WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

Аканина Дарья Сергеевна

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДЕТЕКЦИИ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНОГО

ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н5N

03.02.02 – вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель



Д.б.н., профессор Гребенникова Т. В.

Москва 20

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Описание заболевания

2.2. Общая характеристика вируса гриппа

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1

Передача вируса

Клинические проявления.

Патогенез.

2.4. Способы детекции вируса гриппа и антител к нему

2.4.3. Иммуноферментный анализ

2.4.4. Молекулярные методы

2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция

2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

3. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы

4. Результаты

4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР.

4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР.......... 20 4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы.

4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы

4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы

4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени.

4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР.......... 32 4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени

4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1

4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики.

4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)

4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1

4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1.

4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа.

4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1....... 98

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы

7. Библиография

8. Приложения

Список использованных сокращений

ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота ИФА – иммуноферментный анализ HA – гемагглютинин NA – нейраминидаза КЭ – куриные эмбрионы АГ - антиген мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота РСК – реакция связывания комплемента РТГА – реакция торможения гемагглютинации ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат ОТ/ПЦР – полимеразная цепная реакция с предшествующей реакцией обратной транскрипции ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени кДНК – комплементарная дезиксирибонуклеиновая кислота ЕФ – европейская фармакопея ФСП – фармакопейная статья предприятия СТО – стандарт организации ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭИД – эмбриональная инфекционная доза п.н. – пара нуклеотидов ПААГ – полиакриламидный гель мАТ – моноклональные антитела ВЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ЯМР - ядерный магнитный резонанс ВОЗ – всемирная организация здравоохранения WHO – world health organization (всемирная организация здравоохранения)

1. Введение

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа А подтипа H5N1 – высоко патогенный вирус «птичьего гриппа» – впервые инфицировал человека в 1997 году во время вспышки болезни среди птиц в Гонконге (Claas et.al.,1998; Shortridge et al.,1998). В 2003 и 2004 годах этот вирус распространился из Азии в Европу и Африку и циркулировал среди домашних птиц во многих странах, что привело к сотням случаев заболевания людей, в том числе и со смертельныи исходом (Guan et al.





, 2009). Вспышки болезни среди домашних птиц оказывают серьезное воздействие на экономику и международную торговлю в пораженных странах. Продолжающаяся циркуляция вирусов H5N1 среди домашних птиц, особенно там, где этот вирус является эндемическим, попрежнему представляет угрозу для общественного здравоохранения (Menno D. de Jong, 2006; WHO, 2011), так как эти вирусы обладают не только способностью вызывать тяжелое заболевание у людей, но и преодолевать межвидовой барьер (Каверин Н.В., 2003; Webster et al., 2007; Manz et al., 2013).

9 января 2014 года ВОЗ сообщила о подтверждённом случае заболевания гриппом, вызванным вирусом А/H5N1 в Канаде у человека, приехавшего из Пекина, Китай. Всего в мире с 1997 года зарегистрировано 649 случаев заболевания людей гриппом, вызванным вирусом H5N1, 385 из которых закончилось смертью. Таким образом, смертность от гриппа, вызванным вирусом H5N1 составляет почти 60% (WHO, 2014). В нашей стране пока не зарегистрировано ни одного случая заболевания человека гриппом, вызванным вирусом H5N1. Первая вспышка «птичьего гриппа»

среди домашней птицы в России произошла в июле 2005 года в Новосибирской области (Львов и др., 2005) и была связана с миграцией водоплавающих птиц из Азиатских стран на территорию нашей страны.

Все вышесказанное указывает на необходимость быстрой идентификации и типирования вирусов гриппа А не только для облегчения наблюдения за пандемическим потенциалом вируса «птичьего гриппа», но и для улучшения контроля и лечения инфицированных пациентов (Sakurai, В последние годы, методы молекулярной диагностики, 2012).

рекомендованные ВОЗ, играют ключевую роль в выявлении и типировании вирусов гриппа (Alexander, 2008, Thanh et al., 2010). Совокупность чувствительных и специфичных современных отечественных тест-систем для качественного и количественного выявления генома вируса гриппа H5N1 на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, а также методов выявления антител к данному вирусу могут существенно облегчить экологический мониторинг с целью предупреждения возможной пандемии (C.A. Russell, 2012.).

Цели и задачи исследования Целью исследования была разработка и усовершенствование методов лабораторного выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 и антител к нему.

1. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР, проверить чувствительность и специфичность и на основании этих данных создать «Тест-систему для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» и нормативную документацию к ней (СТО и Инструкцию по применению);

2. Разработать и оптимизировать молекулярно-генетический метод обнаружения и количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 и дифференциации его от других подтипов вируса гриппа А и других вирусов на основе ПЦР в реальном времени, проверить его чувствительность и специфичность;

3. Разработать генно-инженерные положительные контроли на основе плазмиды pGEM-T Easy, содержащие клонированные участки генома вируса гриппа А подтипа H5N1;

4. Показать возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 для контроля на стадиях получения рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной генетики.

5. Показать возможность использования разработанных тест-систем для обнаружения и дифференциации высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в биологических образцах от птиц, собранных в различных регионах РФ;

6. Получить рекомбинатный белок NS1 на основе вектора pET32b+ с последующей химической трансформацией штамма E. Coli BL21trxB(DE3)pLysS, накоплением и выделением методом метало-хелатной аффинной хроматографией с использованием Ni-NTA агарозы.

7. Разработать методику обнаружения антител к рекомбинантному неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 на основе непрямого ИФА.

Научная новизна работы Созданы отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР-РВ для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 с учетом генотипов вируса, циркулирующих на территории Российской Федерации. Достигнута высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Разработанные тест-системы являются универсальными и позволяют детектировать все известные на сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа H5N1.

Получен Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1».

Разработки могут быть использованы в лабораториях Научноисследовательских институтов в целях изучения эволюции вируса гриппа А подтипа H5N1 для предупреждения возможной пандемии.

Впервые показана возможность использования метода количественного определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени для контроля получения рекомбинантного вируса гриппа H5N1 методом обратной генетики.

Показана возможность применения непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку NS1 вируса гриппа А подтипа H5N1 для дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной вакциной птиц.

Практическая значимость Для «Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» разработаны СТО 42418073-0001-2007 и Инструкция по применению от 21. 05. 2009 №1-4.7/02562, которые утверждены в Министерстве Сельского хозяйства РФ. Данная тест-система сертифицирована во Всероссийском Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), сертификат соответствия № РОСС RU.ФВ01.Н26634.

Разработанные тест-система и методики на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени использованы при проведении Международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по молекулярной диагностике гриппа в 2007-2011 г.г. Получен международный сертификат от 31. 10. 2011 г.

Сконструированные генно-инженерные положительные контроли, содержащие фрагменты генома вируса гриппа А подтипа Н5N1, могут быть использованы в лабораторных и коммерческих тест-системах для качественного и количественного контроля определения генома высоковирулентного вируса гриппа А подтипа H5N1 в научных и клинических лабораториях.

Разработанные методики и «Тест-система для диагностики вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР» используются в региональных ветеринарных лабораториях, в диагностических лабораториях Роспотребнадзора и Минсельхоза РФ для проведения мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1. Тест-системы могут также быть использованы для проведения научно-практических занятий в Университетах и Институтах Министерства Образования РФ.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях, конгрессах, съездах:

Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных»

(Ульяновск, 2006); итоговой конференции СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины (Москва, 2007г); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медикокриминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007); научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, 2012).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 152 страницах машинописного текста.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 148 источников. Работа содержит 11 таблиц и 26 рисунков, 4 приложения.

–  –  –

Вирус гриппа А широко распространен в природе и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии (Слёпушкин А.Н., 2001). Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 15 антигенных подтипов гемагглютинина (Н1-Н15) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9). От диких птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа (Zambon M. C., 1999). Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе (WHO,2005).

В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) как и пандемия 2009годов вируса гриппа свиней H1N1 были обусловлены новыми реассортантными вирусами (ВОЗ, 2005; Львов Д.К., 2010; Даниленко Д.М., 2011; Игнатьева А.В., 2011).

За последние 45 лет описано свыше 50 эпизодов возникновения эпизоотий среди домашних животных в ряде случаев сопровождающихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью.

Вирусы H5N1 периодически выделялись от кур и других видов птиц. В 1997 году в Гонконге отмечена вспышка заболевания, обусловленная прямой передачей вируса гриппа птиц H5N1 от кур человеку (Subbarao K.,1998; Claas E.C., 1998; de Jong J.C., 1997.).

Это был первый подтвержденный случай передачи вируса гриппа от птиц человеку. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли.

Второй подобный эпизод отметили в 2003 г. в Гонконге, когда из пяти инфицированных людей двое умерло.

Начиная с 2003 года высокопатогенный вирус гриппа А подтипа H5N1 начинает распространяться благодаря диким и домашним птицам через Азию по Европе и Африке и заражать людей, контактировавших с домашними птицами (Webster R.G., 2006; Gambotto A., 2008; Maines T.R., 2005.).

С 2005 года вспышки заболевания гриппом птиц H5N1 фиксировались во многих странах Азии и ближнего востока. На сегодняшний день в Индонезии произошел, в общей сложности, 191 случай заболевания людей птичьим гриппом A(H5N1), из которых 159 случаев закончились смертельным исходом. Из этого числа 8 случаев (все смертельные) произошли в 2012 году. По данным на конец мая 2012 года в Камбодже отмечен 21 случай заражения людей вирусом птичьего гриппа, 19 из которых с летальным исходом. Из 168 подтвержденных случаев заболевания в Египте, 60 закончились смертельным исходом (ВОЗ, 2013).

Отмечается также заражение людей вирусом гриппа H7N7 (Belser J.A., 2009). Так, в 1996 году, вирус гриппа птиц H7N7 был изолирован в Канаде от женщины с конъюнктивитом. Отмечено инфицирование людей вирусом гриппа H7N7 во время вспышки гриппа птиц в Нидерландах (Koopmans M., 2004; Fouchier R.A., 2004.).

Для вируса гриппа птиц и его реассортантов отмечали частые случаи преодоления видового барьера (Brown I.H., 2008; Yassine H.M., 2013).

Зарегистрированы вспышки заболевания свиней, обусловленные вирусами гриппа птиц H1N1, лошадей H3N8, китов (Н7N7, H5N5 и H4N6, H13N2 и H13N9), норок (Н10N4). Отмечены случаи инфицирования домашних птиц (кур, индюков) вирусами гриппа, циркулирующими среди диких птиц, особенно водоплавающих.

2.2. Общая характеристика вируса гриппа

Возбудители вируса гриппа – РНК-содержащие вирусы, относящиеся к роду вирусов гриппа А и В, семейства Orthomyxoviridae. Высокая контагиозность и исключительная изменчивость поверхностных белков вирусов гриппа явились причинами их повсеместного распространения (de Jong M.D., 2006). На данный момент вирусы представлены согласно номенклатуре 16 подтипами гемагглютинина и 9 нейраминидазы (Поздеев О.К., 2009).

Вирусы семейства имеют особое сродство к Orthomyxoviridae мукополисахаридам и гликопротеидам (в частности, с клеточными рецепторами, содержащими сиаловую кислоту) (Webster R.G., 1992). Кроме того, имеют сходные биологические свойства, а именно: способность агглютинировать эритроциты, наличие нейраминидазы, легкость культивирования в КЭ и тропизм к органам дыхания. Вирусы имеют принципиальные различия по внутриклеточной локализации АГ, по чувствительности к препаратам, затрагивающим синтез белков и нуклеиновых кислот и по генетическим свойствам.

Согласно Международной номенклатуре, любой штамм вируса гриппа рода А обозначается по следующей схеме: род/источник изоляции/место изоляции/собственный номер изолята /год изоляции/формула вида – серотипы гемагглютинина и нейраминидазы. Для штаммов, изолированных от человека, источник изоляции не пишется; для всех других штаммов год изоляции обозначается 2-мя последними цифрами.

Семейство ортомиксовирусов (от греч. Orthos – правильный, прямой и myxa – слизь) включает три рода: вирусы гриппа А и В, вирусы гриппа С и подобные вирусы.

Ионный канал гемагглютинин РНК

–  –  –

Липидная оболочка Рисунок 1. Схематическая структура вируса гриппа.

Вирионы представляют собой частицы плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80-120 нм (рисунок 1) (Mosley V. M., 1946). Они состоят из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии диаметром 9нм и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 10,0-13,5 нм. Иногда обнаруживают филаментозные частицы длиной до 4 мкм, молекулярная масса вирионов 250 МД, плавучая г/см3, плотность в сахарозе 1,19 коэффициент седиментации нефиламентозных вирионов 700-800S (Fauquet C. M., 2005).

Вирусы чувствительны к жирорастворителям, детергентам, формальдегиду, -пропиолактону, быстро инактивируются при прогревании (560C), УФ облучении и рН среды ниже 5.

Геном вируса состоит из 8 сегментов однонитевой РНК размерами: PB1

– 2341 нуклеотид (н.), PB2 – 2341 н., PA – 2233 н., HA – 1778 н., NP – 1565 н., NA – 1413 н., M – 1027 н. и NS – 890 нуклеотидов. Число нуклеотидов колеблется у разных штаммов вируса гриппа А. Указанные белки имеют молекулярную массу: 96 000Д (PB1), 87 000Д (PB2), 85 000Д (PA), 50 000Д (NP), 48 000-63 000Д (NA), 63 000Д (HA). Два гена кодируют по два белка: M1 (27 000Д) и M2 (15 000Д), NS1 (25 000Д) и NS2 (12 000Д).

Естественно, что у разных вирусов эти величины варьируют. Таким образом, 8 фрагментов РНК кодируют синтез 10 белков (Stamboulian D., 2000).

Каждый фрагмент РНК вируса содержит одинаковую последовательность из 13 нуклеотидов на 5’-конце и 11-12 нуклеотидов на 3’-конце. Установлена кодирующая функция каждого фрагмента РНК. У вируса гриппа А три больших фрагмента РНК (1-й, 2-й, 3-й) кодируют белки полимеразного комплекса (PB1, PB2, PA), 3 промежуточных по размеру фрагмента РНК (4-й, 5-й и 6-й) кодируют нуклеопротеин и поверхностные гликопротеины и 2 малых фрагмента РНК (7-й и 8-й) – матриксные белки и 2 неструктурных белка. Кодирующие зоны генов на каждом малом фрагменте РНК частично перекрываются (Steinhauer D. A., 2002). Вирионная РНК ортомиксовирусов не является инфекционной. В вирионах обнаружено 7 белков, 4 из которых (PB1, PB2, PA, NP) связаны с нуклеокапсидом, а 3 (HA, NA, M1) входят в состав липопротеидной оболочки, причем 2 из них (HA и NA) являются гликопротеинами.

Загрузка...
Гликопротеины образуют 2 вида выступов наружной оболочки вирионов. Выступы 1-го вида образованы гемагглютинином (HA) c молекулярной массой 75-80 кД (около 500 аминокислот). Каждый выступ состоит из 3-х молекул HA, которые организованы в палочкообразную структуру. HA ответственен за адсорбцию и проникновение вирионов в клетку и гемагглютинирующую активность (ГА-активность) вируса (Velkov T., 2013). АТ к HA нейтрализуют инфекционность вируса и подавляют его ГА-активность. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой (NA) с молекулярной массой 60-70 кД (450-470 аминокислот). Каждый выступ состоит из 4-х молекул NA, которые организованы в грибообразную структуру. На поверхности вириона имеется примерно 500 выступов, из которых около 100 образованы нейраминидазой и 400 – гемагглютинином. В вирионах содержится 70% белка, 18-37% липидов, 5% углеводов и 1% РНК.

Углеводы и липиды имеют клеточное происхождение.

Процесс репликации вируса гриппа в восприимчивой клетке состоит из следующих стадий (рисунок 2):

Вирус связывается с поверхностным белком или липидом, обладающим сродством к сиаловой кислоте и с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза проникает в клетку (1). Везикула подвергается ацидификации и мембрана вируса сплавляется с мембраной везикулы (вакуоли). При этом в цитоплазму выходят вирусные нуклеокапсиды (2). Вирусные нуклеокапсиды, содержащие отрицательно полярную геномную РНК увеличивают копии белка NP и белки Р транспортируются в ядро (3). Отрицательно полярная РНК копируется с помощью РНК полимеразы вириона в вирусную мРНК, используя 5,-концы пре-мРНК и РНК как праймеры для инициации синтеза (4). Матричная РНК транспортируется в цитоплазму (5), в то же время происходит транскрипция участка мРНК, кодирующего NS2 и М2 (6), в рибосоме, прикрепленной к эндоплазматическому ретикулуму (ЕР) транслируются с мРНК вирусные мембранные белки (HA,NA, M2) (7), далее эти белки участвуют в процессе секреции клетки хозяина, подвергаясь гликолизу (8). Остальная мРНК транслируется в рибосомах, находящихся в цитоплазме (9).

Рисунок 2. Внутриклеточный цикл репродукции вируса гриппа А.

Белки PA, PB1, PB2, и NP входят в ядро (10), где они катализируют синтез полноразмерной положительно цепочечной РНК (11) и отрицательно цепочечной вирионной РНК (12), обе РНК синтезируются в ядре. Какое-то количество вновь синтезированной отрицательно цепочечной РНК вовлекается в каскад синтеза РНК (13). Белок М1, связываясь с вновь синтезированной отрицательно цепочечной мРНК, останавливает синтез вирусной мРНК и, совместно с белком NS2, способствуют выходу новых нуклеокапсидов в цитоплазму (14). Белки HA и NA транспортируются к поверхности клетки (15) и встраиваются в клеточную мембрану (16).

Вирионные нуклеокапсиды, связанные с белком М1 (17) и с белком NS2, транспортируются к поверхности клетки и связываются с участками клеточной мембраны, содержащими белки HA и NA (18). Вирионы отпочковываются от плазматической мембраны клетки-хозяина (19) (S.J.Flint, 2000.).

Впервые вирус гриппа А был изолирован в 1931 г. от свиней Ричардом Шоупом в США, в 1933 г. - от человека Кристофером Эндрюсом и Вильямом Смитом в Англии. В 1955 г. вирус гриппа А был изолирован от кур в Германии В. Шефером и от лошадей в Чехословакии Бэлой Тумовой, в 1961 г. вирус был изолирован Бэккером от диких птиц – крачек Sterna hirundo в ЮАР. В последующие годы вирусы гриппа были изолированы Гремом Лэвером в Австралии, Робертом Вэбстером в США, Дмитрием Львовым в СССР. Позднее и другие исследователи в разных странах показали широчайшее распространение известных в настоящее время вирусов гриппа А среди различных представителей диких животных, главным образом, птиц водного и околоводного комплексов (Beare AS, 1991).

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1

–  –  –

Вирус гриппа передаётся воздушно-капельным путём напрямую при вдыхании вирусных частиц или косвенно путём попадания вирусных частиц в верхние дыхательные пути или конъюнктиву слизистой оболочки.

Подтверждены случаи передачи вируса гриппа А H5N1 от птицы к человеку, возможна также передача вируса из окружающей среды человеку и ограниченная, неустойчивая передача вируса от человека человеку.

В 1997 году впервые была зафиксирована передача вируса от птицы человеку, произошедшая через неделю после начала вспышки заболевания среди птиц (Mounts A.W. et al., 1999). В то время не существовало действительного риска, связанного с употреблением в пищу или приготовлением домашней птицы или заражения людей вирусом гриппа А H5N1. Заражение вирусом после разделывания домашней птицы было связано с серопозитивностью к вирусу гриппа А H5N1. В последнее время большинство заразившихся имели прямой контакт с домашней птицей, хотя не относились к числу людей, участвовавших в выбраковке больных птиц.

Люди также заражались при ощипывании и приготовлении больных птиц, подготовке боевых петухов, при игре с домашними птицами, особенно с инфицированными утками, переносящими заболевание бессимптомно, при употреблении крови уток, а также недоваренной птицы. Передача вируса кошачьим наблюдалась при кормлении тигров и леопардов в зоопарке Таиланда зараженной курицей (Keawcharoen J. et al., 2004) и при таком же кормлении домашних кошек в эксперименте (Kuiken T. Et al.2004).

Передача вируса гриппа А от человека к человеку H5N1 предположительно происходила в общежитиях и был зафиксирован один случай передачи вируса от матери ребёнку (Ungchusak K. et al., 2005). Не было выявлено ни одного случая передачи вируса воздушно-капельным путем от человека к человеку, однако при тесном контакте без мер предосторожности передача вируса возможна. В 1997 году передача вируса от человека к человеку произошла, по-видимому, не через социальный контакт, малую эффективность такой передачи вируса доказывают и серологические исследования инфицированных работников здравоохранения. Серологические исследования во Вьетнаме и Тайланде не нашли доказательств бессимптомного инфицирования среди зараженных. В последнее время, благодаря активному эпиднадзору за контактами пациентов, с помощью ОТ-ПЦР были выявлены легкие формы заболевания.

Выявлено больше инфекций у пожилых людей, а также увеличение числа и продолжительности заболевания в семьях во Вьетнаме, предположительно вызванные адаптацией местных штаммов вируса к человеку. Однако необходимы вирусологические и эпидемиологические исследования для подтверждения этих выводов. На сегодняшний день риск внутрибольничной передачи вируса среди медицинских работников низок, даже не используя меры предосторожности (Liem N.T. et al., 2005). Тем не менее, был зарегистрирован один случай тяжелого заболевания медсестры, контактировавшей с инфицированным пациентов во Вьетнаме.

Учитывая наличие вируса гриппа А H5N1 в окружающей среде также возможно инфицирование при проглатывании контаминированной воды во время плавания в водоёмах, при попадании воды в нос и на конъюнктиву глаза. Фактором риска также является использование необработанных фекалий птиц в качестве удобрения.

Клинические проявления.

Спектр клинических проявлений вируса гриппа А H5N1 основан на описаниях госпитализированных пациентов. Описание случаев заболевания вирусом гриппа А H5N1 позволяет выявить лёгкие случаи заболевания, субклинические, а также атипичные формы, такие как гастроэнтерит и энцефалопития (M.D. de Jong, 2005). Большинство пациентов до заболевания были здоровыми детьми или взрослыми.

Инкубационный период вируса гриппа А H5N1 более длинный, чем у других вирусов гриппа человека. В 1997 году клинические признаки заболевания появлялись через 2-4 дня после инфицирования, недавние исследования показывают такие же интервалы, но с разбросом до 8 дней (Hien T.T. et al., 2004). В случае передачи вируса в бытовых условиях инкубационный период составлял от 2 до 5 дней, однако верхний предел мог быть до 8-17 дней, что может быть связано с заражением через окружающую среду или при контакте с инфицированными животными.

У большинства пациентов начальным симптомом заболевания была высокая температура (как правило, выше 380С) и гриппоподобная инфекция нижних дыхательных путей. Иногда отмечалось инфицирование верхних дыхательных путей. У пациентов, инфицированных вирусом гриппа А H5N1 конъюктивит встречался реже, чем у пациентов, инфицированных вирусом птичьего гриппа Н7. Также сообщалось, что у некоторых пациентов на начальном этапе возникает диарея, рвота, боль в животе, боль в плевральной полости и кровотечение из носа и десен. Водянистая бескровная диарея и воспаление встречались чаще, чем при вирусах гриппа человека, и могут предшествовать респираторным симптомам на неделю. В одном из сообщений описывались два пациента, у которых не было респираторных симптомов, однако была энцефалопатия и диарея.

Симптомы инфекции нижних дыхательных путей проявлялись не только в начале заболевания, но и сохраняются в дальнейшем. Одышка появлялась через 5 дней после начала заболевания. Общими симптомами являлись дыхательная недостаточность, тахипноэ и потрескивание при вдохе.

Количество мокроты, иногда с примесью крови варьировалось у разных пациентов. Почти у всех пациентов клиническим проявлением заболевания было воспаление лёгких. Рентгенологические исследования показывали наличие диффузных, мультифокальных и очаговых инфильтратов, на бронхограмме визуализируются интерстициональные инфильтраты.

Рентгенологические изменения появлялись в течение 5 дней после начала заболевания. В Хошимине во Вьетнаме самым распространенным изменением у только поступивших пациентов было многоочаговое уплотнение по крайней мере двух зон на бронхограмме. Случаи плеврального выпота были редки. Данные микробиологических исследований говорят о том, что это процесс возникает при первичной лёгочной пневмонии без бактериальной инфекции на момент госпитализации. Прогрессирование дыхательной недостаточности было связано с наличием диффузных, двусторонних инфильтратов и проявлением острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). В Тайланде время от начала заболевания до развития ОРДС составляло в среднем 5 дней. Общими признаками заболевания являлись полиорганная недостаточность с признаками дисфункции почек и патология сердца, в том числе дилатация сердца и суправентрикулярная тахиаритмия. Другими осложнениями были пневмония, легочное кровотечение, пневмоторакс, панцитопения, синдром Рейе, а также сепсис.

Летальность среди госпитализированных пациентов была высокой, хотя общий уровень летальности, скорее всего, значительно ниже. В отличие от 1997 года, когда большинство летальных случаев приходилось на пациентов старше 13 лет современный вирус гриппа А H5N1 вызывает высокий уровень смертности среди младенцев и маленьких детей. В Тайланде смертность составила 89 процентов среди лиц моложе 15 лет. Смерть наступала в основном на 9 или 10 день от начала заболевания, большинство пациентов умирало в основном от прогрессирующей лёгочной недостаточности.

Общими лабораторными признаками заболевания были лейкопения, в основном лимфопения, лёгкая или умеренная тромбоцитопения и слабо или умеренно повышенный уровень АЛТ. Одним из признаков заболевания также является гипергликемия, которая может быть связана с приёмом кортикостероидов или повышения уровня креатинина. В Тайланде повышенный риск смерти наблюдался у пациентов, поступивших с низким уровнем лейкоцитов, тромбоцитов и лимфоцитов.

Диагностика вируса гриппа А H5N1 включает вирусовыделение и обнаружение РНК вируса подтипа Н5, или оба метода. В отличие от вирусов гриппа А человека вирус птичьего гриппа H5N1 ассоциирован с более высокой частотой обнаружения вируса и более высоким уровнем вирусной РНК в фаренгиальном секрете, а не в назальном. Во Вьетнаме вирусная РНК обнаруживалась в носоглоточных смывах начиная со 2 до 15 дня после начала заболевания (в среднем через 5 дней), а вирусная нагрузка на 4-8 день после начала заболевания была в 10 раз выше у пациентов с вирусом гриппа А H5N1, чем у пациентов с вирусами гриппа А подтипов H3N1 и H1N1.

Большинству госпитализированных с диагнозом «птичий грипп»

пациентам, в первые 48 часов после поступления, потребовалась искусственная вентиляция лёгких, а также интенсивная терапия при полиорганной недостаточности и иногда при гипотонии. У большинства пациентов наряду с эмпирической терапией антибиотиками широкого спектра действия использовались противовирусные средства, иногда совместно с кортикостероидами. При медикаментозной терапии на поздних стадиях заболевания эффективность терапии была ниже, чем при противовирусной терапии, начатой на ранних стадиях заболевания.

Активный вирус обычно исчезал через 2-3 дня после начала терапии озельтамивиром, однако были описаны летальные случаи ранней терапии озельтамивиром с отсутствием уменьшения вирусной нагрузки в носоглотке (Peiris J.S. et al., 2004).

–  –  –

Исследования изолятов вируса птичьего гриппа А H5N1, выделенных от пациентов в 1997 году, показали наличие таких факторов вирулентности, как наличие гемагглютинина, с высокой расщепляющей способностью, который активируется клеточными протеазами, замена в гене РА2 (Glu627Lys), усиливающая репликацию и замена в гене NS1 (Asp92Glu), приводящая к повышению устойчивости к ингибиторам интерферона и ФНО- in vitro и пролонгированной репликации в свиньях, а также повышенной выработке цитокинов, в особенности ФНО- в макрофагах человека, подверженных воздействию вирусных частиц. Исследования вируса гриппа А H5N1, проводимые с 1997 года показывают, что этот вирус продолжает эволюционировать, меняется его антигенная структура, расширяется диапозон птиц-хозяев инфекции и появляется способность инфицировать кошачьих, усиливается патогенность у экспериментально заражённых мышей и хорьков, у которых он вызывает системную инфекцию и увеличивается стабильность вируса в окружающей среде.

Филогенетический анализ показал, что Z генотип стал доминантным и что вирус эволюционировал в два различных клайда, первый клад охватывает все изоляты из Камбоджи, Лаоса, Малайзии, Таиланда и Вьетнама, второй клайд охватывает изоляты из Китая, Индонезии, Японии и Южной Кореи. Недавно выделенный кластер изолятов появился в северном Вьетнаме и Тайланде, который включает разнообразные замены около рецепторсвязывающего сайта и один остаток аргинина в полиосновном сайте расщепления гемагглютинина. Однако важность этих генетических и биологических изменений для человеческой эпидемиологии и вирулентности не определена. Также различают Цинхай-Сибирский генотип H5J 2.2 а также Уссурийский генотип H5J 2.3.2.

Вирусологическое течение гриппа А человека H5N1 полностью не охарактеризовано, но исследования госпитализированных пациентов показывают увеличение репликации вируса. В 1997 году вирус обнаруживался в среднем через 6,5 дней (от 1 до 16) после инфицирования, в Тайланде интервал от начала заболевания до первых выделенных изолятов составлял от 3 до 16 дней. Вирус реплицируется в носоглотке меньше, чем вирус гриппа человека, поэтому необходимы исследования нижних дыхательных путей. Семь из девяти образцов фекалий содержали РНК вируса, в то время как в образцах мочи вируса не содержалось. Высокая частота развития диареи у заболевших людей, а также наличие РНК вируса в образцах фекалий, в одном случае даже инфекционного вируса, говорит о том, что вирус размножается в желудочно-кишечном тракте. Результаты вскрытия также подтвердили эти наблюдения.

У высокопатогенного вируса гриппа А H5N1 есть последовательность аминокислот в сайте расщепления гемагглютинина, отвечающая за распространение вируса среди птиц. Инвазивная инфекция была зарегистрирована у млекопитающих, а у человека шесть из шести образцов сыворотки содержали РНК вируса через 4-9 дней после начала заболевания.

У пациента инфекционный вирус и РНК вируса обнаруживалась в крови, спинномозговой жидкости и кале. Остаётся неизвестным, возможна ли передача вируса с кровью и калом.

Относительно низкая частота развития птичьего гриппа H5N1 у человека, несмотря на широко распространённые контакты с больной птицей, указывает на то, что преодоление видового барьера играет значительную роль в восприимчивости вируса. Наличие нескольких случаев заболевания среди членов одной семьи может быть вызвано общими факторами риска, также на восприимчивость к болезни могут повлиять генетические факторы.

Патогенез заболевания также зависит от врождённого иммунитета к вирусу гриппа А H5N1. Во время вспышки в 1997 году у отдельных пациентов наблюдалось повышение уровня интерлейкина-6, ФНО-, интерферона- и растворимого рецептора интерлейкина-2, а в 2003 году у пациентов на 3-8 день после начала заболевания повышался уровень IP-10 (интерферон индуцированный белок 10), CCL2 (белок хемоаттрактант моноцитов 1) и MIG (монокины, индуцированные интерфероном- ). У умерших пациентов уровень медиаторов воспаления (интерлейкина- 6, интерлейкина-8, интерлейкин- 1 и CCL2) в плазме крови был выше, чем у выживших пациентов. Средний уровень интерферона- в плазме крови у умерших от птичьего гриппа пациентов был в 3 раза выше, чем у здоровых людей. Такой иммунный ответ у многих пациентов является частью респираторного дистресс-синдрома, полиорганной недостаточности и сепсиса.

Специфический гуморальный иммунный ответ на вирус гриппа А H5N1 обнаруживали у выживших пациентов с помощью реакции микронейтрализации на 10-14 день после начала заболевания. Приём кортикостероидов может замедлить или уменьшить иммунный ответ.

Ограниченное число посмертных исследований описывали серьёзную лёгочную травму с гистопатологическими изменениями в диффузных повреждениях альвеол, что соответствует полученным данным о развитии пневмонии при инфицировании вирусами гриппа человека. К гистопатологическим изменениям относились заполнение альвеолярных пространств фибринозным экссудатом и эритроцитами, формирование гиалиновой мембраны, сосудистая гиперемия, инфильтрация эритроцитов интерстициальное пространство, а также пролиферация реактивных фибробластов. Происходит заражение пневмоцитов II типа. Биопсия костного мозга показала наличие реактивного гистиоцитоза с гемофагоцитозом у некоторых пациентов, также при вскрытии было отмечено наличие лимфоидного истощения и атипичных лимфоцитов в лимфоидной ткани и селезенке. В некоторых случаях отмечался некроз печени и острый тубулярный некроз.

Всех пациентов с острыми респираторными заболеваниями в странах и на территориях которых отмечались случаи инфицирования вирусом гриппа А H5N1животных необходимо обследовать на наличие гриппа А H5N1, особенно людей, контактировавших с птицей. Однако некоторые вспышки у птиц обнаруживали только после обнаружения вируса у людей. Раннее обнаружение заболевания осложняется неспецифическими начальными проявлениями заболевания и высоким темпом развития фоновых острых респираторных заболеваний. В регионах с подтверждёнными случаями заражения людей и животных вирусом гриппа А H5N1 обязательно проверяют всех пациентов с серьёзной неизвестной болезнью (например, энцефалопатией или диареей) на наличие птичьего гриппа.

Диагностическая ценность различных типов образцов и вирусологических анализов ещё не полностью определена. В отличие от вирусов гриппа человека, при инфицировании вирусом птиц H5N1 большее диагностическое значение имеют образцы, взятые из глотки, чем образцы, взятые из носа. Для раннего выявления вируса гриппа больше подходят пробы из дыхательных путей, но чувствительность анализа сильно зависит от специфичности праймеров и метода анализа (ВОЗ, 2005).

2.4. Способы детекции вируса гриппа и антител к нему

Детекция вируса гриппа состоит из выделения вируса и обнаружения и характеристики фрагментов его генома.

Идентификация вируса. В аллантоисную полость 9-11 дневного куриного эмбриона вносят суспензию, представляющую собой ротоглоточный или клоакальный мазок, взятый у живых птиц или фекалии и объединённые пробы органов от мёртвых птиц. Эмбрионы инкубируют при 370С в течение 2-7 дней. Далее проверяют аллантоисную жидкость на наличие гемагглютинирующей активности, проверяют также аллантоисную жидкость у эмбрионов, умерших во время инкубации. Наличие вируса гриппа А также может быть подтверждено методом иммунодиффузии концентрированного вируса и антисыворотки к нуклеокапсидному или матричному антигену, которые являются общими для всех вирусов гриппа А.

На сегодняшний день большинство случаев инфицирования людей вирусом гриппа H5N1 происходит при тесном (обычно прямом) контакте с инфицированными птицами. Эпидемиологические наблюдения позволяют предположить, что в не которых случаях имеет место передача вируса от человека к человеку при очень тесном контакте (например, лицом к лицу).

Инфицирование возможно при вдыхании инфекционной единицы или путем прямого контакта и попадания вируса в нос, глаза или, возможно, в рот.

Заражение через глаза происходит при инфицировании конъюнктивы или если инфицированной водой промывают слёзные протоки и носоглотку.

Существует несколько подтверждений того, что инфицирование желудочно-кишечного тракта и глотки может произойти после начала заболевания. Инфицирование не происходит через неповреждённую кожу.

Вирусные частицы размером больше 5 микрон могут передаваться воздушнокапельным или механическим путем. Вирус не может долго существовать в сухой окружающей среде, но может сохраняться в течение недели во влажной среде, защищенной от прямых солнечных лучей. На сегодняшний день не доказано инфицирование вирусом при попадании его на кожу во время ухода за больными или при отборе пробы. Использование индивидуальных средств защиты является обязательным, если ожидается прямой контакт с пациентом, при отборе проб от диких птиц и млекопитающих и при принятии образцов от домашней птицы.

Уровень используемой индивидуальной защиты определяется риском инфицирования. Например, при работе в птицеводческом хозяйстве, где инфицированный материал может накапливаться и в воздухе присутствует много контаминированной пыли, требуется более высокий уровень индивидуальной защиты, чем при отборе проб от диких птиц. Юн и Вонг (2005) рекомендуют в связи с высокой смертностью от этой болезни соблюдать контактные и воздушно-капельные меры предосторожности, пока позволяют ресурсы, несмотря на то, что относительная важность этих мер при внутрибольничной передаче вируса гриппа H5N1 пока не известна.

Средства индивидуальной защиты должны включать защиту органов дыхания подходящей формы, нестерильные латексные перчатки, очки или защитную маску, халат и головной убор. Также может быть необходим непроницаемый фартук и резиновые сапоги. Деятельность, сопряжённая с высоким риском заражения, как, например, посмертная экспертиза подтверждённых или предполагаемых случаев заболевания человека, отлов птиц в птичниках и на фермах, эвтаназия инфицированных и предположительно инфицированных птиц и животных, а также такие процедуры как обеззараживание сельскохозяйственных объектов, должны проводиться только в специальном защитном комбинезоне, резиновых сапогах, в тяжёлых резиновых перчатках и с защитой для глаз.

Золотое правило диагностики вируса гриппа H5N1 гласит, что нельзя анализировать в одной лаборатории клинические образцы от людей и от животных. Однако они могут анализироваться в одном учреждении при чётком и ясном разделении рабочих помещений для животных и для людей.

Это необходимо для исключения риска перекрёстного загрязнения образцов от людей и животных (WHO, 2006).

Все вирусы гриппа относятся к группе патогенности III микроорганизмов, из-за высокой вирулентности и способа передачи.

Диагностику вируса гриппа А подтипа H5N1 проводят в лабораториях третьего уровня биологической безопасности. Лаборатория должна быть отделена от других частей здания, в которых разрешен свободный проход.

Дополнительная изоляция достигается посредством размещения лаборатории в тупиковом конце коридора с использованием внутренних перегородок и дверей или же вестибюля. Поверхность стен, пола и потолков должна быть водостойкой и легко моющейся. Отверстия и щели на этих поверхностях (например, для выводных труб) должны быть герметично заделаны для обеспечения деконтаминации помещений. Лабораторные комнаты должны быть герметизированы для предотвращения контаминации. С этой же целью проектируется и система вентиляции. Окна должны быть закрыты, герметизированы и оснащены небьющимися стеклами. У выходной двери каждой лаборатории должны быть оборудованы автоматические краны для мытья рук. Необходимо установить управляемую вентиляционную систему для обеспечения отрицательного давления внутри лаборатории, с тем, чтобы воздух шел в сторону рабочих помещений лаборатории. Боксы биологической безопасности должны быть расположены вдали от проходов и вне потоков воздуха от входных дверей и вентиляционных систем (ВОЗ, 2004).

–  –  –

На сегодняшний день иммуноферментный анализ (ИФА) является одной из самых чувствительных и легко воспроизводимых технологий. Этот вид анализа отличается такими качествами как быстрота, простота в использовании и лёгкая автоматизация данной технологии (Lequin R., 2005).

Различные модификации ИФА позволяют как определять вирус гриппа, так и антитела к нему.

Как и для любого другого анализа, воспроизводимость и достоверность ИФА зависит от чёткого выполнения всех стадий анализа и от точности их выполнения. ИФА является экспресс-методом, используемым для выявления и количественного определения антител или антигенов вирусов и бактерий (Van Weemen B.K., 1971). Этот метод часто используется в птицеводстве и животноводстве для обнаружения различных инфекционных агентов. В иммуноферментном анализе в качестве твёрдой фазы чаще всего выступает 96-луночная полистироловая панель, также иногда используются другие материалы. Главной задачей твёрдой фазы является иммобилизация антигена или антитела в образце, посредством связывания его с твёрдой фазой. После инкубации панель промывают, чтобы удалить весь несвязавшийся материал.

При определенных видах ИФА на этой стадии на панель добавляют конъюгат, а затем инкубируют. Конъюгат представляет собой либо антиген либо антитело, меченное ферментом (Qigai He, 2007).. В зависимости от вида анализа конъюгат связывается или с твёрдой фазой или с образцом, панель снова промывают и добавляют ферментный субстрат (пероксид водорода и хромоген), затем инкубируют. Появляется окрашивание при связывании фермента, анализируемое при определенной длине волны (Егоров А.М., 1991).

–  –  –

До изобретения ПЦР молекулярные биологи использовали последовательности нуклеиновых кислот для создания «гибридизационных»



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
 
Похожие работы:

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) Специальность 03.02.08 – Экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д-р биол. наук, профессор М.Н. Смирнов Красноярск 201 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Изученность экологии марала.. Биология марала.. 9...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«КЛЁНИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА УЖОВЫЕ ЗМЕИ (COLUBRIDAE) ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА: МОРФОЛОГИЯ, ПИТАНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бакиев А.Г. Тольятти – 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. К...»

«АУЖАНОВА АСАРГУЛЬ ДЮСЕМБАЕВНА ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И БИОПРЕПАРАТА РИЗОАГРИН НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ, АДАПТИВНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ТУРТУЕВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА РАЗРАБОТКА СБОРА НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор НИКОЛАЕВА ГАЛИНА ГРИГОРЬЕВНА Улан-Удэ – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Абдуллоев Хушбахт Сатторович ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Макаров Владимир Владимирович...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.