТИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 14.01.07 – глазные болезни ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Усов Николай Викторович Сезонная и многолетняя динамика обилия зоопланктона в прибрежной зоне Кандалакшского залива Белого моря в связи с изменениями температуры воды 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник А.Д. Наумов доктор биологических наук, ведущий...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Кириллин Егор Владимирович ЭКОЛОГИЯ ОВЦЕБЫКА (OVIBOS MOSCHATUS ZIMMERMANN, 1780) В ТУНДРОВОЙ ЗОНЕ ЯКУТИИ 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д. б. н., профессор Мордосов И. И. Якутск – 2015 Содержание Введение.. Глава 1. Краткая физико-географическая...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«СИДОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ У ДЕВУШЕК К УСЛОВИЯМ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Драгич О.А. Омск-2015 СОДЕРЖАНИЕ Введение.. Глава 1 Обзор литературы.. 1.1. Механизмы адаптации организма человека к окружающей среде 1.2. Закономерности развития...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Головань Екатерина Викторовна Ресурсы декоративных растений для озеленения внутриквартальных территорий (на примере г. Владивостока) 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., доцент О.В. Храпко Владивосток — Оглавление Введение Глава 1. Современные подходы...»

«ШИТОВ АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ ВЛИЯНИЕ СЕЙСМИЧНОСТИ И СОПУТСТВУЮЩИХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ НА АБИОТИЧЕСКИЕ И БИОТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ЭКОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ ЧУЙСКОГО ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ И ЕГО АФТЕРШОКОВ) 25.00.36 – Геоэкология (науки о Земле) Диссертация на соискание ученой степени доктора геолого-минералогических наук Горно-Алтайск 201...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.