WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Храмцов Павел Викторович

ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ

НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К



КОКЛЮШУ, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКУ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Раев Михаил Борисович Челябинск – 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Обзор методов количественной диагностики антител к коклюшу, дифтерии и столбняку

1.1. Реакция нейтрализации токсинов in vivo

1.2 Реакция нейтрализации токсинов in vitro

1.3. Иммуноферментный анализ

1.4. Агглютинационные тесты

Глава 2. Современные подходы к твердофазному дот-иммуноанализу.

............. 15

2.1. Улеродные наночастицы в иммунодиагностике

2.2. Подходы к оценке результатов анализа

2.3. Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Материалы

Глава 4. Методы

4.1.Количественное определение антител к коклюшу, дифтерии и столбняку в сыворотках крови

4.2. Оценка гомогенности белковых препаратов, использовавшихся в работе.. 23

4.3. Синтез углеродного диагностикума

4.4.Измерение обратного динамического светорассеяния

4.5. Измерение интенсивности диагностического сигнала в твердофазном анализе

4.6. Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Концепция и формат иммуноанализа, твердофазный реагент, диагностические пороги теста

Глава 6. Характеристика реагентов, использовавшихся при конструировании тест-системы

Глава 7. Оптимизация процедуры оценки результатов анализа

7.1. Воспроизводимость измерений интенсивности сигнала

7.2. Подбор фактора коррекции гаммы изображения

Глава 8. Оптимизация процедуры анализа

8.1. Подбор оптимальной концентрации диагностического реагента.................. 42

8.2. Подбор режима блокирования неспецифических взаимодействий............... 46

8.3. Подбор оптимальных концентраций анти-лигандов и длительности инкубации с сыворотками крови

8.4. Оптимизация условий детекции противококлюшных антител

8.5. Подбор оптимальных условий детекции столбнячных и дифтерийных антител

Глава 9. Определение аналитических характеристик тест-системы

9.1. Воспроизводимость детекции антител к коклюшу, дифтерии и столбняку, профиль точности анализа

9.2. Параллелизм

Глава 10. Исследование сывороток крови при помощи референсных тест-систем

10.1. Содержание антител к коклюшу у детей различных возрастных групп..... 63

10.2. Содержание дифтерийного и столбнячного антитоксинов у детей............ 66 Глава 11. Апробация сконструированной дот-иммуноаналитической тестсистемы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Вакцинация в настоящее время является основным инструментом профилактики целого ряда инфекционных заболеваний. В значительной степени благодаря стабильно высокому охвату населения прививками удалось добиться практически полной элиминации ряда опасных инфекционных заболеваний [11, 18, 37, 53, 66, 154].

Эффективность вакцинопрофилактики обеспечивается высокими уровнями охвата населения профилактическими прививками, а также проведением регулярного мониторинга напряженности поствакцинального иммунитета на региональном уровне [16].





Серологический контроль позволяет выявлять территории с низким уровнем защиты от инфекций и приступить к выяснению и ликвидации причин такого явления. Негативно влиять на результативность вакцинации могут такие факторы, как высокий уровень техногенного [10, 14, 15, 28, 30, 32, 69, 71, 77, 153], нарушения режимов транспортировки и хранения отдельных партий вакцин [1, 5, 6, 27]. Серологический мониторинг является единственным инструментом контроля вакцинопрофилактики инфекций, близких к полной элиминации или проявляющих себя лишь спорадически: дифтерии, столбняка, кори и т.д., когда изменение уровня заболеваемости не может быть использовано в качестве индикаторного показателя.

Настоящая работа направлена на разработку серологической тест-системы, предназначенной для оценки состояния поствакцинального иммунитета, которая могла бы стать альтернативой традиционным иммуноферментным и агглютинационным тестам. Особенностью предлагаемой тест-системы является мультианалитность, т.е. возможность детекции антител к нескольким инфекциям, а именно коклюшу, дифтерии и столбняку в одной постановке. Коклюшнодифтерийно-столбнячная вакцина была выбрана в качестве модели ввиду высокой реактогенности ее цельноклеточного варианта [36], а также по причине сложной текущей ситуации с заболеваемостью коклюшем как в РФ, так и в других странах мира [2, 31, 41, 55, 58, 64, 82, 84, 85, 93, 126, 145, 160].

Цель исследования Создание системы серологической диагностики, предназначенной для оценки напряженности поствакцинального иммунитета к коклюшу, дифтерии и столбняку на основе треханалитного твердофазного иммуносорбента и диагностического реагента, представляющего собой наноразмерные частицы углерода, конъюгированные с G белком стрептококка.

Задачи исследования Подобрать компоненты систем анализа, а также условия его 1.

постановки, оптимальные одновременно для детекции антител к дифтерийному анатоксину, столбнячному анатоксину и антигенам коклюшного возбудителя;

Оформить сконструированную тест-систему в оптимальной для 2.

практического применения процедурной аранжировке, верифицировать её диагностическую значимость;

Провести испытания разработанной тест-систем на клиническом 3.

материале в параллельном сравнении с коммерческими аналогами.

Методология и методы исследования Методологическую основу работы составляют принципы конструирования, оптимизации, валидации и апробации количественных, полуколичественных и качественных серологических тест-систем.

Первый этап работы был посвящен конструированию тест-системы, предназначенной для единовременной детекции антител к антигенам коклюша, дифтерии и столбняка. В ходе реализации первого этапа производили подбор компонентов иммунодиагностической системы: антигенов коклюшного, дифтерийного и столбнячного микробов, материала твердой фазы, блокирующих реагентов. Оптимизировали процедуры блокирования, детекции антител при помощи углеродного диагностикума. Подбирали оптимальные условия детекции антител к антигенам каждого из возбудителей. Подбор оптимальных компонентов и условий постановки анализа производили, используя метод шахматного титрования и анализируя полученные с его помощью калибровочные кривые.

Второй этап работы включал в себя определение аналитических характеристик сконструированной тест-системы (воспроиводимость, параллелизм), ее апробацию при помощи сывороток детей, вакцинированных цельноклеточной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной, а также сопоставление результатов с результатами референсных иммуноферментных и агглютинационных тестов.

В работе использованы статистические методы исследования: ROC-анализ, каппа-статистика Коэна, Т-тест Стьюдента и U-тест Манна-Уитни.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Результаты получены на сертифицированном оборудовании. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках по данной тематике. В работе использованы современные методики сбора и обработки исходной информации с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA), GraphPad Prism (GraphPad Software, США).

Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции «40 лет НИИОЧБ».

Санкт-Петербург, 2014; Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины», Екатеринбург, 2014; XII Конференции иммунологов Урала, Пермь, 2015.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем д.б.н. Михаилом Борисовичем Раевым, в.н.с. лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН Цель и задачи сформулированы совместно с научным руководителем. Дизайн исследования разработан лично диссертантом. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично диссертантом.

Получение и интерпретация клинико-анамнестических данных осуществлялись лично диссертантом. Все экспериментальные и технологические исследования проведены лично диссертантом. Образцы сывороток крови детей были получены из ГДКП №5, г. Пермь (заведующий лабораторией к.м.н. Нина Борисовна Шемякина). Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично.

Положения, выносимые на защиту Сконструированная и оптимизированная дот-иммуноаналитическая 1.

тест-система, позволяет осуществлять полуколичественную детекцию противодифтерийных и противостолбнячных антител, а также качественную детекцию противококлюшных антител в одной постановке;

Разработанная тест-система пригодна для оценки напряженность 2.

поствакцинального иммунитета при введении цельноклеточной коклюшнодифтерийно-столбнячной вакцины, что обеспечивает возможность ее использования для контроля эффективности иммунизации.

Научная новизна Разработана оригинальная тест-система, предназначенная для одновременной полуколичественной детекции антител к коклюшу, дифтерии и столбняку при помощи суспензии функционализированных углеродных наночастиц. Впервые синтезирован иммуносорбент на основе антигенов возбудителей коклюша, дифтерии и столбняка, предназначенный для постановки дот-иммуноанализа. Исследована зависимость кинетики взаимодействия антител с сорбированными на твердую фазу антигенами дифтерии, столбняка и коклюша от таких факторов как длительность инкубации и концентрация анти-лиганда Теоретическая и практическая значимость работы Разработка мультианалитных тест-систем сопряжена с необходимостью подбора условий постановки анализа, которые являлись бы оптимальными одновременно для каждого из аналитов (лигандов). Основная сложность процесса оптимизации мультианалитных серологических тестов связана с различным влиянием физико-химических факторов (температура, влажность, концентрация белка, природа твердой фазы, состав буферов и т.д.) на кинетику взаимодействия каждой отдельной пары антиген-антитело. Теоретическая значимость настоящей работы состоит в исследовании условий и закономерностей взаимодействия противоинфекционных антител с соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Полученные данные и разработанные методологические подходы являются теоретической базой для конструирования тест-систем, предусматривающих одновременную детекцию различных антител к различным антигенам как в комплексном, так и в раздельном состоянии.

Сконструированная серологическая тест-система может быть использована для оценки поствакцинального иммунитета в аспекте наличия защитного уровня антител. Кроме того, по результатам тестирования возможно формулирование рекомендаций относительно сроков дальнейшего серологического контроля и вакцинации для дифтерии и столбняка. Разработанная тест-система предназначена для использования в клинических лабораториях независимо от их приборной оснащенности.

В ходе апробации тест-системы было продемонстрировано значительное расхождение результатов серологического анализа на антитела к коклюшу при использовании цельноклеточного коклюшного антигена и очищенного препарата коклюшного токсина в качестве анти-лигандов. В частности, при вакцинировании детей клеточной коклюшной вакциной не наблюдалось значимого увеличения концентрации антител к токсину, но возрастал титр агглютининов. Полученные данные заставляют уделить повышенное внимание методам оценки противококлюшного иммунитета у детей и еще раз переосмыслить целесообразность использования для этой цели ИФА, результаты которого не могут быть корректно интерпретированы ввиду отсутствия данных о защитных концентрациях антител к конкретным антигенам Bordetella pertussis. Помимо этого, апробация тест-системы продемонстрировала высокий уровень противостолбнячного и противодифтерийного иммунитета среди вакцинированных детей. Выявленное возрастание титров антител к возбудителю коклюша (как агглютининов, так и антитоксина) у детей старшего возраста наглядно демонстрирует наличие скрытой циркуляции возбудителя в популяции и подтверждает результаты проведенных ранее исследований.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в практику исследовательской деятельности лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН и используются для оценки продуктивности клеточных культур, продуцирующих иммуноглобулины (гибридомная технология), оценки интенсивности иммунного ответа у иммунизированных лабораторных животных, мониторинга процесса аффинной очистки иммуноглобулинов (Храмцов П.В. и др. Применение диагностикума на основе функционализированных углеродных наночастиц для мониторинга аффинной очистки иммуноглобулинов // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. №6. С. 612-618.).

Благодарности Автор выражает благодарность своему научному руководителю д.б.н.

Михаилу Борисовичу Раеву за помощь, которую он оказывал на всем протяжении выполнения работы, а также всему коллективу лаборатории экологической иммунологии (заведующий лабораторией к.м.н., доцент Борис Аркадьевич Бахметьев) за оказанную помощь и поддержку.

Автор благодарит заведующую клинической лабораторией ГДКП №5 г.

Перми, к.м.н. Нину Борисовну Шемякину за помощь в сборе материала для исследований, а также д.м.н., профессора Ирину Викторовну Фельдблюм за ряд весьма полезных консультаций, касающихся вакцинопрофилактики дифтерии, столбняка и коклюша.

–  –  –

В настоящей главе рассмотрен ряд диагностических инструментов, позволяющих производить оценку гуморального иммунитета к дифтерии, столбняку и коклюшу. Сгруппированы они по базовому принципу и способу детекции.

1.1. Реакция нейтрализации токсинов in vivo Реакция нейтрализации токсина in vivo считается «золотым стандартом» для количественного определения столбнячного антитоксина [45]. В случае антител к дифтерии этот тест имеет лишь исторический интерес [131]. Для постановки реакции со столбнячным токсином обычно используются мыши, а с дифтерийным токсином – морские свинки или кролики. Принцип реакции нейтрализации состоит в инъекции мышам смеси столбнячного токсина с разведениями исследуемой сыворотки крови и учете количества выживших/погибших животных в сравнении с референсной сывороткой. Возможны вариации метода, учитывающие динамику гибели животных в течение установленного временного отрезка, количество животных, выживших по окончании выбранного временного промежутка, либо оценивающие степень выраженности симптомов паралича у животных [115]. В случае дифтерийного токсина производится оценка наличия или отсутствия воспалительной реакции.

Реакция нейтрализации токсина in vivo является чувствительным методом детекции, она позволяет выявлять концентрации столбнячного антитоксина равные тысячным долям МЕ/мл. Тем не менее, сложность постановки, необходимость использования животных и наличия высококвалифицированного персонала вкупе с длительностью не позволяют рассматривать его в качестве удобного для массового использования инструмента детекции антитоксинов.

1.2 Реакция нейтрализации токсинов in vitro Реакция нейтрализации дифтерийного токсина основана на способности токсина к подавлению роста культур клеток. Впервые токсический эффект дифтерийного токсина на клеточные культуры был продемонстрирован Levaditi и Muttermilch [92]. Традиционно для постановки теста используется линия клеток Vero, поскольку они столь же чувствительны к воздействию дифтерийного токсина, как и человеческие клетки [72]. Жизнеспособность клеток оценивают при помощи добавлении к культуре красителя (например, фенолового красного), цвет которого изменяется при наличии в среде бактериальных метаболитов. Данный подход впервые был использован для количественного определения дифтерийного антитоксина в работе [118] и является адаптацией метода Salk с соавт. [129].

Традиционная процедура [104] для постановки реакции нейтрализации в планшетах:

Приготовление серийных разведений исследуемой антисыворотки в лунках 96-луночного микропланшета;

Добавление в каждую лунку дифтерийного токсина в установленной концентрации;

Внесение в лунки клеток Vero в количестве 2х105 живых клеток/мл;

Инкубация при 37°С в течение 3-4 дней;

Определение окрашивания среды в лунках при помощи спектрофотометра;

Определение концентрации антитоксина в исследуемой сыворотке в сравнении со стандартом.

Несомненным достоинством реакции нейтрализации является то, что она представляет собой функциональный тест. Она позволяет определять лишь концентрацию антител, обладающих способностью нейтрализовать летальное действие токсина на клетки, а не просто связываться с ним. Высокая чувствительность и воспроизводимость теста обусловливают его использование в качестве референса при количественном определении дифтерийного антитоксина.

Тем не менее, высокая стоимость и длительность постановки анализа ограничивают возможность его повсеместного использования в диагностической практике.

На настоящий момент аналогичный метод для количественного определения столбнячного антитоксина не разработан.

1.3. Иммуноферментный анализ Наиболее популярным методом определения антител к возбудителям коклюша, дифтерии и столбняка является иммуноферментный анализ (ИФА).

Метод основан на количественной приборной оценке интенсивности цветной ферментативной реакции, происходящей при наличии в пробе аналита. Нет необходимости уделять внимание детальному описанию принципов ИФА, поскольку этот метод анализа применяется практически во всех современных диагностических лабораториях. Стоит лишь отметить, что наиболее обычным в серодиагностике коклюша, дифтерии и столбняка является непрямой вариант ИФА, в котором твердую фазу сенсибилизируют антигеном возбудителя, иммуносорбент инкубируют с исследуемым образцом, после чего связавшиеся с твердой фазой антитела детектируют при помощи антивидового ферментного конъюгата.

Методика постановки ИФА для количественного определения столбнячного антитоксина была впервые описана в работах [141, 91]. Длительность анализа могла достигать нескольких суток, однако результаты тестов демонстрировали хорошую корреляцию с титрами, полученными при помощи радиоиммуносорбентного теста. На несколько лет позднее были разработаны более оперативные варианты ИФА [99, 133]. В последние годы были предприняты попытки создать ИФА-тесты, основанные на применении авидин-биотиновой реакции [7, 17, 43].

Загрузка...
В работах Вязниковой и Николаевой авидин-биотиновая система использована также для выявления антител к дифтерийному токсину и антигену возбудителя коклюша. Сравнение результатов ИФА и реакции нейтрализации in vivo выявило хорошую согласованность при высоких концентрациях столбнячного антитоксина в пробах (0,2 МЕ/мл) [136, 137]. Для низкотитражных сывороток в ИФА отмечаются завышенные результаты в сравнении с референсом. В 1987 г. была разработана методика конкурентного ИФА решившая проблемы расхождения результатов ИФА и РН [137, 79]. В дальнейшем эта методика была усовершенствована при помощи использования меченного ферментом анатоксина для ингибирования реакции «токсин-анатоксин» вместо антивидового конъюгата [88]. Аналогичный вариант конкурентного ИФА был разработан для количественного определения антител к дифтерийному токсину.

В ходе создания и совершенствования методики постановки ИФА для определения дифтерийного антитоксина была обнаружена аналогичная описанной выше взаимосвязь результатов ИФА и реакции нейтрализации in vitro: высокая степень согласованности для высокотитражных сывороток и низкая – для низкотитражных [100].

Иммуноферментные тесты для детекции антител к очищенным антигенам коклюшного микроба описаны в целом ряде работ [42, 46, 70, 101, 163].

Существуют также публикации, в которых продемонстрировано использование цельных [63, 107] и разрушенных ультразвуком [90] клеток коклюшного микроба в качестве анти-лиганда в ИФА. Отсутствие «золотого стандарта» в серологической диагностике коклюша, а также недостаточные знания о вкладе антител к отдельным антигенам в противококлюшный иммунитет не позволяют объективно оценить и сравнить перечисленные методы. Более подробно этот вопрос обсуждается в главе, посвященной подбору коклюшного антигена, который будет использован в качестве анти-лиганда.

Иммуноферментный анализ по праву является наиболее популярным методом серологической диагностики. Для ИФА-тестов характерна оперативность (длительность теста, включая пробоподготовку, в пределах трех часов), возможность автоматизации, большой выбор считывающей аппаратуры, объективность анализа. Тем не менее иммуноферментный анализ не дает возможности документировать и сохранять результаты теста, его применение ограничено наличием специализированного оборудования и специалистов с достаточно высокой квалификацией. Немало важным фактом является токсичность и ограниченная годность используемых в наборах хромогенов. Кроме того, не стоит забывать, что инструментальные тесты требуют не только наличия прибора, но и его исправной работы. Выход прибора из строя может помешать нормальной работе лаборатории. По этим причинам в нашей стране в настоящее время остаются популярными неинструментальные агглютинационные тесты.

1.4. Агглютинационные тесты Реакция агглютинации (РА) – традиционный метод серодиагностики коклюша. Суть метода заключается в длительной (около суток) инкубации взвеси коклюшного микроба с кратными разведениями исследуемой сыворотки крови.

При наличии в ней антител к B. pertussis иммунные комплексы «бактерияантитело» выпадают в осадок, который можно разглядеть невооруженным взглядом. Снижение концентрации антител в ходе титрования сыворотки сопровождается снижением объема осадка и исчезновением его в лунках с высокими разведениями сыворотки. Разведение сыворотки крови, дающее снижение объема осадка до определенного уровня соответствует титру антител.

Согласно данным ВОЗ, РА позволяет выявить в первую очередь антитела к фимбриям, пертактину и липоолигосахариду [65].

Для полуколичественной оценки уровня антител к дифтерии и столбняку традиционно используется реакция пассивной гемагглютинации. Для ее постановки используют иммуносорбент, представляющий собой эритроциты человека, барана или лошади, сенсибилизированные дифтерийным или столбнячным анатоксином.

Фиксированный объем эритроцитов инкубируют с кратными разведениями исследуемых сывороток крови. Титр антител определяют по разведению, в котором степень агглютинации падает до указанного уровня. Для корректной постановки теста требуется предварительное удаление из нее неспецифических гемагглютининов, методом истощающей инкубации с несенсибилизированными эритроцитами барана. Процедура истощения занимает несколько часов, усложняет процесс подготовки пробы, а также отсрочивает получение результата. В целом, результаты агглютинационных тестов достаточно слабо коррелируют с результатами, полученными при помощи культуральных тестов и тестов in vivo, в особенности для низких значений титров [45, 138].

Очевидным преимуществом агглютинационных тестов является независимость от наличия приборов, доступность для лаборатории любого уровня.

Негативными сторонами их являются длительность постановки, необходимость титрования сыворотки, субъективность оценки результатов (последняя может быть преодолена при помощи приборной обработки результатов анализа).

Глава 2. Современные подходы к твердофазному дот-иммуноанализу

2.1. Улеродные наночастицы в иммунодиагностике Углеродные наночастицы используются в качестве метки в иммуноанализе с начала 90-х годов. Говоря об особенностях углеродной метки, стоит прежде всего обратить свое внимание на обзор [122], в котором суммированы основные преимущества и недостатки ее использования в иммуноанализе. К преимуществам углеродных наночастиц относится их высокая стабильность к химическим, температурным воздействиям, высокая интенсивность окрашивания, обеспечивающая высокий уровень аналитического сигнала, отличная способность сорбировать белки за счет гидрофобных взаимодействий, коммерческая доступность (поставщиками являются Cabot, Evonik-Degussa, US Research Nanomaterials и др.). Кроме того, углеродные наночастицы могут быть синтезированы самостоятельно в значительных объемах в виде сажи, образующейся при сжигании углеводородов. Конъюгаты углеродных наночастиц с белками обладают высокой стабильностью и способны сохранять свои функциональные свойства в течении нескольких лет [26, 149]. Слабыми сторонами использования углеродных наночастиц в роли маркера являются необходимость введения дополнительных реагентов для получения стабильных суспензий, сложность ковалентной пришивки целевого белка к их поверхности. В связи с последней особенностью, конъюгаты углеродных наночастиц с аффинными соединениями синтезируют преимущественно за счет нековалентных связей.

Впервые такой метод синтеза был описан в работе van Amerongen [149].

Технология стала основой для многочисленных работ по использованию углеродных наночастиц в дот-иммуноанализе и иммунохроматографии [50, 105, 113, 150]. Углеродные наночастицы использовались в неинструментальных тестсистемах для определения онкомаркеров, гормонов, токсинов и т.д. В то же время существует и альтернативный подход к синтезу углеродных диагностикумов, основанный на ковалентной пришивке анти-лиганда к поверхности наночастицы.

Как уже было сказано ранее, инертность углерода затрудняет иммобилизацию биомолекул за счет ковалентных связей. В области создания биосенсоров проблема внедрения функциональных групп в структуру поверхности углеродных наночастиц решается за счет их обработки в жестких физико-химических условиях (длительные воздействия кислот при высокой температуре) или химическими методами (например, за счет диазониевых солей). В лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН в начале 90-х годов была разработана технология ковалентного конъюгирования аффинных соединений с углеродными наночастицами в мягких условиях, подробно описанная в патенте [8]. Суть ее сводится к нековалетной иммобилизации на поверхности углеродных наночастиц инертного белка с последующей ковалентной пришивкой к нему целевого аффинного соединения при помощи глутарового альдегида (или иного гомо/гетеробифункционального агента). Гипотетическая структура наночастицы, функционализированной G белком стрептококка приведена на рисунке (рисунок 1).

Рисунок 1 – Гипотетическая схема функционализированной G белком стрептококка углеродной наночастицы. БСА – бычий сывороточный альбумин Подробно технология синтеза рассмотрена в монографии [21]. Результатом ее реализации являются высокостабильные суспензии углеродных наночастиц (срок хранения более 20 лет) со средним размером 98 нм (рисунок 2). Углеродные наночастицы, конъюгированные со стрептавидином, иммуноглобулинами, G белком стрептоккокка, белком А золотистого стафилококка были использованы при конструировании иммунохроматографических, иммунофильтрационных, дотиммуноаналитических тест-систем [124], предназначенных для выявления белков беременности [22], инфекционных заболеваний [20, 23, 24, 25], оценки уровня специфических иммуноглобулинов в пробах при биотехнологических процессах [39]. Исследования, проведенные Linares с соавт., продемонстрировали, что применение углеродных диагностикумов, синтезированных по технологии [8], позволяет достичь более высокой чувствительности анализа, чем при использовании диагностикума на основе золотых наночастиц [94].

Рисунок 2 – Изображение углеродных наночастиц, конъюгированных с белком стрептококка, полученное при помощи атомно-силовой G микроскопии

2.2. Подходы к оценке результатов анализа Целью настоящей работы является разработка диагностического инструмента, предназначенного для контроля над эффективностью вакцинации, доступного для лаборатории любого уровня материально-технической оснащенности. Изначально мы рассчитывали, что учет результатов анализа, а именно определение титров антител, будет производиться визуально, без применения какой-либо аппаратуры. Изменение концепции тест-системы, предполагающее анализ одного разведения образца сыворотки крови вместо серии разведений, поставило нас перед выбором: либо придерживаться направленности на визуальную детекцию результатов, либо перейти к приборной обработке результатов теста. В первом случае возможно было позаимствовать принцип работы современных коммерческих тест-систем, в частности системы «ImmunoComb» от Biogal. Он заключается в визуальном сравнении интенсивности аналитического сигнала образца с прилагаемым к набору графическим изображением (стандартом). Подобный подход весьма удобен для конечного пользователя и интуитивно понятен, однако сохраняет значительную долю субъективности. Кроме того, его реализация требует значительной степени автоматизации производства твердофазных реагентов и других компонентов анализа для обеспечения надлежащей правильности и воспроизводимости результатов.

Мы решили обратиться к другому подходу оценки результатов анализа, который впервые был предложен еще в 1982 г. в статье Hawkes с соавт. [75]. Он заключается в использовании сканера для оцифровки результатов теста, последующего измерения интенсивности окрашивания аналитической зоны при помощи специализированной программы и построения калибровочной кривой на основе полученных данных. Наиболее подробно применение такого подхода применительно к тестам на основе углеродных диагностикумов было рассмотрено Lonnberg и Carlsson [95]. Как отмечают сами авторы, применение сканера представляет собой компромисс между упрощением процедуры анализа и сохранением объективности оценки результатов. С момента публикации работы применение сканера в иммунодиагностике стало достаточно обычным явлением. В частности, упомянутая выше тест-система «ImmunoComb» предполагает возможность оцифровки результатов при помощи TWAIN-совместимого сканера и последующей их обработки в программе «CombScan», которая предоставляется производителем. Стоит также упомянуть наличие на рынке специализированных программно-аппаратных комплексов для обработки результатов анализа point-ofcare тестов, выполненных в различных форматах (тест-полоски, кассеты, иммунохроматографические стрипы и т.д.): Scannex (Норвегия), EDCO (США).

Многочисленные публикации посвящены использованию сканеров для оценки результатов иммуноанализа [49, 96, 105, 111, 114, 121, 144]. Использование сканера позволяет сделать оценку результатов объективной, обеспечить получение количественного результата с минимальными финансовыми затратами.

Значительную роль играет доступность программ обработки цифровых изображений, позволяющих производить собственно измерение интенсивности сигнала, фона для дальнейшего построения калибровочных кривых. Подобную роль могут выполнять мощные графические редакторы (Adobe Photoshop, Gimp и др.), однако более практично использовать «легковесные» и простые специализированные программы. Примерами таковых являются бесплатные Image Studio Lite (LI-COR Biosciences, США) и ImageJ (NIH, США), доступные для свободного скачивания из сети Интернет или платная TotalLab TL100 (Nonlinear USA Inc., США) [49]. Наличие бесплатных программ анализа изображений от надежных разработчиков, несомненно, способствует возможности повсеместного использования тестов, требующих оцифровки результатов анализа.

2.3. Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования Идея одновременной детекции антител к целому спектру антигенов в одной постановке не является новостью в области имммуноанализа. Разработчики формата дот-иммуноанализа Hawkes, Niday и Gordon в своей пионерской работе [75] продемонстрировали возможность одновременной детекции антител к целому ряду инфекций в сыворотке крови человека. В дальнейшем мультианалитные дотаналитические, иммунохроматографические тесты были описаны в целом ряде научных публикаций. В качестве меток в этих работах использовали ферменты [48, 56, 59; 67, 106], золотые наночастицы [19, 52, 87, 127], частицы коллоидного угля Привлекательной особенностью мультианалитных тестов является [111].

возможность оперативного определения антител к широкому спектру антигенов за короткий промежуток времени. Это является большим преимуществом как для пациента, ввиду быстроты получения результата, так и для лабораторий, ввиду значительного снижения нагрузки на персонал и повышения пропускной способности. Однако, разработка и применение мультианалитных тестов имеет и свои подводные камни, которые рассмотрены в обзоре [147]. Одной из серьезнейших проблем является подбор одинаковых условий для количественной/полуколичественной детекции каждого из аналитов. Разумеется, гораздо более острой эта проблема является в сфере создания биочипов, где количество одновременно детектируемых аналитов может насчитывать десятки и даже сотни. Тем, не менее, разработка треханалитной дот-иммуноаналитической системы требует решения идентичной проблемы по подбору единых оптимальных условий анализа: разведения сыворотки, длительности инкубации, блокирующего реагента и т.д., что и составило одну из основных проблем, решение которой было найдено при выполнении представленной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Материалы Приборы: хроматографическая колонка 1,5х12 см «Bio-Rad» (США), перистальтический насос Pump P-1, ультразвуковой дезинтегратор Soniprep 150 Plus «MSE» (Великобритания), приборно-аппаратный комплекс для измерения размеров частиц Zetasizer NanoZS «Malvern» (Англия), центрифуга 5804 R «Eppendorf» (Германия), спектрофотометр Shimadzu UV-VIS UVmini 1240 (Япония), сканер Canoscan Lide 600F «Canon» (США) Реагенты: сефароза CL-6B «Pharmacia Fine Chemicals» (Швеция), нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм «Bio-Rad» (США), бычий сывороточный альбумин (БСА), IgG человека, G белок стрептококка, казеин, сухое обезжиренное молоко «Sigma» (США), азид натрия, глутаровый альдегид «AppliChem» (Германия), глицерин, хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, твин-20 «Panreac» (Испания), диализные мешки «Serva», (Германия), фиколл 400 «Fluka» (Германия), суспензия инактивированных клеток Bordetella pertussis, включающая клетки вакцинных штаммов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3, в концентрации 60 МОЕ, столбнячный и дифтерийный анатоксины «Микроген»

(Россия), стандартные образцы столбнячного (TE-3, 1-й Международный стандарт ВОЗ) и дифтерийного (10/262, 1-й Международный стандарт ВОЗ) антитоксинов «NIBSC» (Великобритания) Из ГДКП №5, г. Пермь были получены 155 образцов сывороток венозной крови детей в возрасте от 2 недель до 17 включительно лет. Дети были вакцинированы цельноклеточными отечественными вакцинами АКДС или БУБО согласно Национальному календарю прививок и не имели диагноза «коклюш», «дифтерия» или «столбняк» в анамнезе. Сыворотки крови аликвотировали и хранили при температуре -20°С.

Буферные растворы:

ЗФР – 0,15 М NaCl, забуференный 0,015 М Na-фосфатами с 0,1% азида натрия, рН 7,25;

ЗФРТ – ЗФР, содержащий 0,05% твина-20.

Все использованные в работе растворы приготовлены на деионизированной воде.

–  –  –

Количественное определение дифтерийного и столбнячного антитоксина, а также антител против коклюшного токсина проводили методом непрямого ИФА при помощи тест-наборов производства «Euroimmun» (Германия) согласно инструкции производителя.

Титр антител к цельным клеткам коклюшного микроба выявляли при помощи реакции агглютинации, согласно инструкции, приложенной к диагностическому набору производства «Эколаб» (Россия).

4.2. Оценка гомогенности белковых препаратов, использовавшихся в работе

Степень гомогенности препаратов G белка стрептококка, дифтерийного и столбнячного анатоксинов проводили при помощи электрофореза в 10%-ном ПААГ по методике, предложенной Laemmli [89]. Исследуемые препараты наносили на гель в концентрации 1 мг/мл, либо в концентрации, обозначенной отдельно.

4.3. Синтез углеродного диагностикума Конъюгат углеродных наночастиц с G белком стрептококка был синтезирован по двустадийной технологии, подробно рассмотренной в работе [21].

Далее приведено краткое ее описание, заимствованное из статьи [26].

Этап 1. Один грамм аморфного углерода суспендировали в 19 мл 2% БСА в ЗФР в течение суток при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре (КТ).

Концентрация углерода в пересчёте на сухой вес составила 5% (здесь и далее указаны массовые доли углеродных частиц).

Полученную суспензию гидрофилизированных частиц подвергали ультразвуковой дезинтеграции при частоте 22 кГц (диаметр зонда 6 мм) в ячейке с охлаждающей рубашкой без перерывов. Общее время озвучивания составило один час.

Температуру суспензии в ячейке контролировали при помощи термометра, в течение проведения ультразвуковой обработки она находилась в диапазоне 20С. С целью удаления оставшихся крупных частиц озвученную суспензию центрифугировали 5 мин при 1600g при КТ. Из полученного супернатанта отбирали пробу и исследовали ее при помощи анализатора частиц.

Этап 2. Порцию супернатанта объемом 4,5 мл инкубировали в течение 40 минут при КТ с равным объемом 25%-ного раствора глутарового альдегида при мягком перемешивании на ротационном встряхивателе (25 об/мин).

По окончании инкубации смесь центрифугировали 5 минут при 1600g при КТ. Далее проводили хроматографию супернатанта на колонке с Sepharose CL-6B (объем геля 160 мл, колонка XK 16/40, элюирующий буфер: ЗФР, скорость элюции 80 мл/час) для удаления не связавшегося БСА и глутарового альдегида. Вышедшие в холостом объёме фракции, содержащие углеродные частицы объединяли и концентрировали до объема 4,5 мл. Для этого их переносили в диализный мешок диаметром 16 мм.

Мешок помещали в пластиковую ванночку, заполненную фиколлом 400, и присыпали сверху дополнительным слоем фиколла. Ванночку ставили на качалку на 3-4 часа. Полученную концентрированную суспензию активированных глутаральдегидом углеродных частиц центрифугировали 5 минут при 1600g при КТ, супернатант использовали на третьем этапе синтеза.

3 этап.

Активированную глутаральдегидом концентрированную суспензию объемом 4,5 мл инкубировали с 0,5 мл G белка с концентрацией 10 мг/мл в течение ночи на ротационном встряхивателе (25 об/мин) при 4°С, после чего центрифугировали 5 мин при 1600g при КТ. Не связавшийся G белок удаляли гельхроматографией на колонке с Sepharose CL-6B (объем геля 100 мл, колонка XK 16/40, элюирующий буфер: ЗФР, скорость элюции 80 мл/час). Вышедшие в холостом объёме фракции подвергали спектрофотометрическому исследованию.

Для этого аликвоты объемом по 100 мкл помещали в лунки круглодонного 96луночного планшета и регистрировали оптическую плотность при помощи планшетного ридера при 450 нм. Фракции с оптической плотностью выше 0,6 объединяли, добавляли БСА и глицерин до конечной концентрации 1% и 20% соответственно. Синтезированный конъюгат хранили при 4°С.

Структурные свойства конъюгата оценивали методами измерения обратного динамического светорассеяния и спектрофотометрии. Функциональную активность диагностикума определяли по способности специфически связывать человеческий IgG, сорбированный на твердую фазу. Массовую долю углеродных частиц в суспензиях вычисляли, зная, что 0,03%-ная суспензия углеродных частиц имеет оптическую плотность 14 оптических единиц при длине волны 450 нм [21].

Расчетным рабочим титром диагностикума считали разведение, при котором концентрация углеродных наночастиц в конечном растворе составляет 0,03%.

4.4.Измерение обратного динамического светорассеяния Для оценки функционализированных углеродных частиц использовали метод измерения обратного динамического рассеяния света (ИОДРС) раствора конъюгата углерод-G белок под углом 173° при помощи программно-аппаратного комплекса Malvern ZetaSizer NanoZS. Суспензию углеродных частиц разводили в ЗФР до концентрации 0,01%. Показатель количества измерений в секунду («Count rate») находился в диапазоне 300-400 тыс.

4.5. Измерение интенсивности диагностического сигнала в твердофазном анализе Для количественной оценки результатов анализа производили оценку интенсивности аналитического сигнала на поверхности твердой фазы. Оцифровку результатов производили при помощи сканера Canoscan LiDE 600f и программного обеспечения Canoscan Toolbox 5.0, размещенного на сайте производителя сканера.

Уровень аналитического сигнала измеряли при помощи программы ImageJ.

Программа предоставляет возможность измерить интенсивность окрашивания участка цифрового изображения по шкале от 0 до 255, где 0 – черный цвет, 255 – белый, а промежуточные значения соответствуют оттенкам серого цвета.

Интенсивность сигнала в зоне специфического связывания высчитывали, вычитая интенсивность окрашивания дота из интенсивности фонового сигнала. Фоновый сигнал определяли, как среднее арифметическое измерений интенсивности окрашивания поверхности нитроцеллюлозного диска или стрипа в области, свободной от анти-лиганда (рисунок 3).

Рисунок 3 – Измерение оптической плотности точек. Сплошными линиями обведены зоны измерения интенсивности фонового сигнала, штриховыми – аналитического сигнала

4.6. Статистическая обработка данных Первичную группировку и обработку данных (вычисления оптических плотностей, расчеты средних, показателей разброса выборки) проводили в табличном редакторе Microsoft Office Excel 2013.

Дальнейшую статистическую обработку данных (описательная статистика, сравнение групп) проводили в программе Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA), ROC-анализ осуществляли при помощи программы GraphPad Prism (GraphPad Software, США), каппа-статистику, оценку чувствительности и специфичности дот-иммуноанализа, подбор уравнения логистической кривой для калибровок производили при помощи онлайн-сервисов и http://graphpad.com/quickcalcs/kappa1.cfm, http://vassarstats.net/clin1.html http://www.elisaanalysis.com соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Концепция и формат иммуноанализа, твердофазный реагент, диагностические пороги теста Идея работы заключалась в создании теста, применение которого будет одинаково удобно как в самых передовых, так и наименее «богатых» лабораториях.

Поэтому первоначально мы планировали сконструировать неиструментальную систему диагностики с визуальным определением титра антител к коклюшу, дифтерии и столбняку, не требующую использования какой-либо дорогостоящей считывающей аппаратуры. Наиболее подходящим был признан дотиммуноаналитический формат тестирования. Дот-иммуноанализ с применением окрашенных частиц или фермента в качестве метки широко используется в серодиагностике. Твердую фазу мы планировали реализовать в виде гребенки, включающую в себя ряд тест-полосок, закрепленных на общей основе. На каждой тест-полоске должны были быть нанесены 4 анти-лиганда (антигены коклюшного, дифтерийного и столбнячного микробов, а также положительный контроль), каждая тест-полоска в ходе постановки анализа должна была погружаться в лунки диагностического планшета, содержащие кратные разведения исследуемой сыворотки. Результат анализа оценивался бы как последняя видимая точка в ряду серийных разведений сыворотки независимо для каждого из антигенов. Стоит сразу оговориться, что подобный подход не является инновационным. Тестсистемы подобного формата производят компании Alere (www.alere.co.il), Biogal (www.biogal.co.il), аналогичные по своему принципу серологические тесты были описаны в работе Полтавченко [19]. На начальном этапе работы нами была продемонстрирована принципиальная возможность создания подобной дотиммуноаналитической системы, в модельной тест-системе мы проводили определение титра антител к коклюшу на дисках из нитроцеллюлозной мембраны [40]. В дальнейшем была сконструирована треханалитная дот-аналитическая тестсистема, предназначенная для выявления титров антител к коклюшу, дифтерии и столбняку в одной постановке [38] и выполненная в форме гребенки. Разработка была представлена на Всероссийской конференции иммунологов Урала в г.

Екатеринбурге осенью 2014 г. Нами были получены многочисленные отзывы от коллег, которые указывали на излишнюю громоздкость тест-системы, связанную с необходимостью титрования исследуемой сыворотки. В результате, нами было принято решение усовершенствовать диагностическую систему таким образом, чтобы для анализа требовалось единственное разведение сыворотки крови.

Помимо этого, мы решили отказаться от формата гребенок и перейти к более традиционному для дот-иммуноанализа выполнению тест-системы в виде полосок (стрипов). Связано это прежде всего с упрощением процедуры промывок и возможностью увеличить количество образцов, доступное для одновременной постановки.

Для работы с тест-полосками были смоделированы и изготовлены при помощи 3D-принтера пластиковые планшеты из акрилонитрилбутадиенстирола (ABS). Габариты планшета, форма и размеры лунок были спроектированы таким образом, чтоб адаптировать его для работы с многоканальными дозаторами, минимизировать необходимый для анализа объем образца и диагностикума и осуществлять промывки достаточным объемом буферного раствора (рисунок 4).

Рисунок 4 – Планшет из ABS-пластика В повседневной работе мы использовали два вида планшетов, предназначенных для работы с длинными (25 мм, четыре области сорбции антилиганда) и короткими (15 мм, две области сорбции анти-лиганда) стрипами.

Последние использовали в ходе предварительных испытаний, а также при подборе блокатора, концентрации анти-лигандов, диагностиума и т.д. для экономии реагентов. Длинные стрипы использовали на конечных стадиях разработки тестсистемы, а также при оценке ее аналитических характеристик. Фактически такими и являются тест-полоски в их законченном виде. Несомненно, изготовление планшетов при помощи 3D-печати экономически оправдано лишь на этапе разработки и лабораторной апробации тест-системы.

Твердофазный реагент представляет собой подложку с сорбированным на нее анти-лигандом, подготовленную для постановки анализа. Выбор материала твердой фазы в значительной степени влияет на способ и условия нанесения антилиганда, подбор блокирующего реагента, соотношение сигнал/фон, стабильность твердой фазы при хранении и другие параметры тест-системы. В нашей работе мы использовали для сорбции анти-лигандов традиционный материал:

нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 450 нм (рисунок 5). Данная мембрана широко применяется в иммуноанализе вследствие своей высокой сорбционной емкости в отношении белка (80-100 мкг/см2), гидрофильности, высокой величине соотношения сигнал/фон [110]. Размер пор позволяет использовать в качестве меток окрашенные наночастицы. Недостатком нитроцеллюлозы является ее хрупкость, которая утрачивается при смачивании. Это свойство затрудняет приготовление твердофазного реагента, но не усложняет собственно процедуру анализа, поскольку смоченную мембрану повредить достаточно затруднительно.

Объем наносимого анти-лиганда составлял 3,5 мкл. Данный объем обеспечивал достаточно крупный размер точки для ее последующей цифровой обработки и в то же время не препятствовал нанесению нескольких точек на один стрип. Анти-лиганды на нитроцеллюлозную мембрану сорбировали при помощи пассивной сорбции, нековалентно. Буфером для сорбции служил ЗФР. После нанесения анти-лигандов тест-полоску высушивали при комнатной температуре в течение 2-х часов и лишь затем приступали к процедуре блокирования.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 
Похожие работы:

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Вафула Арнольд Мамати РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАПАЙИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЗДОРОВОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА И ЭКСТРАКТОВ С БИОПЕСТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЕЕ ОТ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ Специальности: 06.01.07 – защита растений 06.01.01 – общее земледелие и растениеводство Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«БОЛОТОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ И МИГРАЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЭКОСИСТЕМАХ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность: 03.02.08. Экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук,...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Радугина Елена Александровна РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ 03.03.05 – биология развития, эмбриология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение Обзор литературы 1 Регенерация...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Шапурко Валентина Николаевна РЕСУРСЫ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ КАЧЕСТВО ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.