WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

На правах рукописи

Радугина Елена Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА

ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ

ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ

03.03.05 – биология развития, эмбриология



Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Э.Н. Григорян Москва – 2015 Оглавление Введение

Обзор литературы

1 Регенерация у позвоночных животных

1.1 Определение и виды регенерации

1.2 Модели исследования регенерации и перспективы регенеративной биологии и медицины............... 12

1.3 Преимущества хвостатых амфибий как объекта для исследования механизмов регенерации; модель регенерации хвоста

2 Ход регенерации хвоста тритона

3 Роль раневого эпидермиса в регенерации

4 Роль бластемы в регенерации

4.1 Клеточные источники формирования бластемы и их потенции

4.2 Регуляция образования, пролиферации и дифференцировки бластемы

5 Регенерация мышц

5.1 Тканевая регенерация и резервные клеточные популяции

5.2 Эпиморфная регенерация и дедифференцировка мышечных волокон

6 Регенерация нервной системы

6.1 Потенции эпендимных клеток

6.2 Регуляторная роль эпендимных клеток

7 Механизмы регуляции морфогенеза хвоста

7.1 Передне-задняя полярность

7.2 Дорсовентральная полярность

7.3 Эпигенетические регуляторы регенерации и морфогенеза

8. Белки теплового шока как факторы, участвующие в процессах развития и регенерации

8.1 Белки теплового шока в развитии амфибий

8.2 Белки теплового шока в регенерации

9 Амфибии как модельный объект гравитационной биологии развития

9.1 Гравитационная биология развития Xenopus leavis

9.2 Гравитационная биология развития Pleurodeles waltl

9.3 Регенерация Pleurodeles waltl в условиях космического полета и измененной гравитационной нагрузки

9.4 Примеры молекулярных эффектов измененной гравитационной нагрузки

Материалы и методы

1 Содержание животных и операции

1.1 Общие принципы

1.2 Содержание животных на субстрате

1.3 Тепловой шок

2 Морфометрическое изучение регенератов хвоста

3 Эксперименты по исследованию обратимости морфогенетического эффекта

4 Морфологическое изучение регенератов хвоста

5 Изучение пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста

6 Изучение апоптоза в регенератах хвоста

7 Ингибирование сигнального пути Shh

7.1 Введение фармакологических агентов в среду

7.2 Внутрибрюшинное введение фармакологических агентов

8 Ингибирование белков теплового шока

9 Изучение экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).... 61

9.1 Подготовка образцов кДНК

9.2 Полуколичественная ПЦР

9.3 Количественная ПЦР в реальном времени

10 Иммуногистохимическое определение экспрессии белков HSP70 и HSP90 в тканях регенерирующего хвоста

Результаты и их обсуждение

1 Морфометрические исследования регенератов хвоста в двух группах

1.1 Воспроизведение эффекта измененного морфогенеза при содержании на субстрате

1.2 Изучение темпов регенерации при содержании в аквариуме и на субстрате

1.3 Проверка обратимости изменения формы регенерата при содержании на субстрате

2 Проявление эффекта загиба хвоста при регенерации с перегрузкой 2g

3 Изучение тканевых и клеточных аспектов измененного морфогенеза регенерирующего хвоста на субстрате

3.1 Морфологическое изучение регенератов хвоста в аквариуме и на субстрате

3.2 Изучение пролиферативной активности клеток регенерата

3.3 Изучение локализации апоптоза в регенерирующих тканях

4 Исследование роли сигнального пути Shh в изменении морфогенеза хвоста





5 Морфогенетический эффект теплового шока при регенерации хвоста

6 Ингибирование белков теплового шока

7 Изучение экспрессии генов теплового шока и локализации соответствующих белков в тканях............. 111

7.1 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦР

7.2 Изучение экспрессии генов теплового шока Hsp70 и Hsp90 методом ПЦР-РВ

7.3 Изучение локализации белков теплового шока HSP70 и HSP90

Заключение

Выводы

Список литературы

Введение Исследования в области регенерации – восстановления поврежденных или утраченных органов и тканей – были начаты во второй половине XVIII века и до сих пор не утратили актуальности. Напротив, стремительный рост технических возможностей в конце XX – начале XXI века обусловил подъем интереса к изучению как фундаментальных, так и прикладных аспектов проблемы. На основе все возрастающего понимания молекулярных механизмов регенерации и условий ее осуществления сформировалась целая отрасль научно-прикладных исследований – регенеративная медицина, успехи которой имеют важнейшее практическое значение. Выбранная для данного исследования модель – испанский тритон, представитель отряда Хвостатые амфибии – является одним из классических объектов исследований в области регенерации. Представители этого отряда обладают наивысшими среди позвоночных регенерационными возможностями. Они способны к восстановлению ампутированных конечности и хвоста, удаленных хрусталика, сетчатки глаза, частей сердца и печени, перерезанного спинного мозга, к заживлению кожных ран без образования рубцов.

Данный объект является единственным, дающим такой широкий спектр моделей регенерации, имеющим относительную таксономическую близость к млекопитающим и проявляющим наивысшие регенерационные потенции во взрослом состоянии. Кроме того, тритон прост в разведении и неприхотлив в содержании. В дополнение к исключительным возможностям изучения процессов регенерации in vivo, клетки и ткани данного организма весьма нетребовательны к условиям культивирования in vitro.

Многочисленные преимущества тритона испанского тритона в экспериментальной работе по изучению регенерации сделали его также объектом в исследованиях гравитационной биологии. Данная отрасль знания сочетает в себе возможности для решения как важных фундаментальных вопросов, таких как роль гравитационной нагрузки в развитии живых организмов, способы ее восприятия и механизмы опосредованного действия измененного гравитационного вектора, так и практических вопросов о физиологических эффектах факторов космического полета и измененной гравитационной нагрузки.

Данное исследование предпринято в связи с обнаружением интересного явления – зависимости формообразования при регенерации хвоста у тритонов вида Pleurodeles waltl (Michahelles, 1830) от действующих на регенерат внешних факторов – разных уровней гравитационной нагрузки. В ходе двух полетных экспериментов проведенных лабораторией проблем регенерации ИБР РАН – Фотон М2 и Фотон М3 – было обнаружено, что низкие «дозы» гравитации (в аквариальных контролях и в невесомости на борту биоспутника) не приводят к изменениям регулярной ланцетовидной формы, тогда как содержание животных на субстрате в лаборатории при 1g всякий раз индуцировало загиб регенерирующего хвоста книзу, завершающегося развитием крючкообразного регенерата.

Это явление – редкий пример морфогенетического эффекта внешних факторов во взрослом организме. Кроме этого, в данном случае действие внешних факторов направлено на процессы развития, как известно, достаточно универсально и жестко программируемые. Модель позволяет обнаружить также не только внутриклеточные механизмы восприятия и реагирования на внешние факторы, но и механизмы, осуществляющиеся на уровне межклеточных и межтканевых взаимодействий.

На уровне современных знаний понятно, что органогенезом и морфогенезом в развитии и регенерации управляют системы молекулярно-генетических взаимодействий.

При этом остается невыясненным, какую роль эти события играют в образовании уникальной формы того или иного органа. Дело в том, что если при работе с изолированными клетками возможна регистрация влияния физических сил на цитоскелет и/или внеклеточный матрикс, то при рассмотрении развития органа следует учитывать генерализованные силы, действующие на большие популяции клеток различных типов.

Важно также знать, как эти силы преобразуются во внутриклеточные биохимические, эпигенетические изменения и характер экспрессии генов, которые, в свою очередь, определяют морфогенетический контроль. Получение этих фундаментальных знаний нуждается в доступных, хорошо воспроизводимых в лаборатории моделях. Эти модели должны не только позволять манипулировать с формой развивающегося органа, но и давать возможность исследовать сопутствующие изменения, происходящие на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях.

Отмечу также, что в настоящее время впервые поставлен вопрос о характере взаимосвязи физических факторов (гравитации) и молекулярного контроля развития. До сих пор не вполне понятно, какой информационный сигнал создает гравитация, как он преобразуется клетками, и как отвечают на него клеточные популяции формирующегося органа во взаимодействии друг с другом. Ответ предусматривает объединение знаний о механических силах, молекулярной биохимии, генетической экспрессии и разметки ткани, которые играют центральную роль в морфогенезе и поддержании формы ткани в течение всей жизни организма. И здесь модель, взятая за основу в наших исследованиях, открывает хорошие перспективы для изучения.

Таким образом, целью нашего исследования было всестороннее изучение явления изменения морфогенеза регенерирующего хвоста под действием внешних факторов:

уточнение природы воздействия, выявление клеточных процессов, за счет которых хвост приобретает иное, ассиметричное строение, а также поиск сигнальных путей и регуляторных молекул, опосредующих изменения. В рамках данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Воспроизвести обнаруженный эффект в лабораторных условиях, проанализировав устойчивость его проявления, достоверность, динамику, обратимость и зависимость от хода регенерации в целом.

2) Уточнить предполагаемую гравитационную природу действующего фактора.

3) Провести полное морфологическое описание получаемых регенератов на разных стадиях, а также изучить клеточные процессы, протекающие в них: пролиферацию и апоптоз.

4) Проверить роль одного из главных морфогенетических механизмов регенерации хвоста – сигнального пути Shh – на развитие наблюдаемого эффекта.

5) Проанализировать другое системное воздействие – тепловой шок – на способность к индукции подобных морфогенетических изменений при регенерации хвоста у тритонов.

6) Провести фармакологическое ингибирование белков теплового шока в ходе регенерации хвоста тритона в нормальных условиях и в условиях, вызывающих изменение формы регенерата.

7) Исследовать динамику экспрессии генов теплового шока Hsp70, Hsp90 в ходе регенерации и локализацию в тканях соответствующих белков, как в нормальных условиях, так и в условиях содержания, вызывающих морфогенетический эффект.

Актуальность темы. Как было показано выше, данная работа находится на стыке двух актуальных областей науки – регенерации и гравитационной биологии. Поднятые в ней вопросы актуальны для обеих областей; в то же время предложенная модель позволяет выйти за их рамки и изучать универсальные механизмы устойчивости морфогенеза под действием внешних факторов.

Состояние исследований. Междисциплинарный характер области исследований, к которой относится данная работа, а также трудности, связанные с проведением экспериментов в области гравитационной биологии, обусловили малую ее разработанность. Наиболее последовательные и информативные работы, касающиеся регенерации различных тканей и органов у хвостатых амфибий в условиях космического полета, симулированной невесомости и искусственных перегрузок, были выполнены в лаборатории проблем регенерации ИБР РАН в сотрудничестве с несколькими российскими и зарубежными коллективами. Одним из последних достижений в этой серии работ стало обнаружение морфогенетического эффекта, изучению которого и посвящено данное исследование.

Научная новизна. В работе предлагается совершенно новая модель для исследований на стыке биологии развития и гравитационной биологии. Эффект внешних воздействий (изменения «дозы» гравитации, теплового шока) на регенерацию тканей хвоста не был описан ранее, как и процессы, участвующие в проявлении морфогенетических эффектов при воздействии на регенерирующий хвост – клеточная пролиферация, миграция и апоптоз. Кроме этого получены первые данные по выявлению молекулярных посредников развития эффекта. Уточнена роль сигнального пути Shh, исследована экспрессия генов теплового шока (Hsp70, и локализация Hsp90) соответствующих белков.

Несмотря на давнюю историю работ по регенерации хвоста у тритона, многие эксперименты, описанные в данной работе, были проведены впервые (оценка пролиферации в тканях регенерата, ингибирование сигнального пути Shh, регенерация в присутствии теплового шока, оценка экспрессии генов Hsp70, Hsp90, иммунохимическое исследование белков HSP70, HSP90). Их результаты являются новыми для исследований регенерации в стандартных лабораторных условиях.

Теоретическая и практическая значимость. Для работы с большинством моделей гравитационной биологии даже в наземных условиях необходимо применение дорогостоящего труднодоступного оборудования: клиностатов, аэродинамических труб, биоцентрифуг. Предложенная в работе модель благодаря свойствам модельного объекта позволяет сравнивать два режима с разной гравитационной нагрузкой в предельно простых условиях, без применения каких-либо специальных приборов. В то же время, ее возможности очень широки. Модели, на которых изучаются механизмы действия физических факторов на морфогенез биологических систем (в основном клеточных) не дают возможности воспроизвести полноценный морфогенетический процесс, затрагивающий несколько тканей в их взаимодействии. Данная модель свободна от этого ограничения и позволяет изучать клеточные, межклеточные, межтканевые аспекты воздействия внешних факторов, а также учитывать системные физиологические изменения в организме. Использование данной модели в сочетании с современными подходами и методами позволяет работать над решением важных вопросов, в т.ч.

выходящих за рамки только проблем регенерации и гравитационной биологии. Каковы механизмы устойчивости морфогенеза под действием внешних факторов? Каким образом в биологической системе детектируется действие системного внешнего фактора, такого как изменение гравитационной нагрузки? Как это системное действие вызывает специфические, локальные изменения в тканях? Насколько универсальны эти механизмы и являются ли они общими для разных типов воздействий? Результаты, полученные в данной работе, являются необходимой базой для дальнейшего плодотворного использования преимуществ описанной модели в решении этих и других вопросов. И, наконец, данная модель открывает очень широкие возможности для проведения все расширяющихся исследований, доказывающих роль эпигенетических факторов в нормальном развитии органов и тканей и при патологии.

Проведенные исследования имеют и практическую ценность, поскольку в настоящее время на разных животных моделях показано, что механические силы способны вызывать нарушения в развитии и регенерации скелетно-мышечной, сердечнососудистой, иммунной и других систем организма (обзоры Cubano, Maldonado, 2006;

Nowlan et al., 2010; Jacot et al., 2010; Mammoto et al., 2013). Понимание разных уровней развития патологии при действии измененных «доз» гравитации и экстремальных температур необходимо для поиска путей предотвращения или компенсации морфогенетических аномалий.

Апробация результатов. Результаты данной работы были опубликованы в двух статьях в рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК:

1) Радугина Е.А., Григорян Э.Н. Морфогенетические изменения при регенерации хвоста у тритонов в условиях различной гравитационной нагрузки // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. № 5. С. 478-485.

2) Григорян Э.Н., Маркитантова Ю.В., Авдонин П.П., Радугина Е.А. Исследование регенерации у амфибий в эпоху молекулярно-генетических подходов и методов // Генетика. 2013. Т. 49. № 1. С. 55-72.

Помимо этого, результаты были неоднократно доложены в форме устных и стендовых докладов на ряде российских и международных конференций:

1) Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва; 2010, 2011, 2012, 2013; доклад трижды занимал призовые места).

2) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва; 2011, 2014, 2015; в 2014 году доклад был удостоен первого места в подсекции «Биология развития»).

3) Всероссийская конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва; 2011, 2012, 2015).

4) Всероссийская научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» с международным участием (Москва; 2014).

5) Международная космическая научная ассамблея COSPAR (Бремен, 2010;

Майсор, 2012; Москва, 2014).

6) Международная конференция 5th EMBO Conference Series on The Molecular & Cellular Basis of Regeneration & Tissue Repair (Сан Фели де Гуиксол, 2014).

7) Международная конференция 24 th Annual meeting of the European Tissue Repair Society (Эдинбург, 2014).

8) Международная научная школа EMBO Practical Course on Multi-level Modelling of Morphogenesis (Норидж, 2015).

Обзор литературы 1 Регенерация у позвоночных животных

1.1 Определение и виды регенерации Регенерацией (от лат. «regeneratio» – возобновление, восстановление) называют совокупность процессов, протекающих на разных уровнях организации организма и направленных на восстановление поврежденных или утраченных тканей и органов.

Следует различать физиологическую регенерацию, обеспечивающую восстановление «изнашивающихся» тканей в ходе нормальной жизнедеятельности организма (например, эпителия кожи или кишечника) и репаративную регенерацию, при которой восстанавливаются органы и ткани, утраченные в результате травмы или ампутации.

Репаративная регенерация свойственна многим организмам, но осуществляется в разной мере: от полной неспособности к регенерации утраченных частей (коловратки), до способности к регенерации целого организма из отдельных клеток (губки). Выделяют множество механизмов репаративной регенерации. У позвоночных животных были выявлены:

1) регенерация путем индукции – восстановление мезодермальных тканей при эктопическом введении специфических индукторов;

2) регенерационная гипертрофия – увеличение массы органа (печени, селезенки) после ампутации без восстановления исходной формы;

3) компенсаторная гипертрофия – увеличение массы одного из парных органов (почки, яичника) при удалении другого;

4) вольфовская регенерация – регенерация органа, проходящая принципиально иным путём и из иных тканей, нежели нормальное развитие (регенерация хрусталика глаза у хвостатых амфибий);

5) неэпиморфное восстановление отдельных мезодермальных тканей – тканевая регенерация;

6) моргановская эпиморфная регенерация – регенерация путем образования на ампутационной поверхности массы дедифференцированных клеток (бластемы), ее пролиферации, дифференцировки и морфогенеза с образованием копии утраченной части (Карлсон, 1986).

Загрузка...

В то время как регенерационная гипертрофия (например, печени) и тканевая регенерация (мышцы) являются обычными для высших позвоночных, включая человека, способность к эпиморфной регенерации у высших позвоночных утрачена. Так, взрослые хвостатые амфибии способны полностью восстановить конечность, а у млекопитающих регенерирует лишь дистальная фаланга пальца, причем только в эмбриональном или неонатальном периоде развития (Han et al., 2005).

1.2 Модели исследования регенерации и перспективы регенеративной биологии и медицины В настоящее время регенерация у позвоночных животных интенсивно изучается на множестве моделей. К ним относятся многочисленные животные модели in vivo:

регенерация конечности (плавник Danio rerio, конечность взрослых Urodela, конечность головастиков Anura, почка конечности птиц, дистальная фаланга пальца мыши), модель регенерации глаза (сетчатка рыб, хрусталик и сетчатка Urodela, сетчатка птиц), и, наконец, две модели регенерации хвоста (хвост головастиков Anura и взрослых Urodela). Кроме того, получило широкое применение культивирование органов, отдельных тканей, в том числе бластем, и клеток (Карлсон, 1986; Dinsmore, 1991; Carlson, 2007; Han et al.., 2005).

Последние достижения в биологии, в особенности в области молекулярной биологии и биологии стволовых клеток, привели к возрождению активного интереса к регенерации. Наиболее широко обсуждаемыми при этом являются процессы де- и трансдифференцировки клеток, т.е. явления, составляющие основу регенерации путем формирования бластемы. Открытие соматических стволовых клеток привело к осознанию существования латентного регенеративного потенциала многих тканей. Выявлена и активно изучается для получения необходимых доказательств возможность зрелых клеток трансдифференцироваться в клеточные типы, отличные от исходного. Здесь в качестве примера можно привести клетки Мюллера сетчатки позвоночных, способные трансдифференцироваться не только в нейроны, но и в клетки хрусталика (обзор Tanaka, 2003).

Наконец, доказана способность ядра зрелой дифференцированной клетки возвращаться к дедифференцированному состоянию, и разработан протокол получения таких, так называемых, iPS cells – индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Tanaka, 2003). Все эти достижения привели не только к сближению биологии регенерации и биологии стволовых клеток, но и открыли новые подходы к проблеме регенерации у высших позвоночных. Возможность анализа иммунологических, генетических и эпигенетических механизмов, контролирующих регенерацию, и экспериментального вмешательства в них существенно расширили перспективы регенеративной медицины.

1.3 Преимущества хвостатых амфибий как объекта для исследования механизмов регенерации; модель регенерации хвоста Хвостатые амфибии (отряд Urodela) являются уникальной группой животных с точки зрения исследования регенерации. Представители этого отряда – Pleurodeles waltl, Ambystoma mexicanum, Notophthalmus viridescens, Cynops pyrrhogaster – способны регенерировать самые разные структуры – конечность, хвост, хрусталик и сетчатку глаза, участки кишечника, печени, сердца и кожи. Испанский тритон Pleurodeles waltl демонстрирует все перечисленные возможности, кроме того, все эти структуры регенерируют у взрослых, прошедших метаморфоз, половозрелых животных. Другими словами, регенерация у испанского тритона, безусловно, является самостоятельным феноменом, и не осуществляется за счет механизмов эмбриональной регуляции.

Преимущества испанского тритона как модельного объекта многочисленны. Эти животные в естественных условиях могут не выходить из водоема, и в неволе содержатся в простых аквариумах без террариумного компонента; требования к освещению, чистоте и температуре воды также минимальны. Они достаточно просты в разведении; самки способны запасать сперму после спаривания на длительный срок, что позволяет проводить оплодотворение, например, в условиях космического полета. Эмбриональное развитие медленное, что удобно во многих экспериментах, при этом половозрелости испанский тритон достигает существенно раньше, чем многие другие представители отряда (Васецкий, 1975).

В экспериментальном манипулировании они также весьма просты: не требуют стерильности при манипуляциях, особых условий при восстановлении после операций. Как и в случае других низших позвоночных, действующие вещества могут быть доставлены в организм не только путем внутрибрюшинных инъекций, но и через кожу посредством простого разведения в среде. Они не требуют специальной маркировки за счет индивидуального узора меланофоров. Что немаловажно, ткани хвостатых амфибий состоят из крупных клеток, что облегчает гистологическое, иммуногистохимическое и электрофизиологическое исследование тканей. Сами клетки и целые фрагменты органов (например, глаза) легко поддаются культивированию in vitro в средах простого состава без необходимости частой смены среды.

Морфология разных регенерирующих структур Urodela детально описана, вследствие давнего интереса к этому явлению. «Первооткрывателем» регенерации хвостатых амфибий считается Лазаро Спалланцани (Lazzaro Spallanzani, 1729-1799 г.г.), описавший в 1765 году регенерацию конечности и хвоста саламандры. Шарль Бонне (Charles Bonnet) расширил знание о регенерации амфибий, описав регенерацию хрусталика саламандры (цит. по Dinsmore, 1991). С тех пор вышло огромное количество работ, описавших детали регенерации Urodela гистологическими, электронномикроскопическими, иммунохимическими методами; накоплен большой массив данных по разным видам травмирующих воздействий (ампутации, рассечению, денервации, эксплантации ткани), способам культивирования, влиянию на регенерацию различных гормонов, морфогенов, трофических факторов (Карлсон, 1986; Carlson, 2007;

Бабаева, 2009). К настоящему моменту найдены многие гены, участвующие в регуляции регенерации, в том числе гомологи генов, известных для других моделей (например, Xenopus laevis). Показано, что в целом, молекулярный механизм при дифференцировке индивидуальных тканей в регенерирующем хвосте сходен с таковым в развитии и задействует те же гены и сигнальные пути. Есть, однако, и отличия, связанные с тем, что регенераты формируются в окружении уже дифференцированных тканей.

С определенного времени хвостатых амфибий стали использовать в качестве очень перспективного и удобного объекта космической биологии. На тритонах изучается влияние факторов космического полета (ФКП) и измененной гравитационной нагрузки на процессы оплодотворения, эмбрионального развития, на состояние тканей и органов взрослого животного, а также на ход регенерации различных органов и тканей. Открытия в этой области могут не только иметь важнейшее практическое применение для обеспечения безопасности здоровья человека в условиях космического полета и орбитальных работ, но и пополнить фундаментальные знания о механизмах контроля регенерации со стороны эпигенетических факторов.

Регенерация хвоста у Urodela заслуживает особого внимания, так как в ходе нее регенерирует и полностью восстанавливает функциональную активность спинной мозг взрослой особи. Исследования в области регенерации хвоста расширяют знания о дифференцировке нейронов и глии, нейральных и глиальных предшественниках в ЦНС взрослого животного, меры пластичности их дифференцировки, и, наконец, механизмах, контролирующих эти процессы. Эти знания, в свою очередь, имеют большую практическую значимость, особенно в регенерационной медицине для поиска лечения тяжелых травм спинного мозга. Таким образом, регенерация хвоста у Urodelа является незаменимой моделью для изучения клеточных и молекулярных механизмов регенерации и роли эпигенетических факторов в этом процессе.

2 Ход регенерации хвоста тритона При ампутации хвоста у взрослых особей отряда Хвостатые амфибии инициируется процесс эпиморфной регенерации, в результате которой эпидермальные структуры, осевой скелет, центральная и периферическая нервная система и скелетные мышцы полностью восстанавливаются, идеально воспроизводя утраченную часть. Длина регенерата прямо пропорциональна длине ампутированного участка, а количество миомеров и позвонков в регенерате – их количеству в ампутированной части (Iten, Bryant, 1976b).

Процесс регенерации хвоста можно, основываясь на внешних признаках (рис. 1) и гистологическом строении регенерата (рис. 2), разделить на пять отчетливых стадий (Iten, Bryant, 1976a). Ниже приводится краткая характеристика этих стадий с указанием сроков их протекания в днях п/оп (после операции), наблюдавшихся для N. viridescens в указанной работе:

1) Стадия I (1–6 дней п/оп): заживление раны. Образование и пролиферация раневого эпидермиса; распад поврежденных миомеров культи; замыкание эпендимного эпителия в терминальный пузырек.

2) Стадия II (5–11 дней п/оп): формирование бластемы. Дедифференцировка мышц в культе; аккумуляция под эпидермисом мезенхимных клеток бластемы; врастание эпендимной трубки в бластему; иннервация регенерата аксонами культи.

3) Стадия III (10–15 дней п/оп): конусовидная бластема. Начало формирования мышечных волокон; образование под спинным мозгом хрящевого тяжа; начало иннервации мышц.

4) Стадия IV (13–22 дня п/оп): удлинение регенерата. Продолжение миогенеза в дистальной части регенерата; сегментация хрящевого тяжа, формирование сосудистой и нервной арок; регенерация периферической нервной системы.

5) Стадия V (30–60 дней п/оп): рост. Окончательная дифференцировка всех тканей и органов хвоста.

Рис. 1. Внешнее строение регенерата хвоста на пяти стадиях регенерации (по Iten, Bryant, 1976a). Верхний ряд – вид с дорсальной стороны. Нижний ряд – вид с латеральной стороны.

Рис. 2. Гистологическое строение регенерата на стадиях I – III (по Iten, Bryant, 1976a).

Везде представлены фронтальные срезы. A, Б – стадия I; В, Г – стадия II; Д, Е – стадия III.

СМ – спинной мозг, ДМ – дегенерирующие мышцы, РЭ – раневой эпидермис, Х – хрящ, М – мышцы, КС – кровеносный сосуд, ТП – терминальный пузырек, Б – бластема. СТ – новообразующаяся соединительная ткань.

Проводя аналогию с процессами, происходящими при регенерации конечностей, Итен и Брайэнт (Iten, Bryant, 1976a) выделяют также три фазы регенерации по общей тенденции происходящих изменений:

1) Фаза заживления раны и дедифференцировки клеток – соответствует стадии I и началу стадии II.

2) Фаза аккумуляции и роста бластемы – соответствует стадии II.

3) Фаза дифференцировки и морфогенеза – соответствует стадиям III, IV и V.

Непосредственно за ампутацией следуют ранние события регенерации, имеющие место и при заживлении ран у млекопитающих. В течение первых 12 часов после ампутации происходит остановка кровотечения, сокращение мягких тканей культи, образование фибринового сгустка, миграция эпидермиса на ампутационную поверхность.

Далее наступают процессы, связанные с удалением поврежденных клеток, – возникновение отека, проникновение в культю фагоцитов и других клеток, участвующих в воспалительной реакции, гибель остеоцитов (Карлсон, 1986). Кроме этого, по новым данным (Tseng et al., 2007), полученным на модели регенерации хвоста головастика X.

laevis, между 12 и 24 часами после ампутации имеет место апоптоз значительной части клеток в эпидермисе, мезенхиме, и несколько позднее – в дистальной части осевых структур. Показано, что этот процесс является необходимым для начала активной пролиферации клеток: при специфическом ингибировании каспазы-3 в течение первых суток после ампутации уровень пролиферации клеток существенно снижается и регенерация останавливается. Введение ингибитора позднее 48 часов после ампутации не оказывает заметного эффекта на ход регенерации. Авторы предполагают существование некоей ингибирующей пролиферацию клеточной популяции, апоптоз клеток которой необходим для инициации интенсивного деления.

3 Роль раневого эпидермиса в регенерации Одним из отличий эпиморфной регенерации хвоста и конечности хвостатых амфибий от заживления ран у высших позвоночных является образование раневого эпидермиса (Карлсон, 1986; Gilbert, 2006).

Для успешной регенерации крайне важным является адекватное взаимодействие образующейся регенерационной бластемы с раневым эпидермисом. Экспериментальные условия, нарушающие такое воздействие (например, наложение кожной заплатки), приводят к отсутствию регенерации в системах, которым она свойственна (Tassava et al., 1986). Есть данные, что при этом имеют место понижение уровня пролиферации и обширная гибель дедифференцированных клеток (Nye et al., 2003). Косвенно роль раневого эпидермиса в регенерации подтверждает тот факт, что во время рефрактерного периода в развитии Xenopus laevis, когда регенерация конечности не идет, вместо раневого эпидермиса образуется обычный покровный (Beck et al., 2003).

Морфология процессов, связанных с формированием и развитием раневого эпидермиса, подробно описана (Iten, Bryant, 1976a). Сразу после ампутации эпидермис заканчивается на уровне разреза. В течение первых 24 часов клетки пограничного эпидермиса начинают мигрировать на плоскость ампутации, образуя прозрачный однослойный раневой эпидермис. Через несколько дней раневой эпидермис состоит из 3– 5 слоев клеток, а к концу стадии I его толщина достигает 5–9 слоев клеток. В течение первой стадии регенерации раневой эпидермис не образует базальной мембраны, его базальная поверхность выстилается тканевым эксудатом. К концу стадии в слое раневого эпидермиса обнаруживаются меланофоры.

Во время стадии II раневой эпидермис достигает в толщину 5–10 слоев клеток, при толщине эпидермиса культи не более 3–4 слоев. В толще эпидермиса встречаются мертвые клетки и обрывки тканей. На базальной поверхности формируются многочисленные отростки, вдающиеся в подлежащую область. Непосредственно под эпидермисом наблюдается отек тканей, большое количество эритроцитов, мертвых клеток и дебриса, причем более явно на вентральной стороне. Согласно Тассава (Tassava et al., 1986), эти отростки обеспечивают фагоцитарную активность клеток эпидермиса, которая, наряду с активностью макрофагов, чрезвычайно важна для удаления многочисленных поврежденных клеток.

Во время стадии III количество слоев клеток эпидермиса уменьшается до 4–6.

Базальная поверхность выравнивается, на периферии начинает образовываться базальная мембрана. Мертвые клетки и обрывки тканей более не обнаруживаются в пласте эпидермиса.

На протяжении стадии IV эпидермис постепенно истончается, выравниваясь по толщине с эпидермисом культи. Завершается образование базальной мембраны. В начале стадии IV в наиболее проксимальной зоне начинается формирование кожных желез, вдающихся в дермальный слой, после чего кожные железы развиваются по всей длине регенерата. Окончательная дифференцировка желез эпидермиса завершается во время стадии V (Iten, Bryant, 1976a). В наружных покровах амфибий присутствуют как минимум два типа желез: 1) постоянно функционирующие, многочисленные слизистые железы, выделяющие гомогенный секрет, 2) крупные и относительно редкие серозные (или ядовитые) железы, выделяющие гранулярный секрет. Железы обоих типов являются простыми ацинарными, погружены в соединительную ткань дермы, обладают секрецией по голокриновому типу и выделяют секрет через короткий прямой проток (Антон и др., 1993).

В формирование раневого эпидермиса важнейший вклад вносят клетки эпидермиса культи, мигрирующие на плоскость ампутации. Раневой эпидермис характеризуется высокой пролиферативной активностью, обуславливающей его утолщение в процессе регенерации. Кроме того, по данным Тассава (Tassava et al.,1986), дополнительным источником эпидермальных клеток являются клетки кожных желез.

4 Роль бластемы в регенерации Бластемой называют массу морфологически малодифференцированных клеток, образующихся путем дедифференцировки зрелых тканей в зоне повреждения при эпиморфной регенерации. В более широком смысле бластемой также можно называть массу клеток, образующихся путем пролиферации резервной клеточной популяции (например, сателлитных клеток мышц) при тканевой регенерации (Chernoff, Stocum, 1995).

Согласно Итен и Брайэнт (Iten, Bryant, 1976a), бластема начинает формироваться под раневым эпидермисом в начале стадии II. В течение этой стадии бластемные клетки активно пролиферируют, занимая большую часть регенерата, а в бластему активно прорастают кровеносные капилляры. К концу стадии II в центральной части бластемы образуется область большей клеточной плотности – имеет место прохрящевая конденсация клеток бластемы. В течение стадий III и IV идет активная дифференцировка клеток бластемы с формированием тканей регенерата. К концу стадии IV бластемные клетки остаются только в самой дистальной части регенерата, между эпидермисом и апикальным концом хрящевого тяжа.

4.1 Клеточные источники формирования бластемы и их потенции Несмотря на давний интерес к формированию и развитию бластемы, особенно возросший в связи с открытиями в области биологии стволовых клеток, даже сейчас нет единого мнения о сути происходящих при этом процессов. До сих пор неясно, какие ткани способны к дедифференцировке, какую роль в эпиморфной регенерации играют резервные клеточные популяции, насколько широкими потенциями обладают бластемные клетки, является ли бластема однородной по клеточным потенциям или представляет собой множество отдельных клеточных популяций. Общепризнано, что в образование бластемы вносят вклад мезенхимные клетки культи (особенно дерма, фибробласты, оболочки спинного мозга) и Шванновские клетки (Tanaka, 2003). Мышцы конечности обычно считают способными в дедифференцировке; был даже приблизительно оценен вклад дедифференцированных клеток мышечного происхождения в бластему (Echeverri et al., 2001). Однако предполагалось, что при регенерации хвоста мышцы культи не участвуют в образовании бластемы, а новые мышечные волокна дифференцируются из бластемных клеток соединительнотканного происхождения (Dinsmore, 1981; Thouveny et al., 1991). Тем не менее, в последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о ведущей роли резервных клеточных популяций в регенерации мышц амфибий (Morrison et al., 2006; Slack, 2006).

Изначально бластему представляли как однородную массу клеток, в значительной степени утративших следы дифференцировки и имеющих мультипотентный статус (Chernoff, Stocum, 1995). Эта гипотеза подкрепляется различными свидетельствами о трансдифференцировке клеток в процессе регенерации: радиальной глии в мышцы и хрящ (Echeverri, Tanaka, 2002), мышечных клеток в хондроциты, адипоциты, остеоциты (Lo et al., 1993; Odelberg et al., 2000). В последних работах появляются данные об участии и важной роли в процессе дедифференцировки клеток при регенерации тех же генов, что активизируются в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC), а именно, Sox2, Klf4, c-myc (Maki et al., 2009; Christen et al., 2010). Тем не менее, очевидно, что бластемные клетки никогда не достигают плюрипотентности и могут реализовать лишь часть возможностей iPS клеток.

Работы, в которых отслеживается судьба индивидуальных клеток, как правило, свидетельствуют о гетерогенности бластемы. На модели регенерации хвоста X. laevis было показано (Gargioli, Slack, 2004), что регенераты хорды и спинного мозга образуются из соответствующих тканей культи, а мышечные волокна – из сателлитных клеток, а не дедифференцированных мышц. По данным этой работы в формировании бластемы принимали участие мезенхима плавника, дерма и пролиферирующие потомки сателлитных клеток. В другом исследовании (Kragl et al., 2009) была прослежена судьба GFP-меченых клеток в бластеме регенерирующей конечности. В результате удалось выяснить, что трансдифференцировка между разными клеточными типами происходит крайне редко и что бластема с самого момента основания является гетерогенной, а ее клетки детерминированы. Показано также, что дедифференцированные мышечные клетки продолжают экспрессировать маркер миогенной дифференцировки, ген Myf-5 (Simon et al., 1995).

Важно отметить, что в настоящее время работы ведутся на разных видах хвостатых амфибий и на бесхвостых X. laevis – как на хвосте, так и на конечности. Не всегда данные, полученные на одной модели, применимы к другой. В целом, однако, на сегодня лучше обоснована точка зрения о том, что, хотя клетки бластемы в известной мере теряют морфологические и молекулярные признаки дифференцированных клеток, информация о принадлежности к той или иной клеточной линии все же сохраняется, а повторная дифференцировка обычно происходит в ее пределах (Whited, Tabin, 2010).

4.2 Регуляция образования, пролиферации и дифференцировки бластемы Для регенерации хвоста, как и для регенерации конечности, необходима базовая иннервация (Singer, 1952; Thornton, 1968). Так, краниальное смещение ампутированного спинного мозга и замещение его парапластом ведет к потере регенерационной способности (Donaldson, Wilson, 1975). Однако в этой модели протекают процессы дедифференцировки, и наблюдается слабая митотическая активность. Эти данные указывают на независимость ранних стадий регенерации от влияния нервной системы.

Новые данные также показывают, что присутствие нервов становится необходимым на четвертые сутки после ампутации; т.е. процессы формирования раневого эпидермиса, гистолизиса, инициации образования бластемы и дедифференциации клеток происходят без влияния нервов. Нервное обеспечение бластемы необходимо для активной пролиферации, роста и поддержания жизнеспособности клеток, а также, начиная с некоторого критического размера бластемы – для дальнейшей дифференцировки клеток и морфогенеза (Nye et al., 2003).

Развитие бластемы конечности регулируется со стороны генов Fgf8, Fgf10, Msx1.

Экспрессия этих генов нейрозависима и выявляется в клетках раневого эпидермиса и бластемы, начиная с семи суток после ампутации (Nye et al., 2003). Влияние иннервации может осуществляться через нейральные митогенные факторы. Например, фактор роста фибробластов FGF2 начинает синтезироваться в эпендимных клетках вскоре после ампутации; вскоре этот сигнальный белок обнаруживается в хондробластах, базальном слое эпидермиса и дифференцирующихся мышцах. Введение экзогенного FGF2 усиливает рост бластемы (Ferretti et al., 2001). Другим фактором, оказывающим митогенное и морфогенное действие на клетки бластемы, является сигнальный межклеточный фактор Shh, синтезирующийся в вентральной части эпендимной трубки и определяющий дорсовентральную организацию спинного мозга. Показано присутствие в клетках бластемы рецептора Shh, Patched1, и влияние Shh-сигналинга на пролиферацию клеток бластемы и хондрогенную дифференцировку вентральной части бластемы (Schnapp et al., 2005). В работе сигнальных путей FGF2 и Shh принимают участие гены Sox1 и Sox9, соответственно (Ferretti et al., 2001; Schnapp et al., 2005).

По современным данным, бластема не только зависит от нервного влияния, но и сама обладает нейротропным действием. Это подтверждается экспериментами по культивированию фрагментов спинного мозга и сокультивированию их с клетками бластемы. Обнаружено, что бластема усиливает рост аксонов, способствует увеличению их числа и жизнеспособности, причем проявление этого эффекта зависит от уровня пролиферации в бластеме. Выяснено также, что фактор, обуславливающий его, является диффундирующей молекулой белковой природы с низкой молекулярной массой. Этот фактор был назван мезенхимным ростовым (MDGF, mesenchyme-derived growth factor).

Предполагается, что мезенхима бластемы и растущие аксоны нейронов связаны положительной обратной связью и способны усиливать рост друг друга (рис. 3) (Bauduin et al., 2000).

В инициации регенерации значительную роль играет влияние со стороны раневого эпидермиса. Так, в опытах с удалением эпидермиса и наложением кожной заплатки регенерация не происходит. Предполагается, что раневой эпидермис обменивается с клетками бластемы ростовыми факторами, усиливая ее пролиферацию, обладает фагоцитарной активностью и служит источником позиционной информации (Tassava et al., 1986). Молекулярные механизмы, лежащие в основе взаимодействия раневого эпидермиса и бластемы, детально изучены на модели регенерации конечности, но не хвоста. Показано, что в эпителиально-мезенхимных взаимодействиях значительную роль играют представители семейства факторов роста фибробластов (FGF, fibroblast growth factor): FGF-8 и FGF-4 в раневом эпидермисе почки конечности и FGF-10 в мезодерме (Nye et al., 2003). Гены Fgf-8 и Fgf-10 регулируют экспрессию друг друга через посредство соответствующих белков. Экзогенное введение отдельно FGF-8 приводит только к ограниченному регенерационному ответу; введение же FGF-10 запускает систему взаимодействия между Fgf-8 и Fgf-10, что приводит к развитию более выраженного регенерационного ответа, вплоть до развития аутопода (рис. 3) (Han et al., 2005).

Рис. 3. Схема регуляторных взаимодействий между эпендимой, бластемой и эпидермисом.

В регенерате хвоста были изучены некоторые компоненты внеклеточного матрикса (ВКМ). Так наблюдали определенное пространственное и временное распределение коллагена XII в раневом эпидермисе, мезенхиме и эпендиме. Через 7 дней после ампутации коллаген XII обнаруживался в базальном слое раневого эпидермиса, эпендиме и мезенхиме. К 14 дням эпидермис и эпендима переставали синтезировать коллаген XII, однако в мезенхиме его синтез поддерживался на высоком уровне. Замечено также, что удаление спинного мозга приводило к значительному снижению уровня синтеза коллагена XII во всех тканях. Предполагается, что ген коллагена XII и другие гены, кодирующие белки ВКМ, при регенерации хвоста могут играть роль во взаимодействиях между эпендимой, бластемой и эпидермисом (Wei et al., 1996).

Присутствия раневого эпидермиса и наличия иннервации (фрагмента спинного мозга) оказывается достаточно для успешной пролиферации и дифференцировки даже при культивировании in vitro, что говорит о решающей роль тканевых взаимодействий в этой системе (Globus, Liversage, 1975). В то же время, пролиферация и дифференцировка бластемы находится под гормональным контролем. В экспериментах по культивированию бластем регенерирующего хвоста в среде с различными гормонами (пролактином, инсулином, тироксином и гидрокортизоном) и их сочетаниями выявлены два противоположных гормональных влияния, регулирующих ход регенерации. Так, пролактин и инсулин способствуют интенсивной пролиферации бластемы, однако угнетают ее дифференцировку, а тироксин, напротив, усиливает хондрогенез.

Оптимальное же сочетание процессов пролиферации и дифференцировки, максимально воспроизводящее ход регенерации in vivo, наблюдается при наличии в среде всех четырех гормонов в определенных концентрациях (Liversage et al., 1984).

5 Регенерация мышц Морфология регенерации мышц подробно описана (Iten, Bryant, 1976a). В течение первых дней после ампутации (стадия I) в самой дистальной части культи обнаруживаются признаки распада мышечных волокон – нарушается исчерченность поврежденных фибрилл, происходит саркоплазматическая дегенерация, присутствуют фрагменты мышечных волокон без ядер или с измененными ядрами. Характер распада мышечных волокон меняется в зависимости от уровня по дорсовентральной оси.

На стадии II в зонах распада мышечных волокон выявляются и начинают доминировать небольшие сегменты мышечных волокон, содержащие одноядерные клетки. Базальные мембраны дезорганизованных мышечных волокон остаются неповрежденными. Более интенсивно этот процесс идет на периферии культи. Со стадии III в культе наблюдается агрегация миобластов и формирование мышечных волокон.

Формирование новых мышечных волокон в проксимальной части регенерата происходит лишь в начале стадии IV. Некоторые волокна тянутся через плоскость ампутации. В работах Муфти (Mufti, 1969; 1973) сообщается о значительных различиях во временной и пространственной организации миогенеза в культе и регенерате; Итен и Брайэнт (Iten, Bryant, 1976a) скорее предполагают наличие градиента мышечной дифференцировки от культи к регенерату. К концу стадии IV миогенез распространяется на дистальную часть регенерата; исчерченные мышечные волокна организуются в миомеры, разграниченные миосептами из соединительной ткани. Начинает формироваться медиальная мускулатура, волокна которой прикрепляются к гемальным и нервным отросткам соответствующих позвонков. На стадии V миомеры с латеральными и медиальными мышечными волокнами формируются по всей длине регенерата.

Регенерация мышц может идти двумя принципиально разными способами.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 
Похожие работы:

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Цховребова Альбина Ирадионовна ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА РАЗВИТИЕ БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ СЕВЕРНЫХ СКЛОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО КАВКАЗА Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биологических наук профессор Калабеков Артур Лазаревич Владикавказ 2015 Содержание Ведение..3 Глава I. Обзор литературных данных. 1.1....»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«АСБАГАНОВ Сергей Валентинович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИНТРОДУКЦИИ РЯБИНЫ (SORBUS L.) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.01 – «Ботаника» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.Б. Горбунов Новосибирск 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 4 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 8 Ботаническая...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Хохлова Светлана Викторовна ИНДИВИДУАЛИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ 14.01.12-онкология ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Горбунова В.А Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Обзор литературы 1.1. Общая характеристика рака яичников 1.1.1. Молекулярно-биологические и...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.