WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

СЕВЕРО-КАВКАЗСКИЙ ЗОНАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА И ВИНОГРАДАРСТВА

(ФГБНУ СКЗНИИСиВ)

На правах рукописи

УШАКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ДНК-МАРКИРОВАНИЯ В



СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЯБЛОНИ

Специальность 06.01.05. – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.И. Супрун Краснодар – 2015

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение яблони как плодовой культуры, основные задачи и направления в современной селекции яблони

1.2. Парша яблони

1.3 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем.... 17

1.4 Молекулярно-генетические методы в изучении устойчивости яблони к парше

1.5 Изучение генетического разнообразия яблони

1.6 Молекулярно-генетический полиморфизм гена самонесовместимости в пределах вида Malus domestica

2 УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Условия проведения и материал исследований

2.2 Молекулярные маркеры, использованные в работе

2.3 Методы исследований

2.4 Статистическая обработка данных

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. 1 Апробация методов экстракции ДНК

3.2 Идентификация генов Vf и Vm у отечественных сортов и селекционных форм яблони

3.3 Совершенствование ДНК-маркерной идентификации гена Vf иммунитета яблони к парше

3.4 Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости в сортах яблони

3.5 Исследование полиморфизма микросателлитных локусов сортов яблони отечественной селекции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Применение ДНК-технологий в селекции и генетике сельскохозяйственных культур позволяет значительно расширить область научных исследований: от изучения генетического разнообразия и вопросов паспортизации сортов до защиты авторских прав селекционеров и продукции растениеводства от фальсификации, а также определение её качества и генетической чистоты.

Возможности ДНК-маркеров превосходят потенциал изоферментов и запасных белков. В связи с тем, что применение молекулярных маркеров не зависит от фенотипа растения, этапа вегетационного периода и их использование позволяет напрямую характеризовать генотип, они приобретают все большую ценность при оценке степени генетического разнообразия, а также в исследованиях, направленных на идентификацию генов, участвующих в детерминации хозяйственно-ценных признаков [Хавкин Э.Е., 1997]. Особенно актуально использование ДНК-маркеров при идентификации генов устойчивости к заболеваниям, т. к. это отменяет необходимость проведения фитопатологической оценки образцов.

Ввиду высокой вредоносности парши яблони, вызываемой грибным патогеном Venturia inaequalis (Cooke)G. Winter, актуально ускоренное создание сортов, иммунных к данному заболеванию. Решение этой задачи невозможно без глубоких знаний генетических основ устойчивости к парше. Особое значение здесь приобретает технология ДНК-маркирования, позволяющая проводить скрининг генетической плазмы яблони на наличие генов устойчивости на любом этапе селекционного процесса вне зависимости от фазы онтогенеза растений.

ДНК-маркеры могут быть использованы как для идентификации целевых генов, так и при изучении генетического разнообразия культурных растений. В этих целях могут быть эффективно использованы микросателлитные маркеры, что обусловлено их локусспецифичностью и значительной аллельной изменчивости [Хавкин Э.Е., 1997]. Чаще всего микросателлитные маркеры используют для дифференцировки растений внутри вида, идентификации сортов, составлении генетических карт и в маркерной селекции, а также в работах по изучению генетического разнообразия и паспортизации сортов культурных растений [Гостимский С.А., 1999].





Молекулярные ДНК-маркеры открывают большие перспективы для генетической паспортизации сортов яблони, детального картирования хромосом, изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне и идентификации генов хозяйственно-ценных признаков в селекционном материале.

Степень разработанности темы Вопросы по изучению эффективности селекционных программ создания устойчивых к парше сортов яблони, оценке уровня генетического полиморфизма генофонда яблони, а также определению S-генотипов различных сортов яблони с применением молекулярно-генетических методов ДНКмаркирования нашли свое отражение в трудах VinatzerB.A., HemmatM., PatocchiA., BroothaertsW., AfunianM.R., LiebhardR., HegedsA., Седова Е.Н., Супруна И.И., Ульяновской Е.А., Г.А. Седышевой, З.М. Серова, ТокмаковаС.В., Шамшин, И.Н., Савельева Н.И. и других. В данных работах показано, что применение в генетических исследованиях методов, основанных на ДНК-маркировании, значительно повышает эффективность оценки растительного материала по многим интересующим хозяйственно-ценным признакам. Тем не менее, в данных работах не проводилась оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции из коллекции генетических ресурсов СКЗНИИСиВ с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров наряду с молекулярно-генетической идентификацией аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони.

Цель и задачи исследования Цель исследований: разработка и совершенствованием методологических подходов использования молекулярно-генетических методов оценки и отбора исходного материала яблони в селекционном процессе и комплексное изучение генофонда яблони коллекции генетических ресурсов ФГБНУ СКЗНИИСиВ с применением ДНКмаркерного анализа.

Для выполнения этой цели решаются следующие задачи:

- изучить генетическое разнообразие сортов яблони коллекции генетических ресурсов ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием полиморфизма микросателлитных локусов ДНК в качестве маркерной системы;

-на основании данных анализа микросателлитных локусов ДНК составить молекулярно-генетические паспорта сортов яблони отечественной селекции с оценкой уровня общего генетического полиморфизма и степени их генетического родства;

- провести скрининг селекционного материала яблони, предоставляемого центром селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ с использованием ДНК-маркерного анализа для выявления образцов, несущих гены устойчивости к парше Vf и Vm;

- разработать ДНК-маркер для гена устойчивости яблони к парше Vf для получения ПЦР-продукта, специфичного для его доминантного аллеля, размером 100-150 пар нуклеотидов (п. н.);

- выполнить молекулярно-генетическую идентификацию аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости у отечественных сортов яблони с применением ДНК-маркерного анализа.

Научная новизна В настоящей работе впервые выполнена оценка генетического родства сортов яблони отечественной селекции с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров. На основании данных, полученных по результатам анализа полиморфизма микросателлитных локусов, составлены ДНК-паспорта изученных сортов яблони.

Идентифицированы гены устойчивости к парше Vf и Vm с применением ДНК-маркерных технологий в сортах и селекционных формах яблони ФГБНУ СКЗНИИСиВ и ВНИИСПК.

Разработан молекулярный маркер к гену Vf на основании данных о его нуклеотидной последовательности с целью повышения перспективности и эффективности возможного применения мультиплексной ПЦР для одновременной идентификации гена Vf с генами устойчивости яблони к мучнистой росе.

Впервые проведена молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2, S3, S7, S10 гена самонесовместимости в отечественных районированных и перспективных сортах яблони.

На основании данных об аллельных комбинациях гена самонесовместимости определены группы совместимых и не совместимых при опылении сортов.

Практическая значимость исследования Полученные с применением микросателлитного анализа данные о степени генетического родства сортов яблони отечественной селекции востребованы в селекционном процессе и предназначены для улучшения качества гибридизации с целью получения максимального спектра изменчивости в гибридном потомстве.

Показана перспективность использования ДНК-маркирования для идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm, а также аллелей гена самонесовместимости у сортов и форм яблони отечественной и мировой селекции.

Идентифицированы доминантные аллели генов устойчивости яблони к парше Vf и Vm у сортов и элитных форм яблони селекции ФГБНУ СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК. Усовершенствованный ДНК-маркер гена Vf позволяет расширить возможность применения мультиплексной ПЦР при идентификации данного гена устойчивости к парше в сочетании с другими генами хозяйственноценных признаков.

Информация об аллельном составе гена самонесовместимости позволит прогнозировать совместимость сортов при опылении, что даст возможность более эффективно формировать сортовые схемы садовых насаждений.

Методология и методы исследований При планировании и проведении исследований в виде источников информации использовались научные статьи, доклады, книги производственной тематики, электронные ресурсы и другие материалы. При проведении исследований применялся системный подход. Теоретико-методологическую основу исследований составили методы планирования и проведения опытов, лабораторные исследования с применением системного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование актуальности формирования ДНК-паспортов сортов яблони отечественной селекции с применением микросателлитного анализа.

2. Новые данные о степени генетического родства изученных сортов яблони.

3. Методические аспекты идентификации генов устойчивости к парше Vf и Vm. Выявление образцов, несущие доминантные аллели генов устойчивости к парше Vf и Vm, Обоснование данных об аллельных комбинациях гена 4.

самонесовместимости у изученных сортов яблони отечественной селекции и установление степени совместимости сортов согласно выявленному аллельному составу S-гена

5. Усовершенствование ДНК-маркера гена Vf устойчивости к парше, дополняющего методическую базу и позволяющего расширить область применения мультиплексной ПЦР в идентификации генов хозяйственно ценных признаков яблони.

Степень достоверности и апробация результатов исследований подтверждается значительным объёмом полученных экспериментальных данных, выполненных с применением с применением современных методов молекулярной генетики, стандартных методов математического анализа и положительными результатами апробации, проведённой в лабораторных условиях.

Результаты исследований доложены на ежегодных заседаниях Ученого совета ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии в 2009-2011 гг., III и IV Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2009-2010 гг.), Расширенном заседании Учёного совета по проблемам интенсивного садоводства посвященного 100-летию со дня рождения Гавриила Владимировича Трусевича (Краснодар, 2010 г.).

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 из них в изданиях из Перечня, рекомендованного ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 странице машинописного текста, включающих 12 таблиц и 26 рисунков.

Состоит из введения, трех глав, выводов, рекомендаций для практической селекции и двух приложений. Список использованной литературы включает 202 источника, в том числе 127 – зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает большую благодарность кандидату биологических наук Супруну Ивану Ивановичу за научное и методическое руководство, просмотр и редакцию рукописи, ценные замечания и предложения.

Автор благодарит Седова Е.Н. (доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАН), Ульяновскую Е.В. (доктор биологических наук), Артюх С.Н.

(кандидат сельскохозяйственных наук), Ефимову И.Л. (научный сотрудник лаборатории питомниководства) за предоставление селекционного растительного материала для проведения исследований и неоценимую помощь в обсуждении их результатов, а также Токмакова С.В. (кандидат биологических наук), Сундыреву М.А. (кандидат сельскохозяйственных наук) и Якубу Ю.Ф. (кандидат технических наук) за просмотр и обсуждение рукописи.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

Одно из ведущих мест среди плодовых культур в России, благодаря биологическим и хозяйственным качествам, принадлежит яблоне, занимающей более 60% всей площади садов. Центром происхождения яблони считается Восточная Азия. Дикорастущий предок окультуренных сортов яблони – это яблоня Сиверса (Malus sieversii), произрастающая в Средней Азии [Christopher M.R. et al., 2009].

Широкое распространение культуры яблони обусловлено большим потребительским спросом на ее диетические плоды, богатые витаминами, легко усвояемыми аминокислотами, сахарами, азотистыми и другими биологически активными веществами. Кроме того, плоды яблони ценятся за их профилактические и лечебные свойства, а также возможность использования их как в свежем, так и в переработанном виде круглый год [Куликов И.М. и др., 2006].

По Северо-Кавказскому региону в Госреестр РФ селекционных достижений, допущенных к использованию, на 2013 год включено 64 сорта яблони различных сроков созревания, из которых 67 % – сорта местной селекции, полученные в СКЗНИИСиВ (24 сорта), Крымской ОСС (6 сортов), Дагестанской СОС (7 сортов), Россошанской ЗОСС (4 сорта), ВНИИЦиСК (1 сорт), КубГАУ (1 сорт). В целом в настоящее время сортимент яблони расширен на 36 %, ввиду увеличения числа допущенных сортов с 47 до 64. В больше й степени расширен летний сортимент (на 80 %), в меньшей степени – осенний и зимний (на 14 и 30 % соответственно) [Артюх С.Н. и др., 2001; Егоров Е.А., 2013].

Анализ сложившегося сортимента яблони показывает, что несмотря на существенное обновление достаточно обширный сортовой состав яблони не отвечает полностью требованиям современного промышленного интенсивного садоводства, не обладает в полной мере необходимым сочетанием высокой адаптивности к абио- и биотическим стрессорам среды с показателями на максимально возможном уровне продуктивности и качества плодов [Артюх С.Н. и др., 1999].

С целью дальнейшего совершенствования сортимента яблони современные программы селекционных исследований включают такие задачи как разработка системы производства, переработки и хранения получаемой продукции с использованием высокопродуктивных сортов, оздоровленного посадочного материала и новой техники [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. В связи с этим возникает необходимость точного и быстрого выявления закономерностей наследования важнейших хозяйственно-ценных признаков яблони: устойчивости к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам, особенностей роста, структурных признаков урожайности, товарных и потребительских качеств плодов, а также экспрессивности идентифицированных генов и характера их взаимодействия [Ульяновская Е.В. и др., 2011].

Особую ценность приобретают исследования, направленные на оценку генетического разнообразия, паспортизацию и классификацию сортов, картирование и определение физической природы генов и генетического мониторинга в селекции и генетике яблони [Shulaev V. et al., 2008 ].

Вовлечение в селекционный процесс современных молекулярногенетических методов ДНК-маркирования необходимо для эффективной модернизации селекционного процесса и, соответственно, совершенствования отечественного сортимента яблони [Ульяновская Е.В. и др., 2011].

–  –  –

Одной из главных проблем современной селекции яблони считается создание сортов, обладающих наряду с комплексом ценных хозяйственнобиологических признаков устойчивостью к патогенам. Самым распространенным на юге России и вредоносным заболеванием яблони является парша [Ефимова И.Л. и др., 2010]. Снижение урожая яблок в нашей стране от поражения паршой составляет не менее 40 %, а в годы массового распространения теряется почти весь урожай [Седов Е.Н. и др., 1983].

Применение химических методов защиты в садах против этой болезни способствует постепенному возникновению резистентности патогенов к используемым препаратам. Возникает необходимость использования новых фунгицидов широкого спектра действия, что приводит не только к загрязнению окружающей среды, уничтожению полезной энтомофауны, но и возникновению угрозы здоровью людей [Смольякова В.М. и др., 2005].

Возделывание устойчивых к парше сортов яблони в комплексе с интегрированной защитой против других вредителей и болезней позволяет снизить затраты на фунгициды почти на 70 % и получать относительно чистую и безопасную для здоровья человека продукцию [Седов Е.Н., 1992].

Одним из первых селекцию иммунных к парше сортов яблони начал американский ученый L.F. Hough в сороковых годах двадцатого века. В штате Иллинойс была скрещена форма яблони M. Floribunda 821 (с геном Vf иммунитета к парше) с сортом Ром Бьюти. Среди полученных сеянцев было равное количество иммунных и восприимчивых к парше. Среди иммунных сеянцев было отобрано два, ставших исходным материалом для широкомасштабной селекционной программы (PRI), развернутой в США, Канаде, Франции и Великобритании [Седов Е.Н., 2007]. В настоящее время в мире создано более 155 сортов с моногенной устойчивостью к парше, которые почти не требуют применения фунгицидов [Савельев Н.И., 2008; Савельева Н.Н. и др., 2008].

В России селекция на олигогенную устойчивость к парше начата в начале 70-х годов на основе использования главных генов устойчивости Vf, Vm и Vr [Ищенко Л.А., 1987]. С 1975 г. во ВНИИСПК под руководством академика Е.Н.

Седова проводится работа по селекции сортов яблони, обладающих иммунитетом к парше, с использованием как метода раннего отбора на искусственных инфекционных фонах и приемов ускорения плодоношения гибридных сеянцев, так и новых методик селекции [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. Особый интерес представляет совмещение олигогенной и полигенной устойчивости к парше, а также двух и более главных генов устойчивости в одном генотипе яблони [Седов Е.Н. и др., 1987].

В настоящее время во ВНИИСПК и ФГБНУ СКЗНИИСиВ ведется совместная селекционная программа по созданию сортов яблони с более стабильной, долговременной устойчивостью яблони к парше с применением молекулярно-генетических методов ДНК-маркирования, позволяющих проводить исследования на высоком научно-методическом уровне [Супрун И.И. и др., 2009, 2011; Ульяновская Е.В. и др., 2011, 2012].

Постоянное наблюдение за многообразием форм и непрерывной изменчивостью возбудителя парши яблони является необходимым условием для продуктивной селекции устойчивых к данному заболеванию сортов яблони [Ефимова И.Л. и др., 2012].

Возбудитель парши яблони Venturia inaequalis (Cooke) G. Winter относится к классу Сумчатые грибы (Ascomycetes), подклассу Локулоаскомицеты (Loculoascomycetidae), порядку Дотидеальные (Dothideales), семейству Вентуриевые (Venturiaceae), роду Venturia [Барсукова О.Н., 1985].

С помощью стандартных сортов-дифференциаторов яблони выявлено 19 генных пар (локусов), контролирующих патогенность клонов гриба [Williams E.B. et al., 1969]. Каждая пара состоит из аллели вирулентности Р+ (Р1+, Р2+ и т. д.), вызывающий на том или ином сорте (или группе сортов) обильное спороношение гриба (реакция «поражение») и аллели авирулентности Р (Р1, Р2 и т.

Загрузка...
д.), вызывающей на том же сорте (сортах) хлоротические и некротические пятна без спороношения или с очень слабым спороношением патогенна (реакция «пятно»). Каждый клон (физиологическая раса, биотип) гриба отличается своим, только ему присущим набором аллелей вирулентности и авирулентности [Бондарь Л.В., 1981]. Частота встречаемости тех или иных генов вирулентности и определяет различия по вирулентности популяций и биотипов гриба [Седов Е.Н. и др., 1983].

В настоящее время известны восемь рас Venturia inaequalis, наиболее изучены первые пять. Самой распространенной расой, поражающей даже Malus silvestris и Malus floribunda, является раса 1. Устойчивостью к ней обладают некоторые мелкоплодные виды и сорта Сибири, Японии и Северо-Восточного Китая. Согласно исследованиям американских ученых [Barnes E.H. et al., 1961;

Kuc J. et al., 1959; MacLennan D.H. et al., 1963] расы 2-4, кроме специфичных для них генов вирулентности, обладают также генами вирулентности расы 1 по отношению к промышленным сортам яблони. Отличаются между собой популяции возбудителя парши в европейской и азиатской частях России по своей специализации и вирулентности [Гешеле Э.Э., 1958; Казенас Л.Д., 1953;

Матвеева В.К. и др., 1965; Сахарова Л.П., 1968; Хохрякова Т.М., 1978]. В начале 1990-х годов в Германии и Франции идентифицирована шестая раса парши, которая способна преодолевать устойчивость у сортов и форм яблони с геном Vf [Durel C.E. et al., 2003; Lespinasse V., 1994]. Выявление седьмой расы парши позволило идентифицировать ген Vg, контролирующий устойчивость к ней у сорта яблони Голден Делишес [Benaouf G. et al., 2000]. Восьмая раса парши была описана в 2005 г. V.G.M. Bus с соавторами [Bus V.G.M. et al., 2005].

Различают полигенную (относительную, частичную) устойчивость яблони к парше, степень которой может изменяться под влиянием условий внешней среды, и олигогенную или невосприимчивость (иммунитет).

Иммунитет определяется одним или несколькими главными генами и присущ некоторым мелкоплодным клонам диких видов, а также созданным на их основе полукультурным и культурным сортам [Ульяновская Е.В. и др., 2013].

При скрещивании двух форм, одна из которых имеет данный ген в отличие от другой, расщепление идет по типу анализирующего скрещивания, и отношение устойчивых сеянцев к восприимчивым составляет 1:1, следовательно, около 50 % полученного потомства является устойчивым [Седов Е.Н., 1992; Durel C.E. et al., 2004].

Выявление источников устойчивости обычно предшествует селекционной работе на улучшение этого признака. На начальном этапе изучения признака устойчивости к парше было идентифицировано шесть основных генов, обуславливающих ммунитет яблони к парше: Vf, Vm, Vb, Vbj, Vr, Va [Козловская З.А. и др., 2005].

В дальнейшем, с применением методов молекулярного ДНКмаркирования, идентифицировали еще ряд генов, кроме указанных: Vd (источник гена – сорт Durello di Forli); Vh2, Vh4 – источник гена образец R-12740-7A, относящийся к виду Malus pimula; Vh8 – источник гена образец W193B, относящийся к виду M. silvestris [Lespinasse V., 1994].

Сорта с геном Vf иммунитета к парше имеют сложное генетическое происхождение. Большинство сортов с геном Vf было получено на основе двух потомков F2 от M. floribunda 821: 26829-2-2 и 26830-2. В свою очередь, эти сеянцы выделены в потомстве от скрещивания двух сибсов: 9433-2-2 (Ром Бьюти M. floribunda 821) 9433-2-8 (Ром Бьюти M. floribunda 821) [Ульяновская Е.В. и др., 2013]. К настоящему времени от клона M. floribunda 821 отечественными и зарубежными селекционерами получено более 155 сортов яблони с олигогенной устойчивостью к парше, причем доля тех, у которых устойчивость контролируется геном Vf, превышает 85 % [Савельев Н.И., 1998]. Согласно недавним исследованиям у клона M. floribunda 821, кроме гена Vf, имеется второй независимый доминантный ген Vfh, который индуцирует гиперчувствительную реакцию [Benaouf G. et al., 2000]. Это согласуется с данными, которые свидетельствуют, что устойчивость к парше у M. floribunda 821определяется не одним геном Vf, как считалось ранее, а имеет более сложную природу. Следовательно, представление, что устойчивость, контролируемая геном Vf, будет стабильной, нуждается в переоценке [Жданов В.В. и др., 1995].

В зарубежных селекционных программах для гибридизации широко использовались сорта, несушие ген Vf, это: Прима, Присцилла, Флорина, Фридом, в несколько меньшей степени – Редфри, CO-OP 17, Либерти, Голдраш, Интерпрайс, BM 41497 [Laurens F., 1999]. Сорта Муррей и Раувилл получены на основе доноров с геном Vm, Нова Эсигро, Новамак, Новаспай несут ген Vr [Ульяновская Е.В. и др., 2013].

В качестве донора гена Va часто используют формы сорта Антоновка и производные от них сеянцы, в потомстве которых выход высокоустойчивых к парше сеянцев составляет около 11 % [Браун А.Д., 1981; Williams E.B. et al., 1969]. Из восприимчивых родителей привлекают для скрещиваний сорта с высоким качеством плодов и другими хозяйственно-ценными признаками. В Институте садоводства и селекции в городе Дрезден-Пильнице (Германия) от скрещивания сортов Jongrimes и Антоновка выведен сорт Reglindis с генетической устойчивостью к парше. В потомствах от гибридизации сортов яблони домашней и доноров с геном Vr (производные M. pumila) получены сорта Realka, Releta, Remura и Reka [Fischer C., 2000].

Большой проблемой в селекции яблони на устойчивость к парше является стабильность и долговременность этого признака [Браун А.Д., 1981; Седов Е.Н.

и др., 1985; Daeton D. et al., 1983; Williams E.B. et al., 1969]. От степени устойчивости родителей зависит поражаемость потомства. Хотя подбор родителей по фенотипу устойчивости и имеет значение, большое влияние на разнообразие потомства оказывают условия внешней среды, поэтому подбор родителей по фенотипу должен быть дополнен оценкой родителей по потомству [Жданов В.В. и др., 1991].

Сорта яблони могут терять устойчивость к парше, в результате чего учащаются случаи массового заболевания паршой. Причины потери устойчивости сортов могут быть различны, но первостепенное значение имеет изменчивость патогена и условий внешней среды, а также самого хозяина [Gessler C. et al., 2006]. Многие относительно устойчивые культурные сорта яблони становятся восприимчивыми при интродукции их в другую зону, где имеются вирулентные для них клоны гриба. Чаще поражаются паршой сорта с ослабленными под влиянием стрессовых факторов внешней среды защитными реакциями [Седов Е.Н. и др., 1982]. Редко встречающиеся или новые расы патогена обычно не приносят большого ущерба до тех пор, пока сорт не занимает больших ареалов. Но по мере роста площадей под сортом происходит постепенное их накопление и широкое распространение [Савельев Н.И., 2002].

Рекомендуется два основных пути создания сортов с более стабильным долговременным иммунитетом: 1) совмещение олигогенной (вертикальной) и полигенной (горизонтальной) устойчивости; 2) комбинирование главных генов устойчивости. Закладка садов сортами с различными типами устойчивости также будет способствовать снижению риска поражения паршой (на 60-80%) [Браун А.Д., 1981; Жданов В.В. и др., 1991; Daeton D. et al., 1983].

На современном этапе развития селекционных технологий, благодаря успехам молекулярной биологии, развитию методов молекулярного ДНКмаркирования и накоплению экспериментальных данных в области молекулярно-генетических исследований, появилась технология так называемой маркерной селекции (marker assisted selection – MAS). Данная технология позволяет проводить идентификацию и отбор генотипов, несущих целевые гены, минуя фенотипическую оценку, основываясь лишь на данных ДНК-анализа [Ульяновская Е.В. и др., 2012]. Таким образом, наиболее перспективным и экономически оправданным подходом в селекционной работе по созданию устойчивых к парше сортов яблони является сочетание как оригинальных и усовершенствованных традиционных методов оценки селекционного материала, так и современных молекулярно-генетических методов [Ульяновская Е.В. и др., 2011].

–  –  –

Развитие методов ДНК-маркирования привело к появлению технологии маркерной селекции, позволяющей проводить идентификацию и отбор генотипов, минуя фенотипическую оценку, основываясь лишь на данных ДНКанализа, в отличие от классических селекционных экспериментов, работающих в основном с морфологическими проявлениями генов [Конарев В.Г., 1983].

Молекулярной маркер – это ген известной локализации, с помощью которого можно идентифицировать другие искомые гены [Конарев В.Г., 1983].

Перед тем, как маркер может быть использован для решения каких-либо конкретных задач, корректность его применения должна быть аргументирована с генетической и биохимической позиции [Созинов А.А., 1985].

Маркеры генетических систем разного уровня должны обладать определенными свойствами и отвечать следующим требованиям: высокий уровень полиморфизма, кодоминантный характер наследования, оптимальный уровень частоты встречаемости в геноме для решения конкретных задач, равномерное распределение в геноме по хромосомам, селективно нейтральное поведение; легкая оценка параметров маркера, возможность автоматизации оценки параметров маркера, высокая воспроизводимость оценки параметров маркера; возможность легкого обмена данными между лабораториями [Льюин Б., 1987].

За последние 30 лет были созданы и использовались несколько поколений молекулярных маркеров. Изначально, с развитием и совершенствованием электрофоретических методов, основанных на фракционировании макромолекул, различающихся по таким параметрам как размеры (или молекулярная масса), вторичная структура и электрический заряд, широко использовались белковые маркеры – запасные белки семян и изоферменты, отражающие полиморфизм соответствующих структурных генов [Bolar J.P. et al., 2000; Schulman A.H., 2007]. С применением белковых маркеров можно исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов, причем их уровень полиморфизма слишком низкий в популяциях большинства культурных растений, домашних животных, птиц [McCouch S.R. et al., 1997]. Такие маркеры могут изменяться под воздействием окружающей среды, а в случае с изоферментными маркерами обладать тканевой или органной специфичностью, что существенно снижает их ценность для генетики и селекции [Mohan M. et al., 1997].

В дальнейшем, прогресс молекулярной генетики способствовал возникновению маркеров, принадлежащих к наиболее эффективной на сегодняшний день ДНК-маркерной системе, основанной на анализе полиморфизма нуклеотидной последовательности ДНК и позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генома [Остерман Л.А., 1981]. С помощью ДНК-маркеров можно исследовать практически любые участки геномов и генов, а также использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма, что значительно повышает эффективность селекционного процесса [Гостимский С.А. и др., 1999]. Появление молекулярных ДНК-маркеров открывало большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации и клонирования генов, а также изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне [Avise J.C., 1994].

ДНК-маркерные технологии условно можно разделить на две основные группы: с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и без нее.

Открытие и синтез специфичных бактериальных ферментов – рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз), расщепляющих ДНК только в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (англ. RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism). Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле, длина и концентрация геля зависит от диапазона длин распределяемых фрагментов [Льюин Б., 1987].

Впервые полиморфизм длин рестрикционных фрагментов был использован в 1974 г. при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса [Grodzicker T. et al., 1974]. Однако широкое применение RFLPмаркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы D.С.

Вotstein с соавторами [Вotstein D. et al., 1980]. В основном такие маркеры используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). После электрофоретического разделения продуктов рестрикции их «проявляют»

путем гибридизации со специфическими радиоактивными зондамифрагментами ДНК и анализируют по положению на радиоавтографах с определением длин рестрикционных фрагментов [Чан В-Т. В., 1999]. В качестве зондов могут служить случайные продукты рестрикции геномной ДНК, однако чаще всего используют специально отобранные клоны уникальных и редко повторяющихся последовательностей ДНК, применяемых для составления молекулярных карт геномов и физического картирования генов [Kurata N. et al., 1997; Saji S. et al., 2001].

С использованием RFLP-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственнополезными признаками [Tanksley S.D. et al., 1996]. Высокий консерватизм RFLP-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов [Avise J.C., 1994].

После открытия в 1983 г. метода ПЦР, позволяющего быстро получить более 10 миллионов копий целевой последовательности ДНК в ходе проведения реакции, появился новый тип молекулярных маркеров [Шибата Д.К., 1999].

В сравнении с RFLP-анализом, методы, основанные на ПЦР-технологии, требует выделения значительно меньшего количества ДНК из растительной ткани, однако ДНК должна быть чистой от ДНК грибов и бактерий. При ПЦРанализе отпадает нужда в поддержании библиотеки клонов для гибридизационных зондов и работа с радиоактивными изотопами [Хавкин Э.Е., 1997]. Для того чтобы осуществить этот процесс in vitro, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые присоединяются к комплементарному им фрагменту ДНК, образуя таким образом двунитиевый стартовый участок, и служат в качестве затравки для синтеза выбранного маркерного участка ДНК. Помимо праймеров основными компонентами ПЦР являются: фермент Taq-ДНК-полимераза, осуществляющая воспроизведение специфического участка, расположенного между 5` концами праймеров; 4 типа Mg2+ дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); копируемая ДНК; ионы [Янковский Н.К., 1996].

В зависимости от природы праймеров и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов ДНК-маркерного анализа и соответствующих типов ДНК-маркеров.

Первым появился метод случайно выбранных последовательностей ДНК в котором используют (randomly amplified polymorphic DNA-RAPD), стандартные наборы праймеров, как правило, длиной 10-14 нуклеотидов и который основан на анализе случайно амплифицированной полиморфной ДНК.

При выполнении данного вида анализа полиморфизм определяется как присутствие – отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК и обусловлен различиями последовательностей ДНК в местах посадки праймеров [Гучетль С.З. и др., 2008; Сиволап Ю.М. и др., 1997;

Суворова Г.Н. и др., 1999].

Главным ограничением в применении RAPD-маркеров является их доминантность, из-за которой невозможно отличить гетерозиготное состояние от гомозиготного, что приводит к утрате информации, необходимой, например, в популяционной генетике для оценки частот аллелей, а также низкая воспроизводимость результатов, обусловленная повышенной чувствительностью к условиям реакции [Гостимский С.А. и др., 1999].

Для того чтобы исключить перечисленные недостатки RAPD-маркеров был предложен метод, занимающий промежуточное положение между RFLP- и ПЦР-анализом – AFLP-технология (amplified fragment length polymorphism), не требующая ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК [Гучетль С.З. и др., 2008; Хавкин Э.Е., 1997]. AFLP-маркерная система требует большего количества ДНК (1 мкг на реакцию), однако определение последовательности выделенных таким образом фрагментов дает много новой информации о природе генов и организации их непосредственного окружения [Castiglioni P. et al., 1998; Dudley J.W., 1993; Vos P. et al., 1995]. Главным недостатком AFLP-маркеров является их доминантность [Jansen R.C. et al., 2001].

Метод SSAP – (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism) явился модификацией метода AFLP, для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставке в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Данный метод нашел широкое применение в исследованиях генетического разнообразия культурных растений [Waugh R. et al., 1997].

C открытием микросателлитных последовательностей (SSR – simple sequence repeat), распространенных повсеместно в ДНК высших растений, были созданы более универсальные типы молекулярных маркеров. Среди микросателлитных последовательностей в геноме ядра многих растений преобладают ди-, три- и тетрануклеотидные повторы [Diwan N. et al, 1997;

Diwan N. et al., 1994]. Источник полиморфизма этих последовательностей – в сайт-специфическом варьировании длины повтора, что в свою очередь обусловлено различием в числе единиц повтора [Schlotterer C. et al., 1997].

Одними из первых маркеров, для создания которых использовали праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов были ISSR-маркеры [Morgante M. et al., 1993]. На основе применения ISSR праймера и праймера, комплементарного фрагменту LTR ретротранспозона, построен принцип работы REMAP (Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism) ДНК-маркеров – мультилокусной ДНКмаркерной системы, эффективно используемой в филогенетических исследованиях и изучении генетического разнообразия культурных растений [Kalendar R. et al., 1999, 2006].

Наиболее информативные системы молекулярного ДНК-маркирования сельскохозяйственных культур – это микросателлитные последовательности ДНК, которые могут состоять из 4, 3, 2 и даже одного нуклеотида (SSR). Они также относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п. н.) [Litt M. et al., 1989].

Для создания SSR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. SSRмаркеры стабильны в соматических клетках, их наследование носит кодоминантный характер [Weber J.L., 1990], распределение по всему геному облегчает использование этих маркеров для молекулярного картирования генома, идентификации генотипа и паспортизации сортов, скрининга крупных инсерционных библиотек, делая SSR в настоящее время одной из самых востребованных маркерных систем для осуществлении маркерной селекции у яблони [Thomas M.R. et al., 1993].

В последнее время широкое распространение в исследованиях, направленных на идентификацию генов, детерминирующих хозяйственноценные признаки, а также в изучении геномного полиморфизма, выяснения филогенетических аспектов культурных растений, в том числе яблони, получил тип ДНК-маркеров, основанных на единичных нуклеотидных заменах – SNP (single nucleotide polymorphism). Во многом это обусловлено значительно высокой частотой встречаемости SNP-сайтов в геноме. Этот метод получил более широкое распространение с развитием методов секвенирования геномов, и появлением технологии полногеномного секвенирования (Next Generation Sequences – NGS) [Ignazio V. et al., 2012; Laima A. et al., 2012; Satish K. et al., 2013; Velasco R. et al., 2010].

–  –  –

Маркер-вспомогательная селекция, предполагающая использование ДНКмаркеров для идентификации целевых генов, является в настоящее время одной из наиболее востребованных технологий при работе с генами тех признаков, фенотипическая оценка которых затруднительна. В эту категорию можно отнести устойчивость к биотическим стрессовым факторам, из которых для яблони особенно вредоносным является грибной патоген Venturia inaequalis – возбудитель заболевания парша [Седов Е.Н., 1992]. Важнейшее преимущество маркерной селекции – это возможность упразднения сложного и трудоемкого этапа фитопатологического тестирования, которое особенно усложняется при необходимости контроля наличия в селекционном материале более чем одного гена устойчивости [Супрун И.И. и др., 2012]. Наличие искомого гена определяется напрямую в генетическом материале по результатам ПЦР, причем проводить оценку можно практически на всех этапах вегетационного развития растения [Tanksley S.D., 1983]. Для успешного выполнения подобных исследований необходимо наличие ДНК-маркеров к искомым генам. С использованием ДНК-маркеров на генетической карте яблони картировано большинство известных генов устойчивости [Baldi P. et al., 2004].

Главными генами устойчивости яблони к парше считаются гены Vf, Vr,

Vb, Va, Vm, Vbj, для подавляющего большинства опубликованы ДНК-маркеры:

Vf [Vinatzer B.A. et al., 2004]; Vr [Hemmat M. et al., 2002]; Vb и Va [Hemmat M.

et al., 2003], Vm [Cheng F.S. et al., 1998]. Два других гена устойчивости: Vx и Vr2 и молекулярные маркеры к ним были открыты сравнительно недавно [Hemmat M. et al., 2002; Patocchi A. et al., 2004]. Для большинства генов устойчивости идентифицированы сонаследуемые ДНК-маркеры. С точки зрения молекулярной генетики ген Vf является наиболее изученным на сегодняшний день [Afunian M.R. et al., 2004; Patocchi A. et al., 2004; Suprun I. et al., 2012].

Ген Vf выделен из M. floribunda 821, Vm из Malus micromalus 245–38 или Malus atrosanguinea 804, Vr, Vh2 и Vh4 (также называемый Vx или Vr1) из M.

pumila R12740-7A; Vbj из Malus baccata jackii; Vb из Hansen’s baccata №2; Va из PI172623; Vg из Голден Делишес; Vr2 из GMAL 2473 и Vd из Durello di Forli [Boudichevskaia A. et al., 2004; Bus V.G.M et al., 2005; Hemmat M. et al., 2002;

Patocchi A. et al., 2004; Tartarini S. et al., 2004; Williams E.B. et al., 1969]. Все эти гены функционально различны.

Наиболее широко в селекционных программах США, Канады, Западной и Восточной Европы используется ген Vf, расположенный на первой хромосоме и обладающий наиболее широким спектром устойчивости к патогену V. inaequalis. Для данного гена установлена нуклеотидная последовательность, и идентифицирован сонаследуемый SCAR ДНК-маркер [Afunian M.R. et al., 2004; Patocchi A. et al., 2004].

Многие гены устойчивости представляют собой кластеры из нескольких генов в пределах определенного участка хромосомы – консервативные функциональные домены. Информация, полученная в ходе изучения Vf-гена при помощи различных ДНК-маркеров, позволила в дальнейшем выполнить тонкое картирование области локализации данного гена и идентифицировать кластер из четырех элементов в Vf-локусе: Vfa1, Vfa2, Vfa3, Vfa4. Нуклеотидная последовательность была расшифрована для каждого элемента кластера. В дальнейшем было выявлено, что устойчивость к патогену V. inaequalis обуславливает Vfa4, имеющий наибольшее количество гипервариабельных участков [MacHardy W.E., 1996]. Различия в экспрессии этих четырех генов наблюдаются в процессе развития листа. Vf1, Vf2 и Vf3 были активны в молодых листьях и незначительно экспрессировались в зрелых листьях, в то время как Vf4 был активен в молодых и хорошо экспрессировался в зрелых листьях [Xu M. et al., 2006]. В Vf-локусе, помимо генов резистентности, идентифицирован также ряд экспрессирующихся последовательностей (EST), роль которых в обеспечении иммунитета к парше еще не изучена, но есть предположение, что они могут влиять на транскрипцию и трансляцию Vf-генов, а также на их активность в процессе развития листа [Gianfranceschi L. et al., 1996; Vinatzer B.A. et al., 2001].

Ген устойчивости яблони к парше Vm, интрогрессирован из форм яблони, принадлежащих к видам Malus atrosanguinea 804 (гены Vm и Vf) и M. micromalus (ген Vm). Наиболее известная работа по молекулярногенетическому картированию гена Vm была выполнена A. Patocchi с соавторами (2005 г.). В результате выполненных исследований была окончательно определена позиция этого гена на хромосоме 17 и идентифицирован ДНКмаркер, сонаследуемый с геном, а также определен ряд SSR-локусов, тесно сцепленных с ним [Patocchi A. et al., 2005].

Ген устойчивости к парше Vb редко используется в селекционных программах, он был идентифицирован и впервые картирован G. Bеnaouf с соавторами в1997-2000 гг. [Benaouf G. et al., 2000].

В 1976 году H.S. Aldwinckle с соавторами связали название «Vr» с геном устойчивости к парше, обусловливающим специфические расходящиеся лучами в виде звезды некротические реакции на патоген, обозначив его Vr-A, чтобы отличить от Vr-DW [Aldwinckle H.S. et al., 1976].

А. Boudichevskaia с соавторами, установила, что Vh2 идентичен Vr, а Vh4 идентичен Vx и Vr1 и расположены на противоположных участках второй группы сцепления на генетической карте яблони [Boudichevskaia A. et al., 2006].

Идентифицирован расоспецифичекий ген Vh8, источником которого является M. sieversii. Данный ген обуславливает устойчивость к восьмой расе парши.

Vh8, как Vh2-ген, относится ко второй группе сцепления, причем расположены эти гены рядом и, возможно, являются разными локусами одного гена устойчивости [Bus V.G.M. et al., 2005; Hemmat M. et al., 2002].

Для исследования генплазмы яблони можно применять как SCARмаркеры, так микросателлитные ДНК-маркеры. Так, при изучении сеянцев R12740-7A яблони российской селекции A. Boudichevskaia с соавторами обнаружили ген устойчивости, названный Vr1 [Boudichevskaia A. et al., 2004].

В 2009 г. J.M. Soriano с соавторами описали ген устойчивости Vd3 к высоковирулентной седьмой расе парши, донором которого является нидерландская селекционная форма яблони “1980-015-25”, также несущая ген Vf [Soriano J.M. et al., 2009].

Взаимодействие между генами устойчивости яблони к парше и антигеном возбудителя V. Inaequalis для удобства рассматривают как модель «рецепторлиганд» [Bus V.G.M. et al., 2005]. Согласно такой модели реакция гиперчувствительности является результатом взаимодействия антигена V. Inaequalis с сигнальными рецепторами яблони и как следствие вызывает локальную гибель пораженных клеток эпидермиса листьев [Goodman R.N. et al., 1994].

Согласно современной номенклатуре, предложенной V.G.M. Bus с соавторами, гены устойчивости яблони к парше называют Rvik (буква R означает резистентность, vi - V. Inaequalis, k – относится к источнику данного гена) [Gopaljee J. et al., 2009]. В таблице 1 указаны изученные на сегодняшний день гены устойчивости яблони к парше [Gopaljee J. et al., 2009; Gygax M. et al., 2004; Hemmat M. et al., 2003; Matsumoto S. et al., 2000; Patocchi A. et al., 2004;

Patocchi A. et al., 2005; Tartarini S. et al., 2004]. К этим генам существуют различные ДНК-маркеры [Bus V.G.M. et al., 2005; Cheng F.S. et al., 1998; Gygax M. et al., 2004; Hemmat M. et al., 2002; Matsumoto S. et al., 2000; Patocchi A. et al., 2004; Vinatzer B.A. et al., 2004]. Таблица 1 цитируется по источнику [Gopaljee J.

et al., 2009].

–  –  –

Определение позиций генов устойчивости к парше на генетической карте яблони и идентификация ДНК-маркеров данных генов необходимо для выполнения программ по маркер-вспомогательной селекции, в том числе пирамидирования, т.е. объединение двух и более генов устойчивости в одном сорте [MacHardy W.E. et al., 2001]. Для этого необходимо иметь в распоряжении соответствующие ДНК-маркеры искомых генов [Suprun I. et al., 2012]. Большинство генов устойчивости представляет собой комплексные генетические семейства, сгруппированные внутри отдельных хромосомных областей [MacHardy W.E. et al., 2001].

Идентифицированы гены, отвечающие за непрямой (опосредованный) ответ на инфекцию V. Inaequalis у яблони. Они участвуют в клеточной детоксикации молодых листьев. Изучение экспрессии данных генов необходимо для понимания иммунного ответа яблони [Cao H. et al., 1997; Gau A.E. et al., 2004].

Наряду с изучением генетических основ и идентификацией генов устойчивости в геноме вида Malus domestica, в последнее время активно используют технологию генетической трансформации для получения устойчивых к данному заболеванию форм [Bolar J.P. et al., 2000, 2001].

Пуроиндолин Б (PinB), богатый цистеином противогрибковый протеин пшеницы, может подавлять рост V. Inaequalis. Сочетание генов антигрибковых протеинов вместе с генами устойчивости и иммунного ответа может стать хорошей стратегией генетической трансформации в увеличении долговременности и эффективности устойчивости яблони к парше [Cao H. et al., 1997; Faize M. et al., 2003, 2004; Malnoy M. et al., 2007].



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
Похожие работы:

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Доронин Максим Игоревич ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Мудрак Наталья Станиславовна Владимир 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя инфекционного...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»









 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.